酵素の結晶化と構造決定:多用途マイクロ流体チップにおける連続結晶学による基質複合体

ストラスブール分子細胞生物学研究所の研究室アーキテクチャとRNAの反応性へようこそ。よく消し込む結晶を成長させることは、任意の結晶学的研究の重要なステップです。このビデオでは、生体分子の結晶を成長させ、その中でX線回折によってその3D構造を決定するための新しいマイクロ流体ツールの使用を示します。

ChipXと呼ばれるマイクロ流体デバイスは、いくつかの利点を提示します。それは反拡散の方法によって結晶化資産を小型化し、促進するように設計されている。そのセットアップは容易で、標準的な実験室材料と行われる。

また、シリアルX線結晶学によってチップ内で成長した結晶の直接特性解析にも最適化されています。ChipXは、結晶ハンドリングと凍結冷却のステップを排除し、その場で、室温で分析される結晶の本質的な品質を保持します。ChipXは顕微鏡のスライドのフォーマット、7.5 x 2.5センチメートルを有する。

それは80 x 18マイクロメートルのセクションおよび4センチメートルの長さの結晶化の部屋として使用される8つのマイクロ流動チャネルを含んでいる。左側の入口は貯留所までの8つのチャネルを満たす生体分子の解決の手動注入を可能にする。結晶化液は右側のこれらの貯蔵所に沈着する。

結晶化は、カウンター拡散と呼ばれる現象によって引き起こされる。結晶化剤が生体分子溶液に拡散し、濃度と超飽和勾配を作り出すとき。チャネルに沿ってラベルとボストは、より簡単に結晶を見つけるのに役立ちます。

チップをセットアップするには、1ミリリットル当たり5〜10ミリグラムの典型的な濃度で5〜6マイクロリットルの生体分子溶液が必要です。1マイクロリットルパラフィンオイル、貯蔵容器および粘着テープごとの結晶化液の5マイクロリットル。ChipXのローディングはマイクロピペットと標準的なヒントを使用して手動で行われます。

この例では、注射プロセスの視覚化を改善するために青色のサンプル ソリューションが使用されています。漏れを避けるために、チップに垂直にサンプルの入口にチップを挿入します。パラフィン油の1マイクロリットルは、互いからチャネルを分離するために、サンプルの後にロードされます。

サンプルの入口はテープで密封される。8つの貯蔵所は5マイクロリットルの結晶化剤の解決をそれぞれ積み込む。これを行うために、ピペット先端は約45度の角度でチャネルの端近くに配置されます。

これにより、試料と結晶化剤との間に気泡が形成されるのを防ぎます。貯蔵所はスクリーニングまたは最適化のために、様々な緩衝液、ポリマーまたは塩、et ceteraを含むカクテルで満たすことができる。貯水池はテープで密封されています。

ここで示すように、チップの設定は簡単で、ほんの数分しかかかりません。ChipXでは、逆拡散により結晶化が起こる。貯留層に堆積した結晶化剤は、生体分子を含むチャネルに拡散する。

これは、結晶化を引き起こす濃度と超飽和の勾配を作成します。これらは、チャネル内で得られた酵素の結晶の例です。彼らは80 x 80マイクロメートルの断面を有するチャネルを埋めるために成長する可能性があります。

結晶は、UV光下のトリプトファン残基の自然な蛍光を用いた蛍光顕微鏡法によってChipXで容易に検出可能であり、または蛍光標識タンパク質を用いてここに示すように。このセクションでは、フィラグリンスイスのスイスの光源で行われたクリス電信分析を示します。チップは、追加の機器や特別な注意を払うことなくシンクロトロンに運ぶことができます。

スイスの光源のホールに入りましょう。電子は中央環内を循環し、異なるビームラインで利用されるX線を含む電磁波の広いスペクトルを生成します。このビデオは、マクロ分子結晶学専用のビームラインであるX06で撮影されました。

プロトコルは、あるシンクロトロン施設から別のシンクロトロン施設に変更される可能性がありますが、全体的な原理は変わりません。ChipXは3Dプリントホルダーに取り付けられています。このホルダーは、標準ゴニオメータの磁石に取り付けられます。

チップで成長した一連の結晶からデータを収集するシリアル分析。結晶位置のリストは、チップチャネルに沿ってラベルとボストを使用して確立されます。研究者は、黄色の窓に象徴されるX線ビームに結晶を中心にするためにチップを移動します。

X線ビームを用いた高速センタリング手順を開始。ビームストップが所定の位置に上がり、検出器はサンプルに向かって移動します。グリッドスクリーニングは、結晶がビームに合うように行われます。

チップを30度回転させた後も同じ手順を繰り返します。チップ材料は視差効果を生み出し、観測された結晶位置に対して回折最大値のシフトにつながるため、第2のステップは重要です。結晶がビームの中心になるとすぐにデータ収集が開始されます。

このシーケンスは、リアルタイムでのデータ収集を示します。チップは30度回転します。一方、対応する回折画像は検出器によって収集される。

この結晶の特徴付けが完了しました。チップは、チャネル内の次の結晶に変換され、全体の手順が繰り返されます。なお、この分析は、結晶を直接処理することなく、室温で現場で操作します。

次に、一連の結晶で収集されたデータをマージして、青で示された電子密度マップの計算に使用される完全な回折データセットを取得し、原子モデルを構築します。このビデオで説明した手順は、tRNA修飾酵素の構造特性評価のフレームに適用された。低温適合細菌からのCCA付加酵素,プラノコッカスハロクロイフィルス。

ChipXは、硫化アンモニウムを結晶化剤として存在下での逆拡散により酵素を結晶化するために使用した。20°Cで数日間のインキュベーションの後、ピラミッド型の結晶がチャネルに沿って現れました。タンパク質の蛍光標識により、タンパク質結晶の同定と塩結晶からの識別が容易に行われる。

一連の結晶をその場で、室温で分析した。彼らの回折データは結合され、2.5オングストロームの分解能でAPOE酵素の結晶構造につながった。さらに、チップチャネルの環境の拡散を利用して、結晶を構築する酵素に基質を供給しました。

この場合、シンクロトロン分析の2日前にCTPアナログをリザーバ溶液に添加した。これにより、化合物が拡散し、酵素の触媒部位に到達することができました.複合体の結晶構造に見られるように、2.3オングストロームの分解能で決定した。

このビデオで示されているプロトコルは、一般的に適用可能であり、様々な生体分子でテストされています。結論を出すためにChipXは、結晶学研究のすべてのステップを統合し、ユニークなマイクロ流体デバイスで結晶構造に生物医学の溶液から行くことを可能にするラボチップツールです。このビデオを見ていただきありがとうございます.

そして、私たちは、生体分子によってお気に入りの結晶構造を結晶化し、決定するためにChipXを使用することの利点を確信している願っています。