Name: 卵母細胞ガラス化による不妊治療の保存:臨床および検査の視点 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶ卵母細胞ガラス化と加温手順による不妊治療の保存法。臨床と検査の観点から、凍結保護剤の曝露時間などプロトコルの重要ポイントを習得し、一貫した臨床結果を最大化する方法を解説します。

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1. ワークアップと臨床カウンセリング
注:腫瘍学的な理由で不妊治療を必要とする患者の場合は、スケジューリング相談の待機リストがないことを確認し、できるだけ早く予約を行ってください。
<ol><li>病歴と以前の書類を調べ、患者の一般的な健康状態を評価します。</li>
	<li>すべての情報(がん患者の場合に卵巣刺激を受ける腫瘍学者の承認を含む)をリレーショナルデータベースに記録します。</li>
	<li>患者に、処置の実現可能性に関する特定のカウンセリングを提供する。手順のステップ(卵巣刺激、卵母細胞の検索、卵母細胞のガラス化)を説明し、現実的な成功の可能性(主に母細胞の年齢と卵母細胞の検索時のMII卵母細胞の期待数に依存する)、ならびに手順のコストと限界について彼女に知らせる。</li>
	<li>経膣超音波検査を行い、卵巣予備軍(すなわち、AFC)に関する情報を得て、卵子採取のための卵巣のアクセシビリティを評価する。</li>
	<li>血液群および血球体因子、凝固スクリーニング(血球数、プロトロンビン、トロンボプラスチン、フィブリノーゲン、プロテインC、プロテインS、抗トロンビンIII、ホモシステイン)および感染症(B型肝炎、C型肝炎、HIV、静脈内疾患研究研究所/トレポネマ・パラダム・ヘマググルチネーション)を評価するための血液検査を要求する。 注:緊急でない医学的理由で不妊治療プログラムにアクセスする患者の場合、より包括的な評価には、基底卵胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、エストラジオール、AMH、乳房検査、パパニコラウ検査、凝固の遺伝子スクリーニング(ライデンおよびプロトロンビンの第V因子)、およびTORCHスクリーニング(トキソプラスイシスモス、ルメガロ)が含まれる可能性があります。</li>
	<li>心学的評価(心電図)を要求する。</li>
	<li>心理カウンセリングを勧めます。</li>
</ol>2. 不妊治療の保存のための制御された卵巣刺激プロトコル
注:がん治療を開始するまでの時間が限られている場合、ランダム開始プロトコル(すなわち、月経周期中にいつでも卵巣刺激を開始する)は、不妊治療の候補である腫瘍学的患者の卵巣刺激に推奨される。緊急でない医療上の理由や社会的理由による不妊治療プログラムでは、早期濾胞期から始まる従来の刺激が好ましく、月経周期に基づいて卵巣刺激が開始される。制御された卵巣刺激(COS)アプローチは、最近の欧州生殖発生学会(ESHRE)ガイドライン24に従って行われるべきである。

<ol><li>患者の特性と卵巣予備マーカー、主に母体年齢、FSH、AMH、およびAFCに応じてCOSを調整します。</li>
	<li>150-300 IU/日の固定用量(アンタゴニストプロトコル)の固定用量で組換えまたは尿FSHを使用して月経周期の5日目にCOSを開始します。 注:LH欠乏または不十分な最適でない応答を有する特定の患者集団において、追加のLH 75/150 IU/日は卵巣応答、LHレベル、および婦人科医の判断に従って投与され得る。</li>
	<li>エストロゲン感受性疾患の患者には、アロマターゼ阻害剤(レトロゾール)に関連するゴナドトロピンが1日目から卵母細胞の検索後7日目まで含まれる。</li>
	<li>4日間、性腺刺激ホルモンの固定用量を投与する。</li>
	<li>5日目に卵胞の成長を監視し、2〜3日ごとに;最終的に, ゴナドトロピンの投与量を調整します。.</li>
	<li>少なくとも3つの卵胞が直径17〜18mmに達したら、0.5 mLの用量でGnRHアゴニストの単一の皮下ボーラスで最終的な卵母細胞成熟のトリガーを投与する。</li>
</ol>3. 卵母細胞の検索
<ol><li>卵母細胞検索の準備<ol>
<li>必要な材料については、 材料表を参照し、準備の実験室の履物や衣装、外科用フェイスマスク、ヘアカバー、外科用手袋、永久非毒性マーカー、ピンセット、無菌小さなガーゼ、使い捨てまたは再利用可能な分光器、膣外科装置および表面消毒剤を保管してください。蘇生装置、逆転用麻酔薬、アナフィラキシーショックの治療用に用意されたキット、および手術室の酸素の入手可能性を確保します。</li>
		<li>補助再生技術(ART)25における超音波に関するESHREワーキンググループの勧告に従って卵母細胞検索手順を実行する。<ol>
<li>セデレーションまたは全身麻酔、および予防のための抗生物質を投与する。 注:このプロトコルでは、深い沈下はプロポフォール(患者の体重に応じて投与量が調整される)とフェンタニルの50〜100 μg、パラセタモールの1000mg、および酸素による補助マスク換気を管理することによって達成された。</li>
			<li>真空ポンプ、17G単本管針に接続された回収管、および卵母細胞収集チューブで構成された吸引ユニットを使用して卵母細胞の検索を行います。収集中は、cumulus細胞の剥がれや透明帯の破砕などの卵母細胞への損傷のリスクを避けるために、〜120mmHgの圧力を超えないでください。</li>
			<li>作業面温度を校正し、培養培地で37°Cを確保します。全体の手順の間に、彼らの発達能力に影響を与える可能性のある過渡温度への卵母細胞暴露を最小限に抑えます。</li>
			<li>卵母細胞の検索の終わりに、退院前に患者を3〜4時間観察する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>オペレーションシアター<ol>
<li>手術室に入る前に、患者を特定し、排卵のトリガーの時間を確認します。</li>
		<li>患者に婦人科の位置で手術台の上に横たわらずれさせよ。</li>
		<li>卵母細胞の検索前に膣/子宮頸部を浄化し、細菌汚染を最小限に抑えます。</li>
		<li>卵巣の位置と様々な器官および血管との解剖学的関係を評価するために予備経膣超音波を行う。</li>
		<li>超音波指導の下で、膣壁を通って卵巣卵胞に単一の内腔針を挿入し、膣壁と卵巣の間に位置する器官または血管を傷つないように注意する。</li>
		<li>最も近い卵胞から吸引を開始し、最も遠位のものに移動します。</li>
		<li>直径11〜12mmより大きい直径のすべての卵胞を穿刺し、針の「ねじれた動き」を行い、濾胞液全体を吸引し、手術室のブロックヒーターで予熱した無菌チューブ(丸底14mL)に放出される。</li>
		<li>検索直後に、患者の身元の詳細をチューブに密封してラベルを付けます。</li>
		<li>看護師が実験室にチューブを持って来ることを確認し、そこですぐに積雲卵母細胞複合体(COC)の存在をスクリーニングします。</li>
		<li>発生学者に、取得したCOCの総数を臨床医に知らせる。</li>
		<li>最初の卵巣の手順が完了したら、きれいな媒体で針を洗い流し、同じ手順を使用して第2の卵巣を進める。</li>
		<li>卵母細胞の検索後、ダグラスのパウチの卵巣または血管の血管および自由流体からの出血を評価する。 注: 臨床レベルでのテデおよび胚のトレーサビリティの有効性を自動化および改善するために、電子ミラーリング監視システム(EWS)がセンター26に実装されました。それにもかかわらず、このプロトコルは、任意のIVFの実験室でプロトコルの再現性を確保するために、EWSについては言及していない。それでも、手順のすべてのステップは、テゲテと胚のトレーサビリティを確保するために第二のオペレータ(すなわち証人)を必要とすることを考慮してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. IVF研究室
<ol><li>卵母細胞の検索手順の前日<ol>
<li>卵母細胞収集チューブを準備します( 材料表を参照)。<ol>
<li>胚培養用の卵母細胞採取管(丸底、5 mL)に1mLのIVF培地( 材料表参照)を塗布し、0.2mLの鉱油( 材料表参照)で覆う。 注: チューブの数は、取得する予定の卵胞の数に従って定義されます。各チューブには最大 4 つの COC が含まれる場合があります。</li>
		</ol>
</li>
		<li>キャップ(最初のスナップ)でチューブを密封します。培地の種類と準備日の詳細をチューブにラベル付けします。制御された雰囲気の中で37°Cで一晩チューブをインキュベートする(6%CO2、5%02)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>卵母細胞の検索の日に<ol>
<li>37 °C(滅菌培養皿とパスツールピペット)でプラスチック供給を予熱します。</li>
		<li>患者に身元(氏名と生年月日)と排卵の時期を確認してもらいます。検査シートに、ID(ID)の確認手順が完了していること、および排卵の時期が確認されていることを示します。</li>
		<li>卵母細胞の採取管を(手順が始まる直前に)インキュベーターから取り出し、キャップを押し下げて密閉を確実にします。卵母細胞採取管に患者の情報をラベル付けします。37 °Cのブロックヒーターに卵母細胞のコレクションチューブを置きます。</li>
		<li>前温めの無菌培養皿の濾胞液を調べ、COCsを同定する。1つ以上のCOCが特定されたら、2滴の培地で2回リンスして濾胞液と血液汚染を除去します。</li>
		<li>COCを卵子コレクションチューブに移し、チューブ上のCOCの数にコメントを付けます。培地チューブのキャップをゆるめ、6%CO2、5%O2の雰囲気の中で37°Cで速やかにインキュベートします。</li>
		<li>取得した卵母細胞の数に応じて、手順 7 ~ 9 を繰り返します。実験室のシートを更新します。 注: すべてのチューブウォーミングブロック(手術室内のものを含む)が空であることを確認し、実験室のシート上の手順の終了に署名する証人であることを確認します。</li>
		<li>手順の完了後に作業段階を拭き取ります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 卵母細胞の否定
<ol><li>プレウォーム4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジンタンスルホン酸(HEPES)緩衝培地およびヒアルロニダーゼ( 材料表参照)を開始する前に37°Cで開始する。</li>
	<li>胚培養用の0.3mLの鉱油で覆われた0.6mL/ウェルの前温化HEPES緩衝培地(5%ヒト血清アルブミン[HSA]を補う)で4ウェルIVFプレート( 材料表参照)を準備し、少なくとも30分間37°Cで37°Cで温めます。</li>
	<li>患者の身元の詳細を卵母細胞の樹状化プレートにラベル付けします。</li>
	<li>処置を開始する直前に、ヒアルロニダーゼを第1ウェルに加えて、約20 IU/mLの最終濃度を得る。</li>
	<li>酵素を含む第1ウェルに限られた数のCOC(最大6個)を入れて、積雲細胞を分散させる。</li>
	<li>積雲細胞およびコロナ細胞の酵素除去を強化するために、最大30sの約250μmのパスツールピペットを通して卵母細胞を繰り返しピペット化して、積雲細胞のストリッピングを行います。初期細胞解離が観察された後、卵母細胞をHEPES緩衝培地のみを含む第2ウェルに移し、酵素の最小量を持ち越すことに注意を払う。</li>
	<li>さらに、内径が減少するデニールドピペット(170〜145μm)を使用してコロナ細胞を除去します。厳密に必要な場合にのみ、下径(135μm)を使用してください。</li>
	<li>酵素を洗い流すために、裸卵母細胞を慎重に洗います。</li>
	<li>脱分後、逆顕微鏡下で卵母細胞を調べて、その完全性と成熟段階を評価します。MII卵母細胞を未熟なもの(生殖小胞および転移I)から分離する。</li>
	<li>MII卵母細胞をガラス化領域に移動し、凍結保存をすぐに行います。実験室のシートを更新します。</li>
</ol>6. 卵母細胞ガラス化
注:卵母細胞の検索の38時間以内および脱分直後に卵卵子のガラス化を行ってください。ここで説明するガラス化手順は、室温(RT)で、操作中に卵母細胞を損傷しないように、内径170μmのストリッパーピペットを使用して達成する必要があります。
<ol><li>手順の約30分前に、平衡溶液(ES)とガラス化溶液(VS)をRT(25〜27°C)に持ち込みます。</li>
	<li>患者の名前とID、治療ID、凍結日、卵母細胞の数、およびクライオバーコードを適切にラベル付けします。</li>
	<li>新鮮な液体窒素で上部まで使い捨て冷却ラックを充填し、殺菌プロセスを開始します。</li>
	<li>ガラス化プレートに患者の名前とIDを付けて( 材料表参照)にラベルを付けます。</li>
	<li>各バイアルを慎重に反転して使用前に内容物を混合し、6 mmペトリ皿の蓋を30 μLのHEPESバッファリング媒体(5%HSA)、30 μLの隣接するESドロップで準備します。 注:媒体の蒸発を制限するために使用する直前にドロップを配置します。</li>
	<li>直径170μmのストリッパーピペットを使用して、最初のドロップに、可能な限り小さい媒体の体積で卵母細胞(最大9個)を入れる。ストリッパーピペットを使用して、ドロップn.1とn.2の間に媒体のブリッジを作成して、CPAの濃度を徐々に増加させます(図1A)。</li>
	<li>最初のドロップで卵母細胞を3分間インキュベートします。ES (n.3)の30 μLの3番目のドロップを追加します。3 分後、卵母細胞を ES の 2 番目のドロップに移し、ドロップ n.3 と n.2 の間に中型ブリッジを作成します (図 1B)。卵母細胞を3分間ドロップn.3でインキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション中に、使用されるクライオデバイスごとにESの30μLドロップを1つ追加します(9個の卵母細胞が凍結保存される場合は、ESの各ドロップに3つの卵母細胞を含むESの3滴を置きます)。卵母細胞を純粋なES溶液に移動し、6-9分間放置します(収縮後の初期サイズが回復するまで) (図1C)。</li>
	<li>1 mLのVSで中央ウェル皿(60 x 15 mm)を用意します。最初の6分の終わりに、凍結保存される卵母細胞をVS溶液に移し、できるだけ少ない媒体を放出する。卵母細胞を1分間VSのままにし、ESの過剰を取り除くために皿の下から上に移動して慎重に洗います。</li>
	<li>インキュベーションの分の終わりの約10 s、顕微鏡の下に凍結装置を置き、黒いマーク(すなわち、クライオデバイスの先端)に焦点を合わせます。黒いマークの横にあるクライオデバイスの上に、最小量のVS(図2A)を置きます。</li>
	<li>ストライパーピペットを卵母細胞から離し、過剰なVS培地(図2B)を取り除き、卵母細胞が薄い層の媒体で覆われたままになるようにします(図2C)。</li>
	<li>液体窒素に素早く凍結装置を突き落とし、表面から気泡を取り除くために急速に揺れる。クライオデバイスの保護キャップをピンセットで保持し、液体窒素で満たします。その後、液体窒素にプロピレンストリップを保ちながら、それに凍結装置を挿入します。</li>
	<li>以前に患者の情報でラベル付けされた VisioTube にクライオデバイスを保存します。実験室のシートを更新します。</li>
</ol>7. 卵母細胞の温暖化
<ol><li>手順の約30分前に、解凍液(TS)、希釈液(DS)、洗浄液(WS)をRT(25〜27°C)に温めます。慎重に各バイアルを2回反転し、内容を混ぜます。中央ウェルペトリ皿にTSの1 mLを入れ、手順を開始する前に少なくとも1時間37°Cでそれを温める。</li>
	<li>患者の名前とIDとソリューションの種類ですべてのプラスチック用品にラベルを付けます。目撃者に、クライオデバイスに関する患者の情報を確認してもらいます。</li>
	<li>各クライオデバイスを温めるには、第1ウェルに200 μLのDSを、第2ウェルと第3ウェル(それぞれWS1とWS2という名前)に同量のWSを備えた6ウェルプレートを用意します。蒸発を防ぐために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)または無菌水をウェルの外側の領域に加えます。</li>
	<li>TS皿をインキュベーターから取り出し、顕微鏡の下に置きます。顕微鏡の焦点をペトリ皿の中央に合わせます。</li>
	<li>慎重にねじれ、液体窒素にプロピレンストリップを維持しながら、凍結装置の保護キャップを取り外します。液体窒素からTSにできるだけ早く凍結装置を移して、脱窒の危険を回避し、カウントダウン(1分)を開始します。</li>
	<li>凍結装置の先端(すなわち、黒いマーク)に焦点を当てることによって卵母細胞を局在化する。ストリッパーピペットを使用して、凍結装置から卵母細胞を解放します。 注:凍結装置から卵母細胞を吸引しないようにしてください。彼らはTSに移動するまで、穏やかにそれらにいくつかのメディアを解放します。</li>
	<li>直径170μmのストリッパーピペットを使用して、卵母細胞を少量のTSでDSに移し(勾配を作成)、DSに3分間放置します。卵母細胞をWS1に同様に移動し、5分間放置します。最後に、卵母細胞をWS2に1分間転送します。</li>
	<li>卵母細胞を適切な前平衡化されたIVF培養培地に移し、細胞質内精子注射(ICSI)を進める前に1時間インキュベートする。実験室のシートを更新します。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

臨床に関する考慮事項 
卵巣組織凍結保存や体外成熟などの新たな戦略が探求されているが、COS後の卵母細胞ガラス化は生殖能力保存のためのゴールドスタンダード技術である。このシナリオでは、ほとんどのがん患者が癌治療を開始する前に1つの卵巣周期の恩恵を受ける可能性があるため、取得および凍結保存された卵母細胞の数は、可能な限り最短時間で最大化する必要があります。したがって、卵巣予備軍を完全に利用し、将来の出生の累積確率を高めるためには、適切な卵巣刺激プロトコルが重要であり、卵母細胞検索時の母親の年齢に強く依存する結果である。この点に関して、不妊治療保存目的のための卵母細胞ガラス化のための理想的な年齢はまだ29、35年18 年または37歳、30歳、31年の間にコンセンサスが必要とされている。しかし、年...

ヒト卵母細胞の効率的な凍結保存プログラムの開発と実施は、生殖医学における重要なブレークスルーとなっています。最近の証拠によると、ガラス化は、低凍結に比べて統計的に高い生存率をもたらすため、血相II(MII)卵子を凍結保存するための最も効果的な戦略であり、患者集団(不妊患者または卵母細胞の寄付プログラム)1、2、3とは無関係に。卵母細胞ガラス化の顕著な成果は、米国生殖医学会(ASRM)および生殖補助技術協会(SART)の実践委員会を導き、この技術が思春期後の女性の選択的不妊治療保存に最も効果的であると発音しました。不妊治療の保存のための医学的適応症には、(i)放射線療法、細胞傷害性化学療法、内分泌療法(卵巣予備軍に有害な影響が母親の年齢および治療の種類および用量に関連する)などの治療7を必要とする自己免疫疾患が含まれる。(ii) 繰り返しまたは根治的な手術を必要とする卵巣疾患 (子宮内膜症など)8;(iii)遺伝的状態(例えば、X-壊れやすい)または早期卵巣不全。さらに、不妊治療の保存は、非医学的理由(社会的凍結とも呼ばれる)のために親の目的を達成していないすべての女性にとって貴重な選択肢となっています。
不妊治療の保存の適応症に関係なく、不妊治療の保存に関する主要な国際ガイドラインに従って、すべての患者は、彼らの健康の成功の可能性、コスト、リスク、および手順9、10、11、12、13の限界について知らされる適切なカウンセリングを受けるべきである。最も重要なことは、MII卵母細胞のコホートを活性化することは妊娠を保証しないが、必要に応じて体外受精(IVF)治療のために成功する可能性が高いことを明らかにすべきである14。この点に関して、卵母細胞ガラス化時の女性の年齢は、確かに、進行した母親の年齢(AMA;>35歳)が女性不妊症の主な原因である15の最も重要な制限因子である。卵巣予備軍の進行性の減少に加えて、AMAは代謝、エピジェネティック調節、細胞周期チェックポイント、および細分性分離17のような生理的経路の欠陥による卵母細胞能力の障害と関連している。したがって、卵の合理的な数は主に母親の年齢に依存する。36歳未満の女性では、少なくとも8-10 MII卵母細胞18が成功の可能性を最大化する必要があります。一般に、ガラス化卵母細胞の数が多いほど、成功の可能性は高くなります。したがって、抗ミュレリアンホルモン(AMH)レベルまたはアントラル卵胞数(AFC)などの卵巣予備マーカーに従って卵巣刺激を調整することは、可能な限り短時間で卵巣予備を完全に利用するために重要である。
全体の手順の安全性は、不妊治療の保存のために患者を登録する際のもう一つの重要な問題です。臨床医は、リスクを最小限に抑え、(i)卵巣過剰刺激ホルモン(OHSS)などの安全なアプローチを使用してGnRHアゴニストトリガー19と(ii)リモートを防ぐために最善の戦略を採用する必要があります。 まだ可能, 腹膜出血のリスク, 骨盤構造への傷害 (尿管, 腸, 虫垂, 神経), 卵母細胞の検索中に骨盤感染.最後に、(iii)刺激のための伝統的なレジメンは、上端生理学的血清エストラジオールに関連付けられているため、乳癌などのエストロゲン感受性疾患では推奨されない。アロマターゼ阻害剤を含むプロトコル(レトロゾールまたはタモキシフェンなど)は、これらの場合20,21においてより適している。実験室での設定では、卵母細胞ガラス化のための最も広く普及したプロトコルは、クワヤマと同僚2、23によって最初に記述されたものであり、これは凍結保護剤(CPA)の段階的な添加を含む段階的な手順で構成されている。第1相(平衡/脱水)では、卵母細胞は7.5%v/vエチレングリコールおよび7.5%v/vジメチルスルホキシド(DMSO)を含むCPA溶液中に露出し、第2段階では卵母細胞を15%対/vエチレングリコールと15%v/v DMSO、プラス0.5糖質を含むガラス化溶液に移動する。ガラス化の媒体の短いインキュベーションの後、卵母細胞は、具体的に設計された開放性の凍結装置に配置することができ、最後に使用するまで保存される-196°Cで液体窒素に突っ込んだ。
ここでは、不妊治療の臨床および検査作業全体が(i)客観的およびエビデンスに基づくカウンセリングのための勧告を概説し、(ii)処置の費用対効果に焦点を当て、(iii)卵巣予備軍を完全に利用し、可能な限り短時間で取り出される卵母細胞の数を最大化するための最も適切な戦略を記述することによって説明された。卵巣予備軍の評価、理想的な刺激プロトコルの定義、卵母細胞の検索、脱潤、およびガラス化の手順は、その有効性、効率、安全性を最大化するためのアプローチと共に詳述される。このプロトコルの他のプロトコルまたは適応が文献に存在するので、この原稿の代表的な結果および議論のセクションはこの手順にのみ適用されます。

<table><tbody><tr><td>Collection<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>u>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>IVF TECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラボマーカー</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>IVF TECH</td><td></td><td>グレードAエアフロー</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライ</td><td>カM80</td><td></td></tr><tr><td>温度計</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>試験管 ウォーマー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トライガスインキュベーター</td><td>パナソニック</td><td>MCO-5M-PE</td><td>02/CO2</td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>クック</td><td>K-MAR-5200</td><td></td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSCM(連続単回培養完全) 培地</td><td>富士フイルムIrvine Scientific</td><td>90165</td><td>IVF 培養培地</td></tr>、<tr><td>胚培養用 HSA 鉱物油</td>を添加 <td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>卵子吸引針 (シングルルーメン)</td><td>Cook</td><td>K-OSN-1730-B-60</td><td></td></tr><tr><td>Primaria Dish</td><td>Corning</td><td>353803</td><td>Corning Primaria Dish 100x20 mm style standard cell culture dish</td></tr><tr><td>Round- bottom tubes</td><td>Falcon</td><td>352001</td><td>ファルコン 14ml 丸底ポリスチレン スナップキャップ付き試験管</td></tr><tr><td>丸底チューブ</td><td>ファルコン</td><td>352003</td><td>卵子採取チューブ/ ファルコン 5ml 12x75 丸底ポリプロピレン スナップキャップ付き試験管</td></tr><tr><td>ゴム球</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Z111589-12EA</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガラス パスツールピペット</td><td>ハンターサイエンティフィ</td>ック <td>PPB150-100PL</td><td>ピペット パスツールコトネート、150mm、MEA e CE</td></tr><tr><td>Denudation<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>u>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>Eppendorf</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>Flexipet調節可能なハンドルセット</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td>ストリッパー&nbsp; ホルダー</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>66003</td><td>p20</td></tr><tr><td>k-System Incubator</td><td>Coopersurgical</td><td>G210Invicell</td><td></td></tr><tr><td>Lab Markers</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>IVF TECH</td><td></td><td>グレードA エアフロー</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopur epTIPS Rack</td><td>Eppendorf</td><td>30075331</td><td>マイクロピペット epTIPS Biopur 2-200 &micro;l</td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td>thermoFisher Scietific</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90101</td><td>80 IU/mL of hyaluronidase enzyme in HEPES-buffered HTF</td></tr><tr><td>IVF culture dish (60 x 15mm)</td><td>Corning</td><td>353802</td><td>Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria Standard Cell Culture</td></tr><tr><td>Dish IVF dish 4-well plate with sliding lid</td><td>ThermoFisher Scietific</td><td>176740</td><td>マルチディッシュ 4ウェル(Nunc)</td></tr><tr><td>IVF ワンウェルディッシュ</td><td>ファルコン</td><td>353653</td><td>ファルコン 60 x 15 mm TC 処理センターウェルIVF</td></tr><tr><td>胚培養用ミネラルオイル</td><td>富士フイルム アーバイン・サイエンティフィック</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>修正 HTF ミディア</td>ム <td>富士フイルム アーバイン・サイエンティフィック</td><td>90126</td><td>HEPES-バッファード ミディア</td></tr>ム <tr><td>ゴム球</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>Z111589-12EA</td><td>1 mL 用パスツールピペット</td></tr><tr><td>滅菌ガラス パスツールピペット</td><td>ハンターサイエンティフィック</td><td>PPB150-100PL</td><td>ピペット パスツールコトネート、150 mm、MEA e CE</td></tr><tr><td>ストリッピングピペット&nbsp;チップ(140 &micro;m)</td><td>Cook</td><td>K-FPIP-1140-10BS-6</td><td>PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING</td></tr><tr><td>ストリッピングピペットチップ (130 &micro;m )</td><td>Cook</td><td>K-FPIP-1130-10BS-7</td><td>PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING</td></tr><tr><td>ストリッピングピペットチップ (170 &micro;m)</td><td>Cook</td><td>K-FPIP-1170-10BS-5</td><td>PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING<</td></tr><tr><td>STRONG>Vitrification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electronic Timer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexipet 調整可能ハンドルセット</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td>ストリッパー&nbsp; ホルダー</td></tr><tr><td>ギルソン ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F123601</td><td>p200</td></tr><tr><td>ラボマーカー</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>IVF TECH</td><td></td><td>グレードA エアフロー</td></tr><tr><td>冷却用ステンレス容器 ラック</td><td>北里</td><td></td><td>ガラス固化用液体窒素容器</td></tr> 実<tr><td>体顕微鏡</td><td>ライ</td><td>カ M80</td><td></td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopur epTIPS ラック</td><td>Eppendorf</td><td>30075331</td><td>マイクロピペット epTIPS Biopur 2-200 &micro;L</td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン</td><td>富士フイルム アーバインサイエンティフィック</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>体外受精ディッシュ (60 x 15 mm)</td><td>コーニング</td><td></td><td>353802 コーニング プリマリア ファルコンディッシュ 60 x 15 mm TC プリマリア標準細胞培養ディッシュ</td></tr><tr><td>体外出食ディッシュ 6ウェル</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-SW02</td><td>OOSAFE&nbsp;6 WELL DISH WITH STRAW HOLDER</td></tr><tr><td>Modified HTF Medium</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>HEPES-Buffered Medium</td></tr><tr><td>Stripping Pipette Tips (170 &micro;m)</td><td>Cook</td><td>K-FPIP-1170-10BS-5</td><td>PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING</td></tr><tr><td>ガラス化凍結キット</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90133-so</td><td>2 バイアル ES (平衡化溶液、2 x 1 mL) および 2 バイアル VS (ガラス化溶液、2 x 1 mL)</td></tr><tr><td>Vitrifit</td><td>Coopersurgical Origio</td><td>42782001A</td><td>VitriFit&nbsp;ボックス</td></tr><tr><td><ストロング>ウォーミング</ストロング><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>u><ストロング>機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電子タイマーフレ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシペット調整可能ハンドルセット</td><td>クック</td><td>G18674</td><td>ストリッパー&nbsp; ホルダー</td></tr><tr><td>ギルソン ピペットマン</td><td>ギルソン</td><td>F123601</td><td>p200</td></tr><tr><td>k-System Incubator</td><td>Coopersurgical</td><td>G210Invicell</td><td></td></tr><tr><td>Lab Markers</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar Flow Hood</td><td>IVF TECH</td><td></td><td>Grade A エアフロー</td></tr><tr><td>冷却ラック用ステンレス容器</td><td>北里</td><td></td><td>ガラス固化用液体窒素容器</td></tr> 実<tr><td>体顕微鏡</td><td>ライ</td><td>カ M80</td><td></td></tr><tr><td>消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biopur epTIPS ラック</td><td>Eppendorf</td><td>30075331</td><td>マイクロピペット epTIPS Biopur 2-200 &micro;L</td></tr><tr><td>CSCM(Continuos単一培養完全)培地</td><td>富士フイルム アーバインサイエンティフィック</td><td>90165</td><td>IVF培養培地 HSA</td></tr><tr><td>体外接種培養皿(60 x 15 mm)</td>コー<td>ニング</td><td></td><td>353802 コーニング プリマリア ファルコンディッシュ 60X15mm TC プリマリア標準細胞培養皿</td></tr><tr><td>IVF皿 スライド式蓋付き4ウェルプレート</td><td>ThermoFisher Scietific</td><td>176740</td><td>マルチディッシュ 4ウェル(Nunc)</td></tr><tr><td>体外受精ディッシュ6ウェル</td><td>Oosafe</td><td>OOPW-SW02</td><td>OOSAFE&reg;&nbsp;6 WELL DISH WITH STRAW</td></tr><tr><td>HOLDER 胚培養用ミネラルオイル</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Sトリップピペットチップ (300&micro;m)</td><td>Cook</td><td>K-FPIP-1300-10BS-5</td><td>PIPETTE FLEXIPETS PER DENUDING</td></tr><tr><td>ガラス固化融解キット</td><td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>90137-so</td><td>TSバイアル4本(解凍液、4 x 2 mL)+DSバイアル1本(希釈液、1 x 2 mL)+WSバイアル1本(洗浄液、1 x 2 mL)</td></tr></tbody></table>

卵母細胞ガラス化による不妊治療の保存:臨床および検査の視点

Fertility Preservation Through Oocyte Vitrification: Clinical and Laboratory Perspectives

女性の生殖能力を維持することは、患者の将来の生活の質をケアする多機能医療システムにおいて重要です。卵母細胞凍結保存は、思春期後の女性の不妊治療の健康維持のためのゴールドスタンダードとして、いくつかの国際科学協会によって認識されています, 医療と非医学的適応症の両方のために.主な医学的適応症は、腫瘍疾患、重度の子宮内膜症などの婦人科疾患、卵巣予備軍を損なう全身性疾患、早期閉経を伴う遺伝的状態である。本論文では、客観的およびエビデンスに基づくカウンセリングに関する推奨事項を概説することにより、不妊治療の臨床および実験室のワークアップ全体について説明する。さらに、それは処置の有効性に焦点を当て、卵巣予備軍を完全に利用し、最短時間で取り出される卵母細胞の数を最大化するための最も適切な戦略を記述する。卵巣予備軍の評価、理想的な刺激プロトコルの定義、卵母細胞の検索、脱分、およびガラス化の手順は、その有効性、効率、安全性を最大化するためのアプローチと共に詳述されている。

センターにおける不妊治療の保全プログラムの概要
12年間(2008-2020年)、285人の女性が収集された成熟した卵のコホート全体のガラス化を伴う少なくとも1つの卵母細胞検索を受けた。これらの女性のほとんど (n = 250) は 1 回の検索を受け、35 は複数の検索を受けました。卵ガラス化のための卵母細胞の検索を受ける理由は、4つのカテゴリに要約されています:医療(癌を除く)、癌、非医学的、および他。卵ガラス化のための単一の卵母細胞の検索を受けている250人の女性のうち、8%が癌以外の医学的理由を持っていた(10子宮内膜症、 3骨髄腫、4卵巣嚢腫、1ヒドロサルピンス、16%が癌(31乳癌、3卵巣癌、2大腸癌、2ホジキンリンパ腫、1人の外陰癌e 1子宮頸癌)、53%が非医学的理由を有し、23%が他の理由(精子の43欠失、OHSのリスク10、OHSSのリスクは4、感染、10)この分布は卵ガラス化のために複数の卵母細胞の検索を受けている患者の間で異なっていた。具体的には、9%が癌以外の医学的理由(子宮内膜症1、2減少卵巣予備軍)、6%が癌(2乳癌)...

卵母細胞凍結保存は、思春期後の女性の不妊治療の保存のためのゴールドスタンダードとしていくつかの国際科学協会によって認識されています。適切な臨床および実験室戦略は、最大の有効性、効率、および不妊治療の安全性を保証します。

Preserving female fertility is crucial in a multifunctional healthcare system that takes care of patients' future quality of life. Oocyte cryopreservation ...

卵母細胞のガラス化および温暖化のプロシージャは、不妊治療の保存に不可欠である。このプロトコルに従って、ユーザーはこれらの手順の有効性を最大限に引き出すことを可能にします。卵母細胞ガラス化のための不妊治療の保存は、今日確立され、倫理的に受け入れられるアプローチです。これは、効果的かつ一貫した臨床結果を達成し、胚凍結保存に関連する道徳的および法的限界を克服することを可能にする。ガラス化プロセスの習熟度を達成するためには、凍結保護剤へのサンプルの暴露時間に特に注意を払って、プロトコルのすべての重要な点に精通することが重要です。検索から38時間以内、脱分後すぐに、患者の名前、ID、および溶液の種類を持つプラスチック用品のすべてにラベルを付け、証人にクライオデバイス上の患者の情報を確認してもらいます。すべての供給がラベル付けされたら、慎重に数回卵母細胞の各バイアルを反転し、人間の血清アルブミンと30マイクロリットルの平衡溶液をペトリ皿に補充したHEPES緩衝培地の30マイクロリットルの滴を混合して配置する。最初のドロップに卵母細胞を配置し、凍結保護剤の濃度の徐々に増加を得るために平衡溶液の30マイクロリットルのドロップに媒体の橋を作成するためにストリッパーピペットを使用してください。3分後、プレートに2番目の30マイクロリットルの平衡溶液を加え、ピペットを使用して溶液滴間にミディアムブリッジを作成します。卵母細胞が平衡している間に、プレートに使用される各クライオデバイスに対して平衡溶液の1つの30マイクロリットルの滴を加える。3分後、卵母細胞を純粋な平衡溶液に6〜9分間移動させ、卵母細胞を初期サイズに戻します。卵母細胞が回復したら、1ミリリットルのガラス化溶液を含む中央ウェルIVF皿を調製する。卵母細胞をできるだけ少ない媒体で皿に移し、余分な平衡溶液を取り除くために慎重に動かします。インキュベーション終了の約10秒前に、患者の情報を示すクライオ装置を顕微鏡下に置き、クライオ装置の先端に焦点を合わせます。ガラス化液の最小量で先端の横にあるクライオ装置に卵母細胞を置き、ストライパーピペットを卵母細胞から離して余分なガラス化溶液を取り除き、卵母細胞を薄い層の培地で覆ったままにします。すぐに液体窒素にクライオデバイスを突っ込み、急速にその表面から任意の気泡を除去するためにデバイスを振ります。クライオ装置の保護キャップをピンセットで保持し、プロピレンストリップを液体窒素に保ちながらキャップに挿入する前に、キャップに液体窒素を充填します。次に、患者の情報がラベル付けされたビソチューブにクライオデバイスを保存し、検査シートを更新します。卵母細胞の温暖化のために、室温に温めた解凍、希釈、洗浄液の各バイアルを慎重に反転させ、37°Cで少なくとも1時間のシャーレの中央井戸に解凍液を1ミリリットル加えます。すべてのプラスチック製の電源に患者の名前とIDと溶液の種類をラベル付けし、cryoデバイス上の患者の情報を確認するために証人に依頼します。各デバイスを温めるには、6つのウェルプレートの最初のウェルに200マイクロリットルの希釈液を加え、プレートの2番目と3番目のウェルに等量の洗浄液を加えます。溶液の蒸発を防ぐために、井戸の外側の領域にPBSを追加します。解解凍液の皿をステレオ顕微鏡の下に置き、皿の中心に焦点を合わせます。プロピレンストリップを液体窒素に保ちながら、クライオ装置の保護キャップを取り除き、凍結装置をできるだけ早く解凍液に移し、脱窒のリスクを回避します。1分後、クライオデバイスの先端に焦点を当てて卵母細胞を見つけ、最終的にはストリッパーピペットを使用してデバイスから卵母細胞を穏やかに放出します。直径170ミクロンのストリッパーピペットを使用して、6つのウェルプレートの最初のウェルで卵母細胞と少量の解凍溶液を希釈液に移します。3分後、卵母細胞を洗浄液の最初の井戸に5分間移動します。インキュベーションの終わりに、卵母細胞を洗浄液の第2ウェルに移し、37°Cで1分間インキュベートしてから、卵母細胞を適切な量の所定のIVF培養液に1時間移管し、実験室のシートを更新する。12年間にわたり、285人の女性が収集された成熟した卵のコホート全体のガラス化を伴う少なくとも1つの卵母細胞検索を受けた。これらの女性のほとんどは、単一の検索を受けました。35は複数の検索を受けました。卵ガラス化のための卵母細胞の検索を受ける理由は、一般的に癌以外の医療として特徴付けられていた, 癌, 非医学的, その他.卵ガラス化の医学的理由を有する患者および癌のために生殖能力の保存を受けている患者は若く、非医学的または他の理由を有する患者よりも高い凝結濾胞数を示した。しかし、平均成熟率が患者の医学的理由でわずかに低かったため、平均してガラス化された卵母細胞の数は群間で類似していた。癌以外の医学的理由を持つ患者の約半数、および卵ガラス化の他の理由を持つ患者の大半は、実際に温暖化のために戻ってきました。逆に、癌または非医学的理由で不妊治療を受けた患者はごくわずかで、IVFにガラス化卵母細胞を使用した。ガラス化と温暖化の間の時間差にもかかわらず、卵母細胞の生存率は患者群間で類似しており、卵母細胞ガラス化および温暖化プロトコルの有効性および安全性を確認した。さらに、生存率は、ガラス化および温暖化オペレータの経験とは無関係であった。結果の一貫性に影響を与える可能性のある最も重要なステップは、温暖化に関連するステップです。そのため、解凍液の体積と温度を慎重に制御することが本当に重要です。卵巣組織凍結保存思春期前患者のための選択肢として現在調査中の唯一の戦略。有望ですが、このアプローチには、そのアプリケーションを制限する重要な制限があります。

fertility-preservation-through-oocyte-vitrification-clinical

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

修正されたMicroSecureガラス化：人間の胚盤胞のための、安全なシンプルで非常に効果的な凍結保存手順

本稿は、商業的支援上の実験室製のメディアを用いた未熟な猫卵母細胞の最小体積ガラス化のためのプロトコルを記述する。それは、エキビボ生殖腺からガラス化および温暖化に至る卵母細胞の分離からあらゆるステップをカバーする。...

未熟ネコの最小体積ガラス化

重度の卵巣機能障害患者に対する卵巣卵胞の薬物を含まないインビトロ活性化(IVA)の検査手順の詳細を提示する。この方法は、卵巣過剰刺激当たりの取得可能な卵母細胞の数を増加させ、それらの患者の生殖能力の保存に利益をもたらす可能性がある。...

重度卵巣機能障害患者における不妊治療の保存

このプロトコルは、成体および若年性羊卵子のガラス化のための標準的な方法を提供することを目的としている。これは、体外成熟培地の調製から温暖化後の培養までのすべてのステップを含む。卵母細胞は最小必須容積を保障するためにクライオトップを使用してMII段階でガラス化される。...

羊の成人および前頭前卵巣から採取された体外期の成熟卵母細胞のガラス化

卵巣組織のガラス化のためのプロトコルは、広く使用されているゆっくりと凍結プロトコルに代わる凍結保存方法として、提示されます。...

ガラス質の凝集状態を達成するための卵巣皮質組織のガラス化

このプロトコルは、体外受精手順から卵胞液、体細胞、未熟卵母細胞を分離および処理するための標準化された方法の概要を示し、高品質の分子および細胞分析を可能にします。これらのアプローチは、通常臨床ケアで廃棄される材料を使用した生殖能力、生殖老化、卵巣機能障害へのトランスレーショナル研究をサポートします。...

体 外 受精を受けている個人からのヒト卵胞液、卵胞体細胞、および未熟卵母細胞の収集

このプロトコルは、最近導入された床ベースのフォトセルシステムを使用して、神経学的/整形外科の患者や高齢者の空間的および時間的な歩行変数を評価するために使用されます。...

患者と高齢者における時空間歩行パラメータの臨床的評価

我々はsubnormothermic温度（21℃）で、ヒト肝臓移植片のex vivoでの機械灌流法を説明する。...

Subnormothermicマシン灌流によって機能的なヒト肝臓保全と回復

ここで喀痰誘発の手法について述べる。このプロトコルは、喀痰処理差分セル数を数えるために、喀痰培養上清を収集するために、さらなる分析のための細胞にも説明します。...

喀痰誘発および実験室の処理のための方法論

ここでは、関節包内のロータリー カット手順 (IRCP)、変更された腹腔鏡下関節包内筋腫摘出術妊孕性温存を促進するを実行するためのプロトコルを提案する.

関節包内のロータリー カット手順 (IRCP) の導入: A は、妊孕性温存を促進する Hysteromyomectomy プロシージャを変更

学ぶ卵母細胞ガラス化と加温手順による不妊治療の保存法。臨床と検査の観点から、凍結保護剤の曝露時間などプロトコルの重要ポイントを習得し、一貫した臨床結果を最大化する方法を解説します。

卵母細胞ガラス化による不妊治療の保存:臨床および検査の視点

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