Name: Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 学ぶLangendorff灌流法によるマウス心房・心室筋細胞の高品質分離法。Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定が可能で、不整脈発生機構の研究に有用です。

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この研究は、ドイツ研究財団(DFG;血管医学の臨床医科学者プログラム(PRIME)、MA 2186 / 14-1からP.トムシッツおよびD.シュットラーへ。VO1568/3-1、IRTG1816、およびSFB1002プロジェクトA13からN.フォークト)、ドイツの卓越性戦略の下でのドイツ研究財団(EXC 2067/1-390729940からN.フォークト)、ドイツ心臓血管研究センター(DZHK; 81X2600255からS.クラウスおよびN.フォークト; 81Z0600206からS.ケーブ)、コロナ財団(S199/10079/2019からS.クラウス)、心血管疾患に関するERA-NET(ERA-CVD、01KL1910からS.クラウス)、 ハインリッヒ・アンド・ロッテ・ミュールフェンツル財団(S.クラウスへ)とエルゼ・クレーナー・フレゼニウス財団(EKFS 2016_A20 N.フォークトへ)。資金提供者は原稿の準備に何の役割も果たしていませんでした。

すべての動物の手順は、ニーダーザクセン州動物審査委員会(LAVES、AZ-18 / 2900)によって承認され、動物福祉に関するすべての制度的、国内的、および国際的なガイドラインに従って実施されました。
1. 事前手配
<ol><li>1 Lの10x灌流バッファー(表1)、500 mLの1x灌流バッファー(表2)、50 mLの消化バッファー(表3)、10 mLのストップバッファー(表4)、1 Lのタイロード溶液(表5)、10 mLの各カルシウムステップ溶液(示されているようにグルコースおよびそれぞれの量のカルシウムを含むタイロード溶液)を準備します。 提供されたレシピに従って、1 Lの4-AP溶液(表5)、100 mLのピペット溶液(表6)および5 mLのプルロン酸。 注:浴溶液(タイロードおよび4-AP溶液)は、事前に調製し(グルコースなし)、+ 4°Cで保存することができ、グルコースは実験日に添加される。ピペット溶液は-20°Cで保存でき、実験日にカルシウム指示薬を添加し、溶液をさらに使用するまで氷上で保存します。10x灌流バッファーは室温で保存でき、1x灌流バッファー、消化バッファー、および停止バッファーは実験日に新たに調製する必要があります。</li>
	<li>ウォーターバスとローラーポンプをオンにします。</li>
	<li>ランゲンドルフ装置に灌流バッファーをプレフィルします。空気がないことを確認してください。</li>
	<li>大動脈カニューレを解剖顕微鏡で固定して調製し、灌流バッファーときれいな空気で満たされた1 mLシリンジでカニューレをすすぎます。 注:灌流システム内の空気は冠状動脈灌流に直接影響し、消化効果に影響を与えるため、避けることが重要です。エアトラップを安全に回避するために、必要に応じてバブルトラップをセットアップに追加できます。</li>
	<li>臓器採取と顕微鏡検査に十分な灌流バッファーを使用してペトリ皿を準備します(バッファーは臓器全体をしっかりと覆う必要があり、使用するペトリ皿のサイズに応じて数ミリリットルで十分です)。</li>
	<li>組織解離および顕微鏡検査のための消化バッファーで3つのペトリ皿を準備し、緩衝液はそれぞれのペトリ皿内の顕微鏡下で解剖のために器官を覆うべきであり、量は使用されるペトリ皿のサイズに依存する。解離には、心室組織に3 mL、心房組織に1.5 mLを使用します。</li>
</ol>2.臓器摘出
<ol><li>27 Gカニューレを備えた1 mLシリンジを使用して、0.1 mLのヘパリン(1,000 U / mL)をマウスに注射し、5〜10分待ちます。</li>
	<li>マウスを、約500 μLのイソフルランに浸した小さな組織と一緒に誘導チャンバーに入れます。動物は組織と接触してはいけません。それを避けるために、プラスチック製の生検埋め込みカセットを使用して組織を覆うことができます。動物が完全に麻酔されたら、つま先のつまみ反射をチェックし、存在しなくなったらすぐに、頸部脱臼によってマウスをすぐに安楽死させます。</li>
	<li>マウスを背中のプラットフォーム(ペーパータオルで覆われた発泡スチロールなど)に置き、カニューレで足を固定して所定の位置に保持します。</li>
	<li>胸部と腹部の一部を覆っている毛皮と皮膚をジュグルムから結合に向かってはっきりと切り込み、ハサミを使用して臓器構造を傷つけることなく剣状突起の真下腹部を開きます。外科用鉗子で胸骨を持ち上げ、肋骨の端に沿ってハサミで横隔膜を切断し、次に腋窩の内側線で肋骨を切断し、胸郭を取り外して心臓を露出させます。</li>
	<li>鈍い鉗子を使用して心膜を慎重に取り外し、下から鈍い鉗子で持ち上げ、ハサミを使用して1回の切断で大きな血管を切断することにより、心臓をすばやく取り除きます。</li>
	<li>心臓を室温灌流バッファーに入れ、顕微鏡下で鈍い端の針で大動脈をできるだけ早くカニューレ挿入します。 注意: 臓器に付着している肺組織や脂肪組織を、時間をあまり失うことなく取り除きます。カニューレ挿入中は、緩衝液が冠状動脈に入るのを防ぐことによって結果を損なうため、針の端が大動脈弁を通って伸びないようにしてください。</li>
	<li>縫合シルクで心臓を針にしっかりと結び、注射器から外します。 注:心臓の取得(大きな血管が切断された瞬間)から大動脈を針に縫合するまでの全手順は、できるだけ短い時間で済みます。心臓の除去から灌流の開始まで90〜180秒以上かからないことをお勧めします。</li>
</ol>3.酵素消化
<ol><li>大動脈カニューレ挿入後、すぐにカニューレをランゲンドルフ装置に接続し、システムに空気が入らないようにします。 注:ランゲンドルフ装置の下部に灌流バッファーのドロップをぶら下げ、システムに空気が入らないようにするために、針の上部に灌流バッファーのドロップを置くと役立ちます。</li>
	<li>心臓に灌流バッファーを1分間、温度37°C、灌流速度4 mL/minで灌流します。 注:灌流針の先端の温度を37°Cにするには、ウォーターバスの温度を約40°Cよりわずかに高く設定する必要があります。 これは、灌流先端の温度を測定することによって定期的にテストする必要があります。</li>
	<li>灌流を消化バッファーに切り替え、正確に37°Cの温度と正確に4mL/minの灌流速度で正確に9分間灌流します。</li>
	<li>消化された心臓を完全に覆うのに十分な消化バッファーを備えたペトリ皿に移します。次に、顕微鏡で心房と心室を慎重に解剖します。</li>
	<li>心房を1.5 mLの消化バッファーを含むペトリ皿に移し、心室を3 mLの消化バッファーを含む別のペトリ皿に移します。</li>
	<li>心房郭清<ol><li>慎重に、しかし時間を失うことなく、鈍い鉗子を使用して心房を小さな断片に引き離します。</li>
		<li>チップの開口部を広げるために以前に切断された1,000 μLのピペットチップを使用して慎重に上下にピペッティングして、組織を溶解します。</li>
		<li>溶液を15 mLの遠沈管に移し、チューブの側面を注意深くピペッティングして等量のストップバッファー(1.5 mL)を加えて反応を終了します。</li>
		<li>3 mLの細胞/組織溶液すべてを200 μmのナイロンメッシュに注意深く通し、完全に消化されていない残りの大きな組織片を取り除きます。 注:消化が成功すると、固体の塊はほとんど残りません。</li>
	</ol></li>
	<li>心室解離<ol><li>解剖ハサミとピペットを上下に使用して、心室組織をすばやく細かく切り刻んで溶解します。上下にピペッティングするために別の1,000μLピペットチップを使用し、開口部を広げるために短くしてもよい。</li>
		<li>細胞/組織溶液を15 mLの遠沈管に移し、チューブの側面で慎重にピペッティングして等量のストップバッファー(3 mL)を加えて反応を終了します。</li>
		<li>6 mLの細胞/組織溶液すべてを200 μmのナイロンメッシュに注意深く通し、完全に消化されていない大きな組織片を取り除きます。 注:消化が成功すると、固体の塊はほとんど残りません。</li>
	</ol></li>
	<li>両方のチューブ(心房および心室細胞懸濁液)を室温で6分間ベンチに置いておいて落ち着かせます。</li>
	<li>両方の15 mLチューブを5 x g で2分間遠心分離します。</li>
</ol>4.カルシウムの再導入
注:次の手順は、心房細胞と心室細胞の両方で同じであり(特に言及されていない限り)、室温で実行されます。
<ol><li>プラスチック製のパスツールピペットを使用して上清を廃棄し、ペレットを10 mLのカルシウムフリータイロード溶液に注意深く再懸濁します。</li>
	<li>沈降のために細胞を8分間放置します。</li>
	<li>5 x g で1分間遠心分離する(心房細胞のみ、沈降は心室細胞には十分である)。</li>
	<li>上清を廃棄し、カルシウム濃度100 μMのタイロード溶液10 mLにペレットを注意深く再懸濁します。</li>
	<li>沈降のために細胞を8分間放置します。</li>
	<li>5 x g で1分間遠心分離する(心房細胞のみ、沈降は心室細胞には十分である)。</li>
	<li>上清を廃棄し、カルシウム濃度400 μMの10 mLのタイロード溶液にペレットを注意深く再懸濁します。</li>
	<li>沈降のために細胞を8分間放置します。</li>
	<li>5 x g で1分間遠心分離する(心房細胞のみ、沈降は心室細胞には十分である)。</li>
	<li>上清を廃棄し、ペレットを1 mL(心房)/ 5 mL(心室)のタイロード溶液に1 mMカルシウム濃度で注意深く再懸濁します。.</li>
</ol>5.蛍光カルシウム指示薬Fluo-3 AMによる筋細胞の負荷
注意: 蛍光カルシウムインジケーターの光感度のため、次の手順は光から保護して実行する必要があります(たとえば、チューブをアルミホイルで覆うなど)。
<ol><li>無水DMSO中の20%プルロニックF-127を50 μgのFluo-3AMに添加して、Fluo-3 AMストック溶液を調製します(光から保護された-20°Cで保存できます)。</li>
	<li>10 μLのFluo-3 AMストック溶液を1 mLの細胞懸濁液に加え、光から保護された室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>5 x g で1分間遠心分離します。</li>
	<li>プラスチック製のパスツールピペットを使用して上清を廃棄し、ペレットを妥当な量の浴溶液に再懸濁して、良好な使用濃度(細胞密度に応じて1〜5 mLの浴溶液)を得ます。</li>
	<li>実験を開始する前に、脱エステル化のために30分間放置してください。</li>
</ol>6.前述のパッチクランプとエピ蛍光Ca2+過渡測定の同時測定16
注:パッチクランプ測定はこの記事のトピックではなく、関心のある読者は、この方法の詳細な説明を提供する主要な出版物を参照することができます17、18、19、20、21、22。それにもかかわらず、全体的な理解を深めるために、電流誘発カルシウム過渡現象とともにL型カルシウム電流を測定するためのプロトコルに関する要約が提供されています。
<ol><li>筋細胞を細胞室に移し、37°Cの浴液で過溶します。</li>
	<li>表5に示すように、4-アミノピリジンと塩化バリウムを浴溶液に添加することにより、カリウム電流を遮断します。</li>
	<li>ホウケイ酸微小電極の先端抵抗がピペット溶液で満たされた2〜5MΩであることを確認してください(表6)。</li>
	<li>電気信号と落射蛍光の両方を同時に記録できるように測定を設定します。電圧クランプモードを使用して、セルを-80mVに保持し、600msのランプパルスを-40mVに保持して高速Na+電流を非アクティブ化し、続いて0.5Hzで+10mVまで100msのテストパルスを使用してL型Ca2+電流を測定します(図2)。</li>
	<li>488 nmで励起を使用し、&lt;520 nmで発光して検出し、[Ca 2+]I に変換すると仮定します <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61964/61964equ01.jpg"> ここで、kd = Fluo-3の解離定数(864 nM)、F = Fluo-3蛍光;Fmax=Ca2+-飽和蛍光は各実験19の終了時に得られた。</li>
</ol>

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<li>Hofhuis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysferlin+links+excitation-contraction+coupling+to+structure+and+maintenance+of+the+cardiac+transverse-axial+tubule+system%5BTitle%5D)+AND+%22Europace%22%5BJournal%5D)">Dysferlin links excitation-contraction coupling to structure and maintenance of the cardiac transverse-axial tubule system.</a> Europace. 22 (7), 1119-1131 (2020).</li>
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<li>Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+optical+action+potential+measurement+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiment%22%5BJournal%5D)">Single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Visual Experiment. , e61890(2020).</li>
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この記事では、カルシウム一過性記録を同時に行うパッチクランプ研究のために、同じマウスから高品質の心房筋細胞と心室筋細胞を取得する簡単で機能的な方法を提供します。得られたデータの品質は、細胞単離の品質に大きく依存します。上述のように、マウス心筋細胞を単離する多くの方法が以前に記載されている9、10、11、12。単離された細胞は、パッチクランプ実験から収縮性研究、形態学的研究、プロテオミクス、ミトコンドリア機能研究など、さまざまな分析に使用されます。個々の目的ごとに、異なる方法で最適化された単離されたセルが必要です。このため、どのプロトコルも、1匹のマウスからの心房筋細胞と心室筋細胞のカルシウム取り扱い特性を同時に測定するパッチクランプ実験に適した高品質の分離につながりませんでした。これを変えるために、前述の多数のプロトコルの適応により、このプロトコルが開発されました。機械的に困難なステ...

心不整脈は一般的であり、世界中の何百万人もの人々に影響を与えるため、現在の主要な医療課題の1つです。不整脈は高い罹患率と死亡率1,2に関連しており、心臓突然死の大部分の根本的な原因を表しています3。最新の治療選択肢は患者の生存率を向上させましたが、根本的なメカニズムを標的とするのではなく、依然として主に対症療法です。したがって、これらの治療法の有効性は限られており、重篤な副作用を引き起こすことがよくあります4,5,6。現在の治療オプションを改善するには、根底にある病態生理学への洞察が必要であり、研究に適したモデルの必要性が生じます。小動物モデル、特にマウスモデルは、細胞の電気生理学、イオンチャネル機能、カルシウム処理に対する遺伝的影響など、不整脈形成の重要なメカニズムを研究できるため、不整脈研究において重要な役割を果たします7,8。
この目的のために、十分な量および生存率の単離された心房および心室心筋細胞が必要とされる。心房および心室筋細胞を得るための幅広い異なる単離アプローチが以前に説明されており9、10、11、12、13であり、一部のグループは、心房14または心室15のいずれかからのL型電流およびカルシウム電流誘発カルシウム過渡の同時測定からのデータを提示している。マウス心筋細胞。しかし、私たちの知る限り、1匹の動物からの心房および心室測定のデータはありません。研究者は、電気生理学からプロテオミクス、細胞収縮性やタンパク質相互作用などの機能研究、ミトコンドリア機能、遺伝学に至るまで、単離された心筋細胞を必要とする幅広いトピックに焦点を当てています。したがって、公開されているプロトコルの多くはパッチクランプ研究用に特別に開発されておらず、パッチクランプ研究には収量が制限され、細胞品質が不十分です。したがって、1匹の動物から単離された心房細胞と心室細胞のパッチクランプとカルシウム過渡の同時測定は、確立されたプロトコルでは実行できません。
パッチクランプ実験のためのマウス、特に心房筋細胞の単離は依然として困難です。本稿では、逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流法により、高品質のマウス心房および心室筋細胞を単離するための簡単で迅速な方法を提供し、その後、1匹の動物からの正味の膜電流と電流誘発カルシウム過渡現象の両方を同時に測定することができます。この記事では、野生型マウスおよび遺伝子変異を有するマウスに由来する心房および心室筋細胞を単離するためのプロトコルについて詳述する。このプロトコルは、オスとメスのマウスに同様に使用できます。筋細胞単離、画像、および以下に説明する代表的な結果は、6(±1)ヶ月齢の野生型C57Bl/6マウスから得られた。それにもかかわらず、このプロトコルは、異なる遺伝子型を有する2〜24ヶ月の範囲の様々な年齢のマウスに首尾よく使用されている。 図1 は、分離セットアップと酵素灌流中のカニューレ心臓のクローズアップを示しています。

<table><tbody><tr><td>2,3-ブタンジオン一基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td></td></tr><tr><td>27G カニューレ</td><td>Servoprax</td><td>L10220</td><td></td></tr><tr><td>4-アミノピリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td></td></tr><tr><td>無水 DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>大動脈カニューレ</td><td>Radnoti</td><td>130163-20</td><td></td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td></td></tr><tr><td>鈍い外科用鉗子</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650915-4</td><td></td></tr><tr><td>牛の子牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12133C</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>循環温水浴</td><td>Julabo</td><td>ME</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington</td><td>LS994177</td><td></td></tr><tr><td>ディスシジョンハサミ</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>INS600124</td><td></td></tr><tr><td>DL-アスパルタット K+-塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1242</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン 5&prime;-三リン酸トリス塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>加熱コイル</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm</td><td>25.000 IE/5ml</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td></td></tr><tr><td>誘導室</td><td>CWE incorporated</td><td>13-40020</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Cp-pharma</td><td>1214</td><td></td></tr><tr><td>ジャケット付き心臓室</td><td>Radnoti</td><td>130160</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>メルク</td><td>1049360250</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>MgCl x 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 x 7H<サブ>2</サブ>O</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 x 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ (200 & micro;m)</td><td>VWR-ドイツ</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z331759</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>サーモフィッシャー</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>プルロン酸 F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>ローラーポンプ</td><td>Ismatec</td><td>ISM597D</td><td></td></tr><tr><td>surgical鉗子</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>INS650908-4</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>ケントサイエンティ</td>フィ<td>ック INS700540</td><td></td></tr><tr><td>縫合 シルク</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>NC9416241</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>メルク</td><td>Z683531-100EA</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>86330</td><td></td></tr></tbody></table>

ca2+過渡現象とl型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

マウスモデルは不整脈の研究において重要な役割を果たしており、イオンチャネル機能の変化やカルシウムの取り扱いなど、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することができます。この目的のために、パッチクランプ測定を行ったり、カルシウム取り扱い異常を探ったりするために、高品質の心房または心室心筋細胞が必要です。しかしながら、現在の単離プロトコルによって得られた高品質の心筋細胞の限られた収量は、同じマウスで両方の測定を可能にすることができない。この記事では、逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介して高品質のマウス心房および心室筋細胞を分離し、その後、1匹の動物からのカルシウム過渡現象とL型カルシウム電流を同時に測定する方法について説明します。マウスの心臓が得られ、大動脈を急速にカニューレに入れて血液を除去します。次に、心臓にカルシウムを含まない溶液(37°C)を灌流して、インターカレートされた椎間板のレベルで組織を解離させ、その後、カルシウムをほとんど含まない酵素溶液で細胞外マトリックスを破壊します(37°C)。消化された心臓はその後心房と心室に解剖されます。組織サンプルは細かく刻まれ、慎重に上下にピペッティングして溶解されます。酵素消化を停止し、細胞を生理学的カルシウム濃度まで段階的に再導入します。蛍光Ca2+指示薬をロードした後、単離された心筋細胞をカルシウム電流と過渡現象の同時測定用に調製します。さらに、分離の落とし穴が議論され、上記のように単離された心房および心室マウス筋細胞における同時カルシウム過渡測定を伴うパッチクランププロトコルおよびL型カルシウム電流の代表的な痕跡が提供されます。

単離収率は、カルシウム再導入後に10 μLの細胞懸濁液を顕微鏡スライド上にピペッティングすることによって決定されます。心房細胞単離の場合は100を超える生存可能な棒状の非収縮細胞/ 10 μL、心室細胞単離の場合は1,000を超える生存可能な棒状の非収縮細胞/ 10 μLが十分な収量と見なされ、一般的にこのプロトコルを使用して得られます。このプロトコルで得られた心房細胞は、心臓伝導系の細胞、特に洞結節、ならびに左右の心房および心房付属器からの異なる筋細胞を含む様々な異なる細胞型を示した。これらの領域は別々に解剖されないため、さまざまな細胞形態が得られます。すべての心房細胞は小さく、細胞容量は約35 pF〜100 pFの範囲であり、一部は他の細胞よりも糸状です。 図3 パネルAは、カルシウム感受性色素を負荷した心房作動心筋からの典型的な細胞を示し、このプロトコルで得られた測定の準備ができている。心室筋細胞はより棒状で大きく、細胞容量は100〜約400pFの範囲であり、 図3 のパネルBは、カルシウム感受性色素を負荷した作...

マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

パッチクランプおよびカルシウムイメージング実験は、労働集約的で時間がかかり、困難を伴います。このプロトコルは、高品質のマウス心房および心室心筋細胞を分離する便利な方法を提供し、パッチクランプ実験と同時に行われるカルシウムイメージングに適しています。このプロトコルの主な利点は、同じ動物から心房および心室心筋細胞を取得できることです。マウス心房筋細胞の単離は特に困難であり、以前の実験では制限要因となっていました。まず、ランゲンドルフ装置に灌流バッファーを事前に充填し、空気が入っていないことを確認します。大動脈カニューレを解剖顕微鏡で固定し、灌流バッファーを充填した1ミリリットルのシリンジで接続します。安楽死させたマウスから心臓を摘出した後、心臓を室温灌流緩衝液に入れ、顕微鏡下で鈍端針で大動脈をできるだけ早くカニューレ挿入します。縫合糸で心臓を針にしっかりと結び、注射器を外します。大動脈カニューレ挿入後、カニューレ挿入された心臓を直ちにランゲンドルフ装置に接続し、システムに空気が入らないようにします。.正確に摂氏37度で1分間、1分間、1分間4ミリリットルの灌流速度で心臓を灌流します。灌流から消化バッファーに切り替え、摂氏37度の温度と毎分4ミリリットルの灌流速度で正確に9分間灌流します。終了したら、消化された心臓を完全に覆うのに十分な消化バッファーを備えたシャーレに移します。次に、顕微鏡下で心房と心室を慎重に解剖します。心房を1.5ミリリットルの消化緩衝液を入れたシャーレに移し、心室を3ミリリットルの消化緩衝液を入れた別のシャーレに移します。鈍い鉗子を使用して、心房を慎重に、しかし迅速に小さな断片に引き離します。あらかじめチップの開口部を広げるためにカットした1000マイクロリットルのピペットチップで慎重にピペッティングして、組織を溶解します。溶液を15ミリリットルの遠心分離チューブに移し、チューブの側面をピペッティングして同量のストップバッファーを追加します。溶液の3ミリリットルすべてを200マイクロメートルのナイロンメッシュに通し、完全に消化されていない残りの大きな組織片を取り除きます。心室解剖を行うには、解剖ハサミや鉗子を使用して心室組織を細かく切り刻み、別の1000マイクロリットルのピペットチップでピペットを上下に動かして溶解します。細胞と組織溶液を15ミリリットルの遠心チューブに移し、チューブの側面に慎重にピペッティングして同量のストップバッファーを添加して反応を終了します。6ミリリットルの細胞溶液と組織溶液をすべて200マイクロメートルのナイロンメッシュに通し、完全に消化されていない大きな部分を取り除きます。心房細胞と心室細胞の懸濁液の両方を室温でベンチに6分間放置して沈殿させます。次に、チューブを5Gで2分間遠心分離します。プラスチック製のパスツールピペットを使用して上清を捨て、細胞ペレットを10ミリリットルのカルシウムを含まないチロード溶液に慎重に再懸濁します。心房細胞と心室細胞を沈降のために8分間放置します。心房細胞を5Gで1分間遠心分離します。次に、両方の細胞サンプルから上清を捨て、ペレットを100マイクロモルのカルシウムを含む10ミリリットルのTyrode溶液に慎重に再懸濁します。細胞を8分間放置して沈降させた後、心房細胞の遠心分離を繰り返します。上清を捨て、細胞ペレットを400マイクロモルカルシウムを含む10ミリリットルのTyrode溶液に慎重に再懸濁します。このプロセスをもう一度繰り返し、Tyrodeの溶液中の細胞を1ミリモルのカルシウムで再懸濁します。すべての心房細胞は小さく、細胞容量は約35〜100ピコファラドの範囲です。心房の働き心筋の典型的な細胞をここに示します。心室筋細胞はより棒状で大きく、細胞容量は100〜約400ピコファラドの範囲です。ここでは、1つの心房筋細胞と1つの心室筋細胞からの同時細胞質カルシウム過渡現象を伴うL型カルシウム電流測定の例を示します。このテクニックを試す前に、臓器摘出の練習をしてください。ステップが迅速に実行され、すべての組織カットが正しい位置で行われることが重要です。臓器摘出が再現可能な品質で行われる場合は、カニューレ挿入を完了するために少し時間をかけてください。このプロトコールで単離された細胞は、パッチクランプ測定に適しています。さらに、蛍光色素を充填することができるため、幅広いイメージング実験が可能です。

isolation-high-quality-murine-atrial-ventricular-myocytes-for

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

KVチャネル機能不全は、心臓不整脈に関連付けられています。我々はKvをチャネルの補助サブユニットのノックアウトマウスからの心房と心室の心筋細胞を単離するための体系的なプロトコルを利用するような不整脈を引き起こす分子メカニズムを研究するために。隔離された心筋細胞は、その後すぐに携帯電気生理学的研究、生化学的または免疫蛍光法（IF）のアッセイのために使用することができます。...

マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

我々は、細胞内Caために使用することができ、ヒト心房筋細胞の単離を記載...

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

心疾患の細胞に基づく現在の知識は、ほとんどの動物モデルの研究に依存しています。ここでは、説明し、人間の心室心筋の小さな外科的サンプルから単実行可能な心筋細胞を得るための新しい方法を検証する。ヒト心室筋細胞は、電気生理学的研究および薬物試験のために使用することができる。...

離と新鮮な外科的試料からのヒト心室の心筋細胞の機能解析

このプロトコルを記述する高時空分解能、膜電位のデュアル録音を含む光学マッピング システムを利用したマウスの心房の電気生理学的評価と Ca2...

高解像度光学マッピングとマウスの心房の電気生理学的評価

ここでは、保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから単一セル心房心筋細胞を分離するため、蛍光ベースの最適化手順をについて説明します。心腔の内圧の手動調節、機能そのまま心筋興奮収縮連関研究に適した屈する実装されます。...

保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから心房の心筋細胞の単離

このプロトコルは、チャンク消化アプローチを使用して、成人マウス心臓から単一の心筋細胞を単一の心筋細胞を分離するために使用される。このアプローチは、パッチクランプ研究で心房筋細胞電気生理学を特徴付けるために使用できる右または左心房筋細胞を単離するために使用されます。...

成体マウスからの心房筋細胞の単離

マウス筋細胞の単離の方法論と、同時デジタル細胞幾何学的測定と蛍光光光測定を用いたサルコメア短縮トレースと同時に電圧またはカルシウムの痕跡を得る方法を提示する。...

単離マウス心室筋細胞の光学イメージング

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

このプロトコルは、成体マウスからの心房および心室筋細胞の同時分離のための大歯カンヌレーションの深さを含むランゲンドルフ法の修飾を記述する。...

成体マウスからの心房と心室筋細胞の同時分離のためのランゲンドルフ法の改変

学ぶLangendorff灌流法によるマウス心房・心室筋細胞の高品質分離法。Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定が可能で、不整脈発生機構の研究に有用です。

^Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

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