Name: マウスにおけるガードネレラ膣膀胱曝露によって引き起こされる再発性大腸菌尿路感染症 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶマウスモデルによる再発性大腸菌尿路感染症のメカニズム。Gardnerella vaginalis曝露が膀胱内レザーバーからUPECを誘導する過程を解明し、女性の再発性UTI治療戦略開発に貢献する。

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著者らは、感染実験の技術支援をしてくれたLynne Foster、SEMへのアクセスについてワシントン大学セルアーイメージングセンター(WUCCI)のJames Fitzpatrick氏、UTI89kanR UPEC株についてScott Hultgren氏、原稿を批判的に読んだDavid Hunstad氏に感謝している。
この研究は、米国国立科学財団(VPO#DGE - 1143954の大学院研究フェローシップ)、ワシントン大学医学部の女性感染症研究センター(NMGへのパイロット研究賞)、米国心臓協会:#12POST12050583(NMG)および#14POST20020011(NMG)、および国立衛生研究所、NIAID:R01 AI114635(ALL)およびNIDDKの支援を受けました。 R21 DK092586 (すべて)、P50 DK064540-11 (SJH、プロジェクト III PI:ALL) および K01 DK110225-01A1 (NMG)動物実験のいくつかは、NCRR助成金C06 RR015502によって支援された施設で行われた。ワシントン大学細胞イメージングセンター(WUCCI;SEMが実施された場所)とMSJは、ワシントン大学医学部、ワシントン大学小児発見研究所、セントルイス小児病院(CDI-CORE-2015-505)、バーンズ・ユダヤ人病院財団(3770)、国立神経障害・脳卒中研究所(NS086741)の支援を受けた。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も持っていませんでした。

著者らは、この研究に関連する利益相反はないと宣言している。

このモデルの最初の重要なステップは、一次UTI期にUPEC細菌尿症をクリアしていないマウスを同定する。これらのマウスは、G.膣炎曝露後のUPEC細菌尿症の割合を混乱させるため、実験から除去する必要があります。最初のUPEC接種後、細菌クリアランスを監視するために毎週尿を採取する必要があります。C57BL/6マウスの約65~80%が4週間以内にUTI89kanR感染をクリアします。他の近交系マウス系統は、UPECクリアランス42,43およびリザーバ形成に対して異なる傾向を有し、したがって、このモデルには適していない可能性がある。第2の重要な点は、実証研究により、PBSのみに曝露された対照マウスで起こるバックグラウンド自然発生よりも有意な貯水池出現を引き起こすために、G.膣炎の2つの連続接種(12時間または1wk間隔のいずれか)が必要であることが決定されたことである。2つの連続露光の間の他の時間はテストされていないが、同様の結果をもたらす可能性がある。UPEC膀胱力価の低下は、G.膣炎曝露が1wk間隔39を与えられたモデルでのみ観察されたことに注意することが重要です。2回以上のばく露を投与することができるが、経験的証拠は、反復カテーテル検査のみで出現が増加することを示唆しており、その結果の解釈を混乱させるか、または曝露群と対照群の違いを区別するためにより多くの動物を必要とする可能性がある。最後に、in situ膀胱固定法にはいくつかの重要なステップがある。固定剤がクランプされた膀胱内に留まるようにするには、いくつかのスキルが必要です。収縮した膀胱はSEMでイメージングするのがより困難になります。固定剤含有カテーテルで尿路上皮を掻き取ると、G.膣炎によって引き起こされるものとは無関係に尿路上皮剥離を誘発することができるので、固定液を膀胱に接種するときは非常に穏やかであることも不可欠です。固定剤カクテルに記載されているすべての濃度は最終濃度です。これらの不適切な比率は、不十分な固定および細胞の腫脹または収縮をもたらし得る。固定液は、細胞および組織における温度ショックを避けるために生理学的温度に加温されるべきである。温暖化はまた、原形質膜を通る固定剤の拡散速度にわずかな改善をもたらす。SEM分析用に調製したサンプルではオスミウム染色を省略できることがよくありますが、臨界点乾燥時の脂質を安定化させ、細胞膜の亀裂を防ぐためには、このプロトコルで不可欠なステップです。
このプロトコルは、他のUPECおよび/または G.膣 炎株がリザーバを形成し、それらの出現を誘発する能力についてそれぞれ試験するために変更することができる。他の実験因子、例えば、他の膣細菌(例えば、 ラクトバチルス・クリスパトゥス PVAS100)または熱死 したG.膣炎への曝露なども加えることができ、いずれもこのモデルにおいて病理を実証していない39。試験する他の細菌株を選択する場合、標準的な接種物濃度をすべての実験で使用できるように、一貫した増殖を実証することが重要です。JCP8151BSmR の成長は、嫌気性チャンバー内で最適化されています。この株は嫌気性GasPakシステムで培養できる可能性が高いが、これには堅牢な細菌増殖を確実にするための最適化が必要である。最後に、モデル内の特定のステップのタイミングを変更できる場合があります。例えば、UPECリザーバ形成段階の早い時点で尿を収集して、CFUまたは宿主の応答を監視することができる。初期の時点(3、6、12hpi)で尿サンプルを採取することの感染の進行または貯水池の確立に対する悪影響は、このモデルでは観察されていない。UPECリザーバの出現は、2回のJCP8151BSmR 用量が12時間または1wk投与された後に起こることが報告されているが、他の時間間隔はまだ試験されていない。また、多くのマウスがこの時までに細菌尿症をクリアするので、UPECリザーバ形成段階を2週間(4週間ではなく)に減少させることによって、モデルの全期間を短縮することも可能であり得る。化学角質除去剤への膀胱曝露後のUPEC出現を調べる以前の研究は、1または2wkのUPECリザーバ形成段階17、18を使用した。しかし、UPEC細菌尿症のクリアランスの時間を減らすことは、より多くの動物を実験から淘汰する必要があるという犠牲を払って来るかもしれません。最後に、膀胱のSEM分析は、尿路上皮に対する G.膣 炎の効果の持続時間を観察するために、追加の時点で行うことができる。
トラブルシューティングに関しては、特に膀胱SEM分析に関していくつかの重要な考慮事項があります。使用されるマウスの背景および存在する炎症の量に応じて、いくつかの膀胱は非常に薄い壁で提示される。これらの膀胱は臨界点乾燥中によりカールする傾向があり、カウリーシェルのような形状をもたらす可能性がある。この場合、最良の方法は、カールした界面に沿って殻状の膀胱を半分に切断し、次に2回目に張り出した組織の大部分を除去することである。切断は、PTFEコーティングされた両刃のカミソリ刃で最適に機能します。過剰な脂肪は、オスミウム染色工程中に可溶化することがあります。これは、すすぎおよび脱水ステップ中に洗い流されない可能性があり、その後の乾燥中に膀胱表面に沈降する可能性がある不要な不溶性脂肪滴をもたらし得る。これらの液滴は、小さな球体またはサンプル上に散在する円盤状の構造として現れることがあります(図4D)。これは、できるだけ多くの脂肪組織が膀胱の周囲から除去されることを確実にすることによって緩和することができる。白金はイリジウムコーティングの代わりに使用できますが、細かい構造の詳細のマスキングを減らすために厚さを最小限に抑える必要があります。コーティング中に回転ステージを使用することを強くお勧めします。
このモデルの1つの制限は、多数のマウスを必要とすることである。C57BL/6マウスの65~80%のみがUPEC細菌尿症をクリアし 、その後のG.膣炎 またはPBS接種に適している( 図2C参照)。1群あたり10〜12匹のマウス(G.膣炎 接種対PBS)を得るためには、〜30匹のマウスを最初にUPECに感染させるべきである。さらに、統計的有意性を検出するために必要な生物学的複製を達成するためには、複数の実験が必要になる可能性が高い。ばく露を1wk間隔で行った場合、UPECの出現はPBSにばく露されたマウスの14%で発生した(図3B)。したがって、PBS対照(0.8で動力を与えられた;α=0.05[片側])と比較して 、G.膣炎 ばく露マウスにおけるUPEC rUTIの有意な増加を検出するには、各ばく露群について少なくとも40匹のマウスの累積合計を試験する必要がある。追加の考慮事項は、これらの実験が高価で労働集約的であるということです。マウスはUPECクリアランスについて毎週監視する必要があり、実験の時間経過は 、G. vaginalis が12時間の時間枠で2回与えられるか、または1wk間隔で2回与えられるかに応じて4〜5wkである。SEMは労働集約的であり、顕微鏡の可用性とサービス料によってはコストがかかる場合があります。SEM用に膀胱全体を準備すると、分析のための豊富な材料が提供されますが、欠点は、各膀胱の分析に時間がかかる可能性があることです。したがって、尿および組織力価に使用されるより高い動物数と比較して、限られた数の膀胱しかSEMによって分析できない可能性が高い。さらに、膀胱「カップ」の曲面の高品質の画像を得るには、視認性を妨げる可能性のある影のためにスキルが必要です。膀胱SEMは尿路上皮剥離を視覚化するための有用なツールであるが、この方法は主に定性的である。試料は丸く固定されており、また固定液にグルタルアルデヒドを使用しているため、蛍光発現菌を光学顕微鏡でスクリーニングすることはできない。免疫染色および化学染料は、ほとんどの抗原およびオスミウムを架橋し、抗原部位をマスクし、組織を暗くするグルタルアルデヒドの使用のために、このプロセスと互換性がない。つまり、SEM技術は、細胞サイズ48、49などの追加のプローブを使用せずに定量的に評価できるパラメータに有用です。
このモデルには、前述の方法以外にもいくつかの利点があります。これは、外部源から膀胱への再導入とは対照的に、膀胱リザーバからの出現によって引き起こされるUPEC rUTIのメカニズムの検討を可能にする。膀胱貯留層からの出現によるrUTIの他のモデルは、化学薬品(硫酸プロタミンまたはキトサン)を使用して尿路上皮剥離を引き起こし、17,18、これは女性のrUTIの引き金にはならない。G.膣炎は、一部の女性においてカテーテル法または恥骨上吸引を介して膀胱から直接収集された尿中に検出された一般的な泌尿生殖器細菌である23,26。この事実は、BV(G.膣炎が膣内で過剰に増殖する)とUTIとの間の既知の関連と相まって、G.膣炎がrUTIの臨床的にもっともらしい引き金であることを示唆している。最後に、in situ膀胱固定法は、膀胱の超構造を維持し、損傷を制限し、膀胱層が互いに分離しないようにする。尿路上皮を視覚化するための以前の方法は、伝統的に、使用者が無菌的に膀胱を収穫し、二等分し、伸ばし、そして伸ばして、伸ばした膀胱を固定液48に沈める前に、解剖トレイ上に膀胱をピン留めする。この方法は、非常に平坦なサンプルをもたらすが、組織の均一または自然なストレッチを保証せず、過度および下回るストレッチされた領域(非常にしわのある組織をもたらす)をもたらし、膀胱層分離を引き起こす可能性がある。さらに、組織を伸ばして固定するための膀胱のこれらの物理的操作は、尿路上皮剥離を含む損傷を引き起こす可能性がある。別の方法は、パラフィンに包埋し、ミクロトームで薄い切片を得る前に、無傷の膀胱を固定液に沈めることである。薄い切片は、細菌および宿主タンパク質の局在を調べるための免疫組織化学実験にとって非常に貴重ですが、薄い切片では尿路上皮表面の可視化はできません。このSEM法は、膀胱全体の表面を一度に検査することを可能にする。
記載されているように、このモデルの将来の用途には、他のUPEC株を試験して細胞内リザーバを形成するかどうかを判断し、他の G.膣 炎株を試験して剥離を誘発し、UPEC出現がrUTIを引き起こすかどうかを評価することが含まれる。C57BL/6マウス以外の他のマウス系統も試験され得るが、慢性膀胱炎を発症する傾向が高いマウス(C3Hバックグラウンドのマウスなど)は、実験から淘汰される必要があるマウスが多すぎるため、推奨されない。C57BL/6マウスのさらなる利点は、多くの遺伝子ノックアウト株が市販されていることである。このような株は、貯留層の形成および/または出現に関与する宿主因子を尋問する機会を提供する。

尿路感染症(UTI)は世界中で大きな医療負担を課しており、毎年何百万人もの人々、特に女性の生活の質に影響を与えています1。尿路病原性大腸菌(UPEC)は、UTI1の最も頻繁な原因である。UTIを発症する多くの患者(約20〜30%)は、抗生物質媒介性の初期感染のクリアランスにもかかわらず、6ヶ月以内に再発性UTI(rUTI)を経験する2。残念なことに、閉経前の女性の5%が毎年3つ以上のrUTIに苦しんでいます3,4。rUTIの逐次エピソードは、インデックスケース5、6、7、8からの同じUPEC株の持続性によって引き起こされ得る。ヒトサンプルおよびマウスモデルからのデータは、同じ株rUTIが、膀胱内の静止リザーバ内に存在するUPECによって引き起こされる可能性があることを示唆している。ヒトにおいて、UPECは、UTI 9、10、11、12、13を有する患者の上皮細胞および膀胱生検において検出された。C57BL/6マウスの研究では、UPECの一部の株が、蛍光顕微鏡検査および膀胱組織の均質化および培養によって検出されるように、膀胱内に静止期の細胞内貯留層を確立できることが実証されており、それらは細菌尿症の分離後数ヶ月間維持される14,15,16。膀胱上皮(尿路上皮)の剥離を誘導する薬剤、例えば硫酸プロタミン17またはキトサン18による膀胱の治療は、リザーバからのUPECの出現を誘発してrUTIを引き起こす。これらのデータは、以前の感染から膀胱UPECリザーバーを保有している女性において、尿路上皮剥離につながる膀胱曝露がrUTIを引き起こす可能性があることを示唆している。
膣内微生物叢が尿路感染症に寄与しているという証拠が山積みです19,20。ガードネレラ膣炎は、膣および尿中微生物叢の両方の頻繁なメンバーである21、22、23、24、25、26、27、28、29。膣内では、高レベルのG.膣炎の存在は、細菌性膣炎(BV)として知られる微生物嚥下障害と関連しており、これは女性の〜30%に影響を及ぼす30、31、32。BVを有する女性は、ラクトバチルス33,34,35,36,37が支配する膣内コミュニティを有する女性と比較して、UTIを経験するリスクが高い。マウスモデルでは、G.膣は、膣38および膀胱39の両方において上皮剥離を引き起こす。UPEC膀胱リザーバを保有するC57BL/6マウスでは、G.膣炎への2回の連続した膀胱曝露(PBSにはない)は、リザーバからのUPECの再出現をもたらし、UPEC rUTIを引き起こした。この出現は、以前にUPEC細菌尿症を解消したマウスからの尿中のUPEC力価の出現と、その後のPBS曝露対照動物と比較して犠牲時のUPEC膀胱ホモジネート力価の低下によって証明される39。興味深いことに、膀胱内のG.膣炎による永続的なコロニー形成はない。大多数の症例において、尿中の生存可能なG.膣炎のそれぞれが12(h)未満を有する2つの短時間曝露は、尿路上皮剥離を誘発し、rUTIを促進するのに十分である。
このプロトコルは、再発を誘発するために G.膣膀 胱接種を使用して、細胞内膀胱リザーバに常駐するUPECによって引き起こされるrUTIのマウスモデルを記述する。このモデルによって達成された進歩は、 G.膣炎 が以前に使用された化学薬品と比較してrUTIの臨床的に関連する生物学的トリガーであるということです。さらに、マウス尿路における G.膣 炎の比較的短命な生存は、性活動の後に起こり得るように、尿路上皮に対する一過性の微生物曝露の影響を調べることを可能にする。rUTIモデルの概要を説明することに加えて、このプロトコルは、走査型電子顕微鏡(SEM)による尿細胞診およびin situ膀胱固定および尿路皮のイメージングのための方法も記載する。
G.膣炎誘発再発性UPEC UTIのこのプロトコールは、カナマイシン耐性カセット(UTI89kanR)40を有するUPEC株UTI89を使用する。試験したUPECのすべての株がマウス41の急性感染期に細胞内細菌群集を形成できたわけではなく、UPECのすべての株が潜伏細胞内リザーバを形成する能力を有するかどうかはまだ分かっていない。リザーバの形成は、モデル内の他のUPEC株を使用する前に確認する必要があります。このプロトコルは、自発的なストレプトマイシン耐性G.膣炎単離物JCP8151BSmR38を使用する。JCP8151BSmRによるrUTIの誘導は、12時間または7日(d)離れて39のいずれかを与えられた2つの連続したG.膣炎接種を必要とする。他のG.膣炎株が剥離および/またはUPEC rUTIを誘導するかどうかは、このモデルで決定されるままである。抗生物質を寒天プレートに添加して、感染を監視するためのコロニー形成単位(CFU)の列挙を妨げる可能性のある内因性マウス微生物叢の増殖を防ぐために寒天プレートに添加できるため、既知の抗生物質耐性を有するUPECおよびG.膣炎株(UPECのカナマイシンまたはスペクチノマイシン、G.膣炎のストレプトマイシンなど)を使用することが不可欠です。マウスの尿には、抗生物質を含まない培養プレート上で過剰増殖する可能性のある他の細菌が頻繁に含まれているため、これは尿検体の培養に特に重要です。マウス尿中のこれらの内因性細菌の起源は不明であるが、尿採取中に拾われた尿道周囲および泌尿生殖器細菌を反映している可能性が高い。
G.膣炎は通性嫌気性細菌であり、したがって、このプロトコルは、嫌気性チャンバー内で成長するG.膣炎JCP8151BSmRを記載する。嫌気性チャンバが利用できない場合、嫌気性成長条件を維持するための他の方法(気密容器内のGasPakパウチなど)を利用することができる。あるいは、G.膣炎のいくつかの株(JCP8151BSmRを含む)は、標準的な組織培養インキュベーター(5%CO2)中で増殖するであろう。JCP8151BSmR以外のG.膣炎株を使用するには、細菌がこのモデルで同様に振る舞うことを確認するための試験が必要であるのと同様に、増殖条件を変えるには、所望の生存可能な接種濃度を達成するために、培養のための理想的な持続時間(プレート上および液体中)および光学密度(OD)600当量の経験的決定が必要である。さらに、成長状態がG.膣炎の病態生物学に影響を与えるかどうかは知られていない。
最後に、このモデルを利用するかどうかを検討する際には、研究者は、一般的なUTIマウスモデルよりもグループごとにより多くの動物を必要とする可能性があることに注意する必要があります。これは、rUTIの誘導が、マウスが膀胱の初期感染によって引き起こされるUPEC細菌尿症を解決することを必要とするためである。したがって、細菌尿症(通常は進行中の腎臓感染を示す表現型)をクリアできないマウスは、プロトコルのrUTIフェーズには含まれません。これらの研究に電力を供給するために必要なマウスの数は、尿中への「自発的」UPEC出現の割合(平均で12〜14%)によっても影響される。最後に、異なるマウス系統は、細胞内貯留層形成に対して慢性細菌尿症を発症する傾向が異なる42,43。このモデルでC57BL/6以外のマウス株を使用する場合、動物が静止UPEC細胞内リザーバを発達させることを確認しなければならない。

<table><tbody><tr><td>30G x 1/2 針</td><td>BD カテーテル用</td><td>BD</td><td>305106</td></tr><tr><td>5 1/2" ストレート鉗子止血器</td><td>マッケソン</td><td>487377</td><td>in situ 膀胱固定</td></tr><tr><td>ACE 600 スパッタコーター</td><td>ライカ</td><td></td><td>SEM サンプル処理</td></tr><tr><td>アルミニウム SEM スタブ</td><td>テッド ペラ</td><td>16111</td><td>SEM サンプル処理</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>EMS</td><td>12340</td><td>in situ膀胱固定</td></tr><tr><td>導電性カーボン接着剤タブ&nbsp;</td><td>テッドペラ</td><td>16084-1</td><td>SEMサンプル処理</td></tr><tr><td>導電性銀塗料</td><td>テッドペラ</td><td>16034</td><td>SEMサンプル処理</td></tr><tr><td>CPD 300 クリティカルポイントドライヤー</td><td>ライカ</td><td></td><td>SEMサンプル処理</td></tr><tr><td>サイトファンネル 金属クリップ</td><td>Simport</td><td>M964B</td><td>細胞紡績尿検査</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>EMS</td><td>15050</td><td>SEMサンプル処理</td></tr><tr><td>グルコース&nbsp;</td><td></td><td>NYCIII G. vaginalis増殖培</td>地グルタルアルデヒド EMS 16320in situ膀胱固定用シグマ <td>G7528</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hema 3 染色キット</td><td>フィッシャー</td><td>23123869</td><td>細胞回転尿検査</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td></td><td>NYCIII G. vaginalis 成長培地</td></tr><tr><td>イリジウム</td><td>テッド ペラ</td><td>91120</td><td>SEM サンプル処理</td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td></td><td></td><td>マウス麻酔カナ</td></tr><tr><td>マイシン</td><td>Gibco</td><td>11815024</td><td>UPEC LB 選択プレート (50 ug/mL)</td></tr> <tr><td>Luria-Bertani 寒天</td><td>BD</td><td>DF0445174</td><td>UPEC 成長プレート</td></tr><tr><td>用Luria-Bertani ブロス</td><td>BD</td><td>DF0446173</td><td>UPEC 成長培地</td></tr><tr><td>Merlin FE-SEM</td><td>Zeiss</td><td></td><td>走査型電子顕微鏡</td></tr><tr><td>Milli-Q 浄水器</td><td>Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>SEM サンプル処理</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>NYCIII G. vaginalis成長培地用</td><td>シグマ</td><td>S3014</td></tr><tr><td>オリンパス バノックス AHBT3顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td>サイトスピン尿検査</td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>EMS</td><td>19170</td><td>SEM サンプル処理</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>in situ 膀胱固定</td></tr>ポリエチレン<tr><td>チューブ</td><td>Intramedic</td><td>427401</td><td>カテーテル用</td></tr><tr><td>プロテオースペプトン#3&nbsp;</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>DF-122-17-4</td><td>NYCIII用DF-17-4 G. vaginalis成長培地</td></tr><tr><td>PTFEコーティングダブルエッジカミソリブレード</td><td>EMS</td><td>72000</td><td>SEM用ブラダー</td></tr><tr><td>シャンドン サイト遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィ</td>ック <td>A78300002</td><td>サイトスパン尿検査</td></tr><tr><td>シャンドンサイトファン</td>ネルフィルター <td>Simport</td><td>M965FWDV</td><td>サイトスパン尿検査</td></tr><tr><td>シャンドンダブルサイトファンネル</td><td>Simport</td><td>M964-1D</td><td>サイトスピン尿検査</td></tr><tr><td>シャンドンダブルサイトスライド (コーティング)</td><td>Thermo Scientific</td><td>5991055</td><td>サイトスピン尿検査</td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム三水和物</td><td>EMS</td><td>12310</td><td>in situ 膀胱固定</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td><td>細菌 OD600</td></tr><tr><td>ストレプトマイシン</td><td>の測定 Gibco</td><td>11860038</td><td>G. vaginalis NYCIII選択プレート(1 mg / mL)</td></tr><tr>カテーテル<td>用</td><td>ツベルクリンスリップチップシリン</td>ジ<td>BD</td><td>309659</td></tr>酵母<tr><td>抽出物&nbsp;</td><td>NYCIII G. vaginalis 成長培地用</td> <td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td></tr></tbody></table>

マウスにおけるガードネレラ膣膀胱曝露によって引き起こされる再発性大腸菌尿路感染症

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

尿路原性 大腸 菌(UPEC)によって引き起こされる再発性尿路感染症(rUTI)は一般的であり、費用がかかる。雄および雌マウスにおけるUTIのモデルを説明する以前の記事は、尿および組織における細菌接種および列挙の手順を例示してきた。C57BL/6マウスにおける初期膀胱感染の間、UPECは、UPEC細菌尿症のクリアランス後に持続する膀胱上皮細胞内に潜伏リザーバを確立する。このモデルは、これらの研究に基づいて、潜伏膀胱貯留層内からのUPECの出現によって引き起こされるrUTIを調べる。泌尿生殖器細菌 ガードネレラ膣炎 は、特にUTIに関連する膣嚥下障害の文脈で、女性の泌尿生殖路に頻繁に存在するため、このモデルでrUTIのトリガーとして使用されます。さらに、膀胱組織の走査型電子顕微鏡(SEM)分析に続くin situ膀胱固定のための方法も記載されており、膀胱を含む他の研究への応用の可能性を秘めている。

接種後、UPEC力価は尿中で検出可能である(図2B)。カナマイシンを含む選択培地に尿サンプルをプレートしないと、尿を汚染する内因性マウス微生物叢の過剰増殖が生じる可能性があります。UPEC細菌尿症のレベルは、1日目に高くなる可能性が高く、最初の1週間に増加してから、後の時点で減少する可能性があります(図2C)。マウスの約65〜80%は、尿中に検出可能なUPECを28dpiずつ有さない(図2C、緑色の円)。これらのマウスは、モデルの後続のステップで使用することができる。細菌尿症のままのマウス(図2C、赤い楕円)は、実験から排除されるべきである。
12時間(図3A)または1wk間隔(図3B)で2回の連続したG.膣炎曝露は、細胞内貯留層からのUPECの出現をもたらし、再発性細菌尿症を引き起こす。UPEC細菌尿症のレベル(Mann-Whitney試験)およびUPEC rUTIを示すマウスの割合(フィッシャーの正確検定)は、PBS対照群と比較してG.膣炎に曝露されたマウスにおいて有意に高い。尿細胞診解析は、UPEC出現を示したG.膣炎ばく露マウスから尿中のPMNを検出する(図3C)。1 wk間隔で2回のばく露を行ったモデルでは、膀胱組織中のUPEC力価は、G. 膣炎ばく露マウスではPBSと比較して低くなっている(図3D)が、おそらく貯水池からのUPECの出現とその後のクリアランスによるものである。
SEMによるin situ固定膀胱組織の可視化は、PBSのみに曝露された対照マウスにおいて膀胱表面を覆う大きな表在傘尿路上皮細胞を明らかにする(図4A)。尿路剥離は、表在性傘細胞の喪失によって証明され、 G.膣 炎に曝露されたマウスにおいて、より小さな根底にある移行上皮細胞を明らかにする(図4B)。細胞内貯留層の確立中のUPEC接種後早期に、UPECは尿路上皮上および剥離細胞からフィラメンテーションで見える(図4C)。

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig02.jpg"> 図2.フェーズ1(貯水池形成)中の尿中のUPEC力価のモニタリング。 (A)コロニー形成単位(CFU)めっきの概略図。(B)LB+カナマイシンの尿中のUPEC力価の代表的な画像。黒丸は、CFU/mLを計算するためにカウントする必要がある尿サンプルスポットを示します。(C)C57BL/6マウスにおけるUPEC細菌尿症の経時変化。各線は個々のマウスを表し、UPEC尿力価を経時的にたどります。点線は検出限界(1000CFU/mL)を示す。赤い楕円は、UPEC細菌尿症の解決に失敗した4匹のマウス(20匹中)を示し、したがって G.膣炎誘発rUTIモデルには使用されないであろう。逆に、緑色の円は、UPEC細菌尿症を解消し、その後の段階に進んだマウスを示す。(D)パネルC.イエロー、検出可能なCFUのグラフを生成するために使用されるデータのテーブル。緑、CFUなし。(E)UPEC CFUが尿中で検出されなくなった時点に基づく曝露群へのマウスの無作為化(「解決日」)。パネル D の左側の列のマウス番号は、パネル E で指定したマウス番号と同じです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig03.jpg"> 図3. G. 膣炎は UPEC rUTI をトリガーします。 12時間(A)または1wk(B)の間隔でPBS(円)または G.膣 炎(Gvag;正方形)への2つの連続した尿路曝露後の尿中のUPEC力価。各シンボルは個々のマウスを表します。2回目のばく露後1〜3 dの間に各マウスから検出された最も高いCFU/mL UPECがプロットされます。検出可能な細菌尿症を有さないマウスは、検出限界(点線)でプロットされる。(c)UPEC(矢じり)および多形核(PMN)細胞(矢印)を示す尿細胞診解析。スケールバー = 20 μm。(d)1wk間隔で与えられた2つの連続した尿路曝露に続いて3dを採取した膀胱組織におけるUPEC力価。各シンボルは異なるマウスを表し、ゼロは検出限界(点線)にプロットされます。A、B、およびDでは、ボックスは中央値がマークされ、最小から最大までのひげが付いた第1および第3四分位数にあり、Mann-Whitney U検定* P &lt;0.05;** P &lt; 0.01; P &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61967/61967fig04.jpg"> 図4.その場で固定された膀胱のSEM分析。 膀胱を、PBS(A)または G.膣 炎(C)に2回(12時間間隔)曝露してから3時間後にマウスから採取した。点線は単一の尿上皮細胞を示しており、大きな表在細胞が剥離して根底にある移行上皮を明らかにしているため、 G.膣に露出した膀胱では小さくなっています。(b)UPECによる初期接種後6時間後に採取した膀胱、モデルのフェーズ1の間、尿路上皮剥離および細胞外UPECを示す。(d)膀胱表面に存在する不溶性脂肪滴の例。スケールバーは、メイン画像で20μm、インセットで2μmです。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61967/61967fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

尿路病原性 大腸菌 (UPEC)経尿道接種のマウスモデルにより、潜伏細胞内膀胱リザーバを確立し、その後の再発性UPEC UTIを誘導するための G.膣への膀胱 曝露が実証される。また、細菌の列挙、尿細胞診、および走査型電子顕微鏡のためのin situ膀胱固定および処理も実証されている。

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

再発性尿路感染症は深刻な健康問題です。このプロトコルは、泌尿生殖器細菌への短時間の曝露がどのように膀胱に損傷をもたらし、大腸菌の再発性尿路感染症を引き起こすかを理解するのに役立ちます。このモデルの利点は、膀胱の剥離と再発性尿路感染症が、尿路生殖器細菌であるガードネレラ膣によって引き起こされることです。まず、G.vaginalis株をマイナス80°Cの冷凍庫ストックから嫌気性チャンバーに循環させます。抗生物質なしでNYCIIIプレートに細菌をストリークします。プレートを摂氏37度で24時間嫌気的にインキュベートします。嫌気性チャンバー内で、5ミリリットルの嫌気性NYCIII培地にNYCIIIプレートからの細胞で満たされた1マイクロリットルのループを接種し、嫌気性条件下で37°Cで18時間静的に培養します。増殖培地に抗生物質を含めないでください。分光光度計を使用して培養物のOD600を決定します。次に、Gの9,600倍で1分間遠心分離し、培地を吸引します。PBS中の細菌ペレットを所望の濃度に再懸濁し、接種物を連続希釈してプレートします。フィルターが取り付けられたサイトファンネルカセットで、10マイクロリットルの尿を90マイクロリットルのPBSに加えます。スライド式でカセットを細胞遠心分離機に入れ、Gの600〜800倍で6分間、高加速で回転させます。スライドを取り出して一晩乾燥させた後、血液染色キットでスライドを染色し、光学顕微鏡でPMNと上皮細胞の存在について分析します。ツベルクリンスリップチップシリンジを固定剤でしたら、シリンジのマーキングの反対側を向いて、端にカテーテルを貼り付けます。針の先端が露出しないように注意しながら、針の端から1〜2ミリメートルの余分なチューブを切り取ります。シリンジをフリックして気泡を取り除き、プランジャーを押して空気を空にします。次に、マイクロ遠心チューブの上にカテーテルに固定剤を充填します マウスに麻酔をかけて犠牲にした後、脚が固定されたら、鉗子と手術用ハサミでマウスの骨盤領域を開き、膀胱を露出させます。隣接する脂肪を慎重に脇に押しますが、膀胱はそのままにしておきます。針を下に向けて利き手でシリンジを持ちます。カテーテル先端を滅菌潤滑剤に浸し、カテーテル先端を尿道開口部に配置し、シリンジバレルをマウス本体に対して30〜45度の角度で保持します。時計回りに少し動かして下向きの圧力をかけ、カテーテルを尿道にそっと挿入します カテーテルの先端が入ったら、シリンジをマウスの尾に向けてヒンジで固定し、シリンジのバレルが作業面と平行になるまでカテーテルを尿道にさらにスライドさせ続けます。カテーテルの針軸全体がマウスに入り、カテーテルの先端が膀胱内腔内に配置されます。50〜80マイクロリットルの固定剤をゆっくりと送達し、膀胱を風船のように膨らませます。カテーテルを所定の位置に保持し、シリンジを少し持ち上げて、先端を上に傾けます。もう一方の手で止血器を開き、尿道の交差点で片方のプロングをカテーテル針の下にスライドさせます。止血器が針に接触するまで、止血器を部分的に閉じます。カテーテル針を膀胱からそっとスライドさせながら、同時に止血剤を完全に締め付けてロックし、固定剤の損失を防ぎます。止血剤を握って、膀胱を上にして作業面と平行になるようにします。止血剤の下をそっと慎重に切り取り、止血剤を取り付けたまま膀胱を取り出します。膀胱と取り付けられた止血剤を、温めた固定剤が入ったファルコンチューブに入れます。膀胱が液体に完全に沈んでいて、チューブの壁に押し付けられていないことを確認してください。走査型電子顕微鏡で膀胱を画像化するには、清潔な両面カミソリの刃またはメスで矢状に二等分し、止血器に接する方向に2番目のカットを行って膀胱を解放します。これにより、2つのハーフブラダーカップが得られます。膀胱の外側に脂肪パッドが残っている場合は、そっと取り除きます。膀胱の半分をカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回すすぎます。.0.15モルのカコジル酸緩衝液中の1%四酸化オスミウムで組織を室温で1時間染色します。このステップは、暗い環境を維持するために、染色容器をホイルで包んだ状態で行ってください。染色後、膀胱の半分を超純水で3回すすいでください。浸透油が水面に見られる場合は、乾燥ステップ中の汚染を防ぐために、吸引または吸い上げます。組織を脱水した後、きれいな両面カミソリで膀胱の半分を二等分し、合計4つのピースを生成します。接種後、尿中にUPEC力価が検出されます。UPEC細菌の尿のレベルは初日に高く、最初の1週間で増加し、その後の時点で減少する可能性があります。マウスの約65〜80%は、接種後28日までに尿中にUPECが検出されません。これらのマウスは、モデルの後続のステップで使用できます。細菌性のままのマウスは実験から除外する必要があります。12時間または1週間の間隔を空けて2回連続してG.vaginalisに曝露すると、細胞内リザーバーからUPECが出現し、再発性細菌尿症を引き起こします。尿細胞診解析は、UPECの出現が表示されたG.Vaginalis曝露マウスの尿中の多形核細胞を検出するために使用できます。1週間間隔で2回のばく露を行ったモデルでは、膀胱組織のUPEC力価は、おそらくリザーバーからのUPECの出現とその後のクリアランスにより、G.vaginalisにばく露されたマウスでPBSと比較して低くなっています。SEMによるin situ固定膀胱組織の可視化により、PBSのみに曝露された対照マウスの膀胱表面を覆う大きな表在性の傘状尿路上皮細胞が明らかになります。尿路上皮の剥離は、表在性の傘細胞の喪失によって証明され、G.vaginalisに曝露されたマウスでは、より小さな下にある移行上皮が明らかになります。UPEC接種後早期、細胞内リザーバーの確立中に、細菌細胞が尿路上皮上に見え、剥離細胞からフィラメント状に形成されます。ここで説明した方法は、追加のガードネレラ株または他の泌尿生殖器種が大腸菌rUTIに及ぼす影響を調査するための将来の研究への道を開きます。

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Research

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