HPLC-MS/MSによるヌクレオシド/ヌクレオチド含有量測定のための植物サンプル調製

ヌクレオシドとヌクレオチドは、すべての生物の中心的な代謝成分です。それらの代謝は細胞の発達に必要です。このアプローチは、これらの代謝産物の定量化のための強力なツールを提供します。

この方法は、植物のヌクレオシドおよびヌクレオチドの迅速かつ正確な定量を可能にする。完全なサンプル前処理とLC-MS/MS分析は、10〜20サンプルのセットに約2日かかります。この方法は、すべての植物および他の生物にも適用することができる。

この手順のデモンストレーションは、陳研究室のチャンフア・ジュー准教授です。植物を育てるには、シロイヌナズナの種子を10分間エタノールで殺菌し、1/2の強度の村重とスクーグの栄養素を含む寒天プレートに播種することを確認してください。48時間摂氏4度で暗闇の中でプレートをインキュベートし、摂氏22度で16時間光、摂氏20度で8時間暗い下の制御された成長室に移します。

2週間の苗の100ミリグラムを収穫し、代謝物抽出のために液体窒素でそれらを凍結します。冷却済みのミキサーミルで7~8個のスチールビーズを使用して、冷凍植物組織の100ミリグラムを60ヘルツの頻度で5分間粉砕します。メタノール、アセトニトリル、水を含む抽出液を2対2対1の比率で調製します。

均質化した材料を1ミリリットルの抽出液で再懸濁する。得られた溶液を摂氏4度で15分間15分間12,000 XGで遠心分離し、懸濁液の0.5ミリリットルを新しい1.5ミリリットルチューブに移し、液体窒素で凍結します。凍結したサンプルを凍結乾燥機で蒸発させ、0.5ミリリットルの5%アセトニトリルと95%水で再懸濁します。

得られた溶液を摂氏4度で10分間4,000 XGで遠心分離する。上清をバイアルにロードしてLC-MS/MS測定を行います。酢酸アンモニウム10ミリモルを2リットルの二重脱イオン水に溶解して、酢酸アンモニウムバッファーを調製します。

10%アンモニウムと酢酸でpHを9.5に調整してください。ヌクレオシド測定用に2リットルの超純粋な100%メタノールを調製し、次いでヌクレオチド測定用に2リットルの超純粋アセトニトリルを調製する。前に調製した各サンプルの前処理された代謝物抽出の0.02ミリリットルを、3倍の質量分析計と結合したバイナリポンプを備えたHPLCシステムに注入します。

標準のキャリブレーション曲線を生成するには、6つのサンプル抽出を一緒にプールし、混合物を渦に入れ、それを再び6回抽出して各背景を得る。これらの6つの抽出にそれぞれ6つの異なる濃度の各標準を加え、それらをHPLCシステムに1つずつ注入します。質量遷移を介して異なる濃度で各標準のピーク領域を記録します。

このプロトコルは、2週間前のシロイヌナズナの野生型苗のN1-メチルデノシン(既知の修飾ヌクレオシド)を同定し、定量化するために使用された。質量分析プロファイルは、N1-メチルアデノシン標準から生成された生成イオンが150および133MZ比であることを示した。そして、同じプロファイルは、コロンビアのゼロ抽出で観察されました.

150MZの生成イオンの豊富さにより、N1-メチルアデノシン同定のために282.1から150の質量転移が選択された。目標ピークの保持時間は7.05分であった。N1-メチルデノシン標準の保持時間と同じ.

濃度シリーズのN1-メチルアデノシン標準は、6つのサンプル抽出に追加されました.標準サンプルをLC-MS/MSに注入し、N1-メチルアデノシンのピーク領域の増加を公称濃度に対してプロットした。6つの等しい背景抽出は、定量化のために正確で再現可能な較正曲線を作る上で重要です。

我々の方法は、植物の代謝経路を探索するために適用することができる。野生型と機能喪失変異体の代謝産物プロファイルを比較することで、代謝フラックスを引き出すことができた。