Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

パッチクランプおよびカルシウムイメージング実験は、労働集約的で時間がかかり、困難を伴います。このプロトコルは、高品質のマウス心房および心室心筋細胞を分離する便利な方法を提供し、パッチクランプ実験と同時に行われるカルシウムイメージングに適しています。このプロトコルの主な利点は、同じ動物から心房および心室心筋細胞を取得できることです。

マウス心房筋細胞の単離は特に困難であり、以前の実験では制限要因となっていました。まず、ランゲンドルフ装置に灌流バッファーを事前に充填し、空気が入っていないことを確認します。大動脈カニューレを解剖顕微鏡で固定し、灌流バッファーを充填した1ミリリットルのシリンジで接続します。

安楽死させたマウスから心臓を摘出した後、心臓を室温灌流緩衝液に入れ、顕微鏡下で鈍端針で大動脈をできるだけ早くカニューレ挿入します。縫合糸で心臓を針にしっかりと結び、注射器を外します。大動脈カニューレ挿入後、カニューレ挿入された心臓を直ちにランゲンドルフ装置に接続し、システムに空気が入らないようにします。.

正確に摂氏37度で1分間、1分間、1分間4ミリリットルの灌流速度で心臓を灌流します。灌流から消化バッファーに切り替え、摂氏37度の温度と毎分4ミリリットルの灌流速度で正確に9分間灌流します。終了したら、消化された心臓を完全に覆うのに十分な消化バッファーを備えたシャーレに移します。

次に、顕微鏡下で心房と心室を慎重に解剖します。心房を1.5ミリリットルの消化緩衝液を入れたシャーレに移し、心室を3ミリリットルの消化緩衝液を入れた別のシャーレに移します。鈍い鉗子を使用して、心房を慎重に、しかし迅速に小さな断片に引き離します。

あらかじめチップの開口部を広げるためにカットした1000マイクロリットルのピペットチップで慎重にピペッティングして、組織を溶解します。溶液を15ミリリットルの遠心分離チューブに移し、チューブの側面をピペッティングして同量のストップバッファーを追加します。溶液の3ミリリットルすべてを200マイクロメートルのナイロンメッシュに通し、完全に消化されていない残りの大きな組織片を取り除きます。

心室解剖を行うには、解剖ハサミや鉗子を使用して心室組織を細かく切り刻み、別の1000マイクロリットルのピペットチップでピペットを上下に動かして溶解します。細胞と組織溶液を15ミリリットルの遠心チューブに移し、チューブの側面に慎重にピペッティングして同量のストップバッファーを添加して反応を終了します。6ミリリットルの細胞溶液と組織溶液をすべて200マイクロメートルのナイロンメッシュに通し、完全に消化されていない大きな部分を取り除きます。

心房細胞と心室細胞の懸濁液の両方を室温でベンチに6分間放置して沈殿させます。次に、チューブを5Gで2分間遠心分離します。プラスチック製のパスツールピペットを使用して上清を捨て、細胞ペレットを10ミリリットルのカルシウムを含まないチロード溶液に慎重に再懸濁します。

心房細胞と心室細胞を沈降のために8分間放置します。心房細胞を5Gで1分間遠心分離します。次に、両方の細胞サンプルから上清を捨て、ペレットを100マイクロモルのカルシウムを含む10ミリリットルのTyrode溶液に慎重に再懸濁します。

細胞を8分間放置して沈降させた後、心房細胞の遠心分離を繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを400マイクロモルカルシウムを含む10ミリリットルのTyrode溶液に慎重に再懸濁します。このプロセスをもう一度繰り返し、Tyrodeの溶液中の細胞を1ミリモルのカルシウムで再懸濁します。

すべての心房細胞は小さく、細胞容量は約35〜100ピコファラドの範囲です。心房の働き心筋の典型的な細胞をここに示します。心室筋細胞はより棒状で大きく、細胞容量は100〜約400ピコファラドの範囲です。

ここでは、1つの心房筋細胞と1つの心室筋細胞からの同時細胞質カルシウム過渡現象を伴うL型カルシウム電流測定の例を示します。このテクニックを試す前に、臓器摘出の練習をしてください。ステップが迅速に実行され、すべての組織カットが正しい位置で行われることが重要です。

臓器摘出が再現可能な品質で行われる場合は、カニューレ挿入を完了するために少し時間をかけてください。このプロトコールで単離された細胞は、パッチクランプ測定に適しています。さらに、蛍光色素を充填することができるため、幅広いイメージング実験が可能です。