マウスにおけるガードネレラ膣膀胱曝露によって引き起こされる再発性大腸菌尿路感染症

再発性尿路感染症は深刻な健康問題です。このプロトコルは、泌尿生殖器細菌への短時間の曝露がどのように膀胱に損傷をもたらし、大腸菌の再発性尿路感染症を引き起こすかを理解するのに役立ちます。このモデルの利点は、膀胱の剥離と再発性尿路感染症が、尿路生殖器細菌であるガードネレラ

まず、G.vaginalis株をマイナス80°Cの冷凍庫ストックから嫌気性チャンバーに循環させます。抗生物質なしでNYCIIIプレートに細菌をストリークします。プレートを摂氏37度で24時間嫌気的にインキュベー

嫌気性チャンバー内で、5ミリリットルの嫌気性NYCIII培地にNYCIIIプレートからの細胞で満たされた1マイクロリットルのループを接種し、嫌気性条件下で37°Cで18時間静的に培養します。増殖培地に抗生物質を含めないでください。分光光度計を使用して培養物のOD600を決定します。

次に、Gの9,600倍で1分間遠心分離し、培地を吸引します。PBS中の細菌ペレットを所望の濃度に再懸濁し、接種物を連続希釈してプレートします。フィルターが取り付けられたサイトファンネルカセットで、10マイクロリットルの尿を90マイクロリットルのPBSに加えます。

スライド式でカセットを細胞遠心分離機に入れ、Gの600〜800倍で6分間、高加速で回転させます。スライドを取り出して一晩乾燥させた後、血液染色キットでスライドを染色し、光学顕微鏡でPMNと上皮細胞の存在について分析します。ツベルクリンスリップチップシリンジを固定剤でしたら、シリンジのマーキングの反対側を向いて、端にカテーテルを貼り付けます。

針の先端が露出しないように注意しながら、針の端から1〜2ミリメートルの余分なチューブを切り取ります。シリンジをフリックして気泡を取り除き、プランジャーを押して空気を空にします。次に、マイクロ遠心チューブの上にカテーテルに固定剤を充填します マウスに麻酔をかけて犠牲にした後、脚が固定されたら、鉗子と手術用ハサミでマウスの骨盤領域を開き、膀胱を露出させます。

隣接する脂肪を慎重に脇に押しますが、膀胱はそのままにしておきます。針を下に向けて利き手でシリンジを持ちます。カテーテル先端を滅菌潤滑剤に浸し、カテーテル先端を尿道開口部に配置し、シリンジバレルをマウス本体に対して30〜45度の角度で保持します。

時計回りに少し動かして下向きの圧力をかけ、カテーテルを尿道にそっと挿入します カテーテルの先端が入ったら、シリンジをマウスの尾に向けてヒンジで固定し、シリンジのバレルが作業面と平行になるまでカテーテルを尿道にさらにスライドさせ続けます。カテーテルの針軸全体がマウスに入り、カテーテルの先端が膀胱内腔内に配置されます。50〜80マイクロリットルの固定剤をゆっくりと送達し、膀胱を風船のように膨らませます。

カテーテルを所定の位置に保持し、シリンジを少し持ち上げて、先端を上に傾けます。もう一方の手で止血器を開き、尿道の交差点で片方のプロングをカテーテル針の下にスライドさせます。止血器が針に接触するまで、止血器を部分的に閉じます。

カテーテル針を膀胱からそっとスライドさせながら、同時に止血剤を完全に締め付けてロックし、固定剤の損失を防ぎます。止血剤を握って、膀胱を上にして作業面と平行になるようにします。止血剤の下をそっと慎重に切り取り、止血剤を取り付けたまま膀胱を取り出します。

膀胱と取り付けられた止血剤を、温めた固定剤が入ったファルコンチューブに入れます。膀胱が液体に完全に沈んでいて、チューブの壁に押し付けられていないことを確認してください。走査型電子顕微鏡で膀胱を画像化するには、清潔な両面カミソリの刃またはメスで矢状に二等分し、止血器に接する方向に2番目のカットを行って膀胱を解放します。

これにより、2つのハーフブラダーカップが得られます。膀胱の外側に脂肪パッドが残っている場合は、そっと取り除きます。膀胱の半分をカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回すすぎます。.

0.15モルのカコジル酸緩衝液中の1%四酸化オスミウムで組織を室温で1時間染色します。このステップは、暗い環境を維持するために、染色容器をホイルで包んだ状態で行ってください。染色後、膀胱の半分を超純水で3回すすいでください。

浸透油が水面に見られる場合は、乾燥ステップ中の汚染を防ぐために、吸引または吸い上げます。組織を脱水した後、きれいな両面カミソリで膀胱の半分を二等分し、合計4つのピースを生成します。接種後、尿中にUPEC力価が検出されます。

UPEC細菌の尿のレベルは初日に高く、最初の1週間で増加し、その後の時点で減少する可能性があります。マウスの約65〜80%は、接種後28日までに尿中にUPECが検出されません。これらのマウスは、モデルの後続のステップで使用できます。

細菌性のままのマウスは実験から除外する必要があります。12時間または1週間の間隔を空けて2回連続してG.vaginalisに曝露すると、細胞内リザーバーからUPECが出現し、再発性細菌尿症を引き起こします。尿細胞診解析は、UPECの出現が表示されたG.Vaginalis曝露マウスの尿中の多形核細胞を検出するために使用できます。

1週間間隔で2回のばく露を行ったモデルでは、膀胱組織のUPEC力価は、おそらくリザーバーからのUPECの出現とその後のクリアランスにより、G.vaginalisにばく露されたマウスでPBSと比較して低くなっています。SEMによるin situ固定膀胱組織の可視化により、PBSのみに曝露された対照マウスの膀胱表面を覆う大きな表在性の傘状尿路上皮細胞が明らかになります。尿路上皮の剥離は、表在性の傘細胞の喪失によって証明され、G.vaginalisに曝露されたマウスでは、より小さな下にある移行上皮が明らかになります。

UPEC接種後早期、細胞内リザーバーの確立中に、細菌細胞が尿路上皮上に見え、剥離細胞からフィラメント状に形成されます。ここで説明した方法は、追加のガードネレラ株または他の泌尿生殖器種が大腸菌rUTIに及ぼす影響を調査するための将来の研究への道を開きます。