Name: 小胞体ストレスニューロンにおけるレンチウイルス送達特異的shRNAによる分子調節 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶレンチウイルス送達shRNAによるカルシニューリンとCHOPのノックダウンが、小胞体ストレス下の大脳皮質ニューロンの神経突起萎縮に与える影響。この手法は神経変性疾患の分子機構解明に貢献する。

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イメージングに関する貴重な支援を提供してくれたゴンザロ・クアソロ博士と、細胞培養技術サポートを提供してくれたアンドレア・ペレグリーニ博士に感謝します。
この研究は、米国国立衛生研究所(#RO1AG058778-01A1、UTHSCSA-Instituto Instituto Investigación Médica M M Ferreyra間のサブアワード契約No 165148/165147)およびアルゼンチン国立科学技術振興庁(ANPCyT、PICT 2017 #0618)からの助成金によって支援されました。

動物の手順は、実験動物の世話と使用のための国立衛生研究所ガイドの承認されたプロトコルに従って実行されます。研究の実施の承認は、INIMEC-CONICET-UNC(決議番号014/2017 Bおよび006/2017 A)の動物管理および倫理委員会(CICUAL)によって付与されます。
1. 初代ラット皮質ニューロン培養
<ol><li>E18 Wistar妊娠ラットをCO 2チャンバーに80%CO2 / 20%O2の混合物で60秒間麻酔し、次に頸椎を脱臼させて犠牲にします。</li>
	<li>層流フードで次の手順を実行します。鉗子スタイル#3とまっすぐな鋭い小さなスプリングはさみ(材料の表)で胚から脳を細胞培養皿のハンクス溶液に抽出します。</li>
	<li>2つの先端の細かい鉗子スタイル#5を使用して、20倍の虫眼鏡の下で組織を解剖し、前頭皮質を髄膜から分離します。前頭皮質を15 mLの円錐管に移し、3〜4 mLのトリプシン-EDTA(0.25%)で37°Cで15分間インキュベートし、化学的消化を行います。</li>
	<li>消化後、3〜4mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)と10%ウシ胎児血清(FCS)で希釈します。次に、遠心分離により、Ca 2 + / Mg2 + 遊離ハンクスバランスソルト溶液と0.1%グルコースで3回洗浄します(3000 gで5分間)。</li>
	<li></li><li><ol><li><ol><li> </li><li></ol></li></ol></li><li></li></ol><ol><li><li><li><ol><li> </li></ol></li><li> </li><li><ol><li></li><li><li><li><li><li></ol></li><li></li></ol><ol><li></li><li></li><li><li></li><li><ol><li></li><li><li> <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/61974/61974eq01.jpg"></li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li><li></li></ol></li><li></li><li><ol><li><li></li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li> </li></ol>

<ol><li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mammalian unfolded protein response.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).</li>
<li>Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+PERK+kinase+domain+suggests+the+mechanism+for+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).</li>
<li>Bollo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+interacts+with+PERK+and+dephosphorylates+calnexin+to+relieve+ER+stress+in+mammals+and+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs.</a> PLoS One. 5, 11925(2010).</li>
<li>Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+beta+protects+brain+after+injury+by+activating+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response.</a> Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).</li>
<li>Harding, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+stress+response+regulates+amino+acid+metabolism+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress.</a> Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).</li>
<li>Hetz, C., Saxena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+and+the+unfolded+protein+response+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration.</a> Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).</li>
<li>Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+effects+of+PERK+and+IRE1+signaling+on+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability.</a> PLoS One. 4, 4170(2009).</li>
<li>Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+atrophy+and+apoptosis+mediated+by+PERK+signaling+after+accumulation+of+GM2-ganglioside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).</li>
<li>Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglioside-enhanced+neurite+growth%3A+evidence+for+a+selective+induction+of+high-molecular-weight+MAP-2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2.</a> The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).</li>
<li>Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA+%28shRNA%29%3A+design%2C+delivery%2C+and+assessment+of+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown.</a> Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Rusnak, F., Mertz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin%3A+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcineurin: form and function.</a> Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).</li>
<li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+calcium%2C+calcineurin%2C+and+NFAT%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT.</a> Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).</li>
<li>Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP+homologous+protein+%28CHOP%29+is+crucial+for+the+induction+of+caspase-11+and+the+pathogenesis+of+lipopolysaccharide-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).</li>
</ol>

著者は競合する金銭的利益を持っていません。

神経細胞モデルにおける生存期からアポトーシスUPR期への移行の分子調節を可能にする実験系について述べる。
神経突起萎縮の適切な分析のためには、多数の長く高度に分岐したプロセスを有する初代ニューロン培養物を得ることが不可欠である9,11。これにより、ニューロン突起の伸長の検査が容易になり、処理間の明確な違いを検出できます。インビトロで7〜8日目の初代皮質ニューロン培養がすでに高い神経突起伸長を示している場合、インビトロ培養で15日間ではなく、これらを使用してストレスを誘発し、その後の分析を実行する可能性があることに注意することが重要です。
さらに、ERストレスを介したCHOP過剰発現の阻害率は、約65〜70%以上である必要があります。重要なことに、CN-Aα発現レベルのサイレンシングは、その基礎レベルを改変することなく、ERストレス誘発性CN-Aα発現増加のみに影響を及ぼすはず...

小胞体(ER)ストレスは、細胞小器官のタンパク質折り畳み能力を損なう摂動として定義されます。小胞体内腔内の折り畳まれていないタンパク質の蓄積は、折り畳まれていないタンパク質応答(UPR)と呼ばれる形質導入カスケードシグナルを活性化します。この複雑なシグナル伝達経路は、PERK(プロテインキナーゼRNA[PKR]様ERキナーゼ)、IRE1(イノシトールを必要とする酵素1)、およびATF6(活性化転写因子6)の3つのストレスセンサーによって調整されています。全員が一緒に恒常性を回復しようとします。しかし、ストレスが続くと、UPRは最終的にアポトーシスによって細胞死を誘導します1。
小胞体膜貫通タンパク質であるPERKは、小胞体ストレス時に真核生物開始因子-2アルファ(eIF2α)のリン酸化を導き、全体的なタンパク質合成、ひいては小胞体2におけるタンパク質負荷を減少させる。我々は、ヘテロ二量体Ca2+ホスファターゼであるカルシニューリンA/B(CNA/B)がPERKの細胞質ドメインに直接結合し、その自己リン酸化を増加させ、タンパク質翻訳と細胞生存率の阻害を有意に増強することを実証しました3,4。興味深いことに、CNA/Bは哺乳類の脳に豊富にあり、CNのサブユニットAの2つのアイソフォーム、αとβを区別しています。
持続的なERストレス下では、PERKシグナル伝達経路は活性化されたままの唯一のUPR分岐であり、したがって生存促進応答とアポトーシス応答の両方を媒介します。慢性期における下流の主要な事象の1つは、転写因子であるCHOP(CCAAT/エンハンサー結合タンパク質相同タンパク質)の誘導です5。慢性小胞体ストレスはまた、神経変性疾患を含む広範な病理学的障害への共通の寄与物としてますます認識されています6。UPRが細胞死の代わりに細胞保護シグナル伝達をどのように促進できるかを理解することが重要です 7。しかし、現在のところ、これら2つのUPR相間の遷移を制御する正確なメカニズムについてはほとんど知られていません。
最近、培養ニューロンにおいて、ガングリオシドGM2が小胞体膜に蓄積し、管腔カルシウム枯渇を誘導することを見出しました。これにより、神経突起萎縮とアポトーシスを媒介するPERKシグナル伝達が活性化されます 8。本研究では、培養ニューロンにおけるGM2の蓄積を、小胞体ストレス誘発性神経突起萎縮症の細胞系モデルとして用いる。具体的には、CN-AαとCHOPの2つのPERK因子発現が操作され、初期/保護イベントと慢性/アポトーシス段階の間の遷移が切り替わります。これを達成するために、それぞれの遺伝子は沈黙しています。したがって、初代皮質ニューロン培養物は、レンチウイルス送達された特異的shRNAに感染している。ウェスタンブロット解析では、スクランブルshRNAを保有するレンチウイルスに感染した対照細胞と比較して、CN-AαおよびCHOP発現レベルが大幅に低下することが明らかになりました。この処理の後、ニューロンは、外因性GM2の異なるインキュベーション時間に供され、固定され、抗微小管関連タンパク質2(MAP2)抗体9で免疫染色される。画像は落射蛍光顕微鏡で取得されます。全神経突起伸長は、総細胞数に対して評価される。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-Mouse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td>#R37120</td><td></td></tr><tr><td>anti-CHOP</td><td>Thermo Fisher</td><td># MA1 - 250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CN-A&alpha;</td><td>Millipore</td><td># 07-067</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GM2</td><td>Matreya</td><td>#1961</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M2320</td><td></td></tr><tr><td>anti-&β;-actin</td><td>Thermo Fisher</td><td># PA1 - 183</td><td></td></tr><tr><td>aprotinin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#3595</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200 落射蛍光顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ#17504944</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグルスミディアム(DMEM)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ#11966025</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Promega</td> <td>#R6011</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清(FCS)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ#16000044</td><td></td></tr><tr><td>先端の細い鉗子&nbsp;スタイル #5</td><td>デュモン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子スタイル #3</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293</td><td>ATCC</td> <td>#CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 CW 二次抗体</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632221</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 二次抗体</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632220</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW 二次抗体</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW 二次抗体</td><td>LI-CORBiosciences</td><td>#92632211</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルスエンベローププラスミド pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルスパッキングプラスミド psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルスベクター pLKO.3G</td><td>Addgene</td><td>#14748</td><td></td></tr><tr><td>ロイペプチン半硫酸塩</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#295358</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX &Plus Reagent (プラスミドトランスフェクション試薬)</td><td>Life Technologies</td> <td>#A12621</td><td></td></tr><tr><td>MISSION shRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monosialoganglioside GM2</td><td>Matreya</td><td>#1502</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>#21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane 0.45 &マイクロ;m</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620115</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 赤外線イメージングシステム</td><td>LI-COR Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OneShot Top 10</td><td>Life Technology</td> <td>#C404010</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (Reduced serum media)</td><td>Life Technologies</td><td>#105802</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>BioLabs</td> <td>#R0547S</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>ペプスタチン A</td><td>サンタ クルス バイオテクノロジー</td><td>#45036</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメチルスルホニル フッ化物</td><td>サンタ クルス バイオテクノロジー</td><td>#329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P#2636</td><td></td></tr><tr><td>まっすぐで鋭い小さなスプリングはさみ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>プロメガ</td> <td>#M1801</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA 0.25 %</td><td>Life Technologies</td><td>#25200056</td><td></td></tr><tr><td>Vibra細胞超音波液体プロセッサ(VCX 130)</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard plus SV Minipreps DNA精製システム</td><td>Promega</td> <td>#A1330</td><td></td></tr></tbody></table>

小胞体ストレスニューロンにおけるレンチウイルス送達特異的shrnaによる分子調節

Molecular Modulation by Lentivirus-Delivered Specific shRNAs in Endoplasmic Reticulum Stressed Neurons

ストレス状態によって引き起こされる小胞体(ER)内の折り畳まれていないタンパク質の蓄積は、特殊なセンサーの活性化を介して折り畳まれていないタンパク質応答(UPR)を引き起こします。UPRは最初に恒常性を回復しようとします。しかし、損傷が持続する場合、シグナル伝達はアポトーシスを誘導します。
持続的および未解決の小胞体ストレスが神経変性疾患を含む多くの病理学的状態に寄与するという証拠が増えています。UPRは細胞保護プロセスとアポトーシスプロセスを切り替えることによって細胞の運命を制御するため、この遷移を定義するイベントとその調節に関与する要素を理解することが不可欠です。
最近、GM2ガングリオシドの異常な蓄積がERCa2+ 含量の枯渇を引き起こし、それがUPRセンサーの1つであるPERK(PKR様ERキナーゼ)を活性化することを実証しました。さらに、PERKシグナル伝達は、GM2蓄積によって誘導される神経突起萎縮およびアポトーシスに関与する。この点、下流のPERK成分の発現を分子的に調節し、神経突起萎縮を起こす神経細胞の脆弱性を変化させる実験系を確立しました。
ラット皮質神経細胞培養におけるカルシニューリン(細胞保護)およびCHOP(アポトーシス促進)発現のノックダウンを行った。細胞をレンチウイルス送達特異的shRNAに感染させ、次いで異なる時間にGM2で処理し、固定し、抗MAP2(マイクロチューブ関連タンパク質2)抗体で免疫染色した。その後、蛍光顕微鏡を用いて細胞画像を記録し、パブリックドメインの画像処理ソフトウェアImageJを用いて全神経突起伸長を評価した。これらのPERKシグナル伝達成分の発現の阻害は、ERストレスによって誘発される神経突起性萎縮を加速または遅延させることを明らかに可能にした。
このアプローチは、ERストレスの細胞系モデルで、神経突起萎縮に対するニューロンの脆弱性を評価するために使用される可能性があります。

ここでは、2つのPERK下流成分のサイレンシングが小胞体ストレス細胞モデルのUPRの移行段階に影響を与えるかどうかという問題に取り組みます。これを達成するために、我々は、CN-Aα遺伝子ならびにCHOP遺伝子を、それぞれについて2つの特異的shRNA配列(表1)によって1日10の初代ニューロン培養においてサイレンシングした。発現はウエスタンブロッティングにより解析される(図1および図2)。ノックダウン細胞では、ERストレスを介したCN-AαおよびCHOPの増加が明らかに阻害されていますが、対照細胞では観察されていません(shRNAスクランブル)。なお、基礎CN発現量はこの治療条件の影響を受けない。 
また、初代神経細胞培養物のMAP2免疫染色を行うことにより、GM2蓄積誘発小胞体ストレスと神経変性との関連の可能性を検...

本研究では、特定のshRNAを使用して、PERK経路の2つの下流シグナル伝達成分である細胞保護カルシニューリンとアポトーシス促進型CHOPの発現をノックダウンします。反対に、これらは小胞体ストレスの誘導後の神経突起萎縮に対する初代皮質ニューロンの感受性を調節する。

小胞体ストレスニューロンにおけるレンチウイルス送達特異的shRNAによる分子調節

The accumulation of unfolded proteins within the endoplasmic reticulum (ER), caused by any stress condition, triggers the unfolded protein response (UPR) ...

このアプローチは、下流のペア成分の分子発現を操作することにより、小胞体ストレスの細胞系モデルに使用することができます。この技術の主な利点は、神経経路の視覚化と測定によってペアのシグナル伝達の影響を取り除くことです。この方法は、GM2ガングリオシドーシス以外の多様な神経変性疾患モデルにおけるERストレスの急性期と慢性期の移行の分子基盤の理解に貢献できます。 まず、2つの細い先端番号5鉗子を使用して20倍の虫眼鏡の下で組織を解剖し、前頭皮質を髄膜から分離します。前頭皮質を15ミリリットルの円錐管に移し、化学消化のために37°Cで15分間、3〜4ミリリットルのトリプシンEDTAで組織をインキュベートします。その後、カルシウムマグネシウムイオンフリーのハンクス平衡塩溶液と0.1%グルコースで3回洗浄します。DMEMと10%FCSの1, 000マイクロリットルのチップを使用して上下にピペッティングすることにより、組織を10回機械的に解離します。ホモジネートを100 Gで1分間遠心分離し、上清を集めて、残りの容量を1, 000マイクロリットルで完成させます。細胞懸濁液を、10%FCS、1%ペニシリンストレプトマイシン、および1%の必須アミノ酸添加剤を含む2ミリリットルのDMEMを使用して、1平方ミリメートルあたり520細胞の密度で細胞培養皿にプレートします。5%二酸化炭素を含む加湿環境で摂氏37度で2時間インキュベートします。神経細胞の分化を可能にするには、無血清サプリメントを含む無血清神経基礎培地に培地を変更します。処理するまで、培養物を摂氏37度に保ち、5%の二酸化炭素を使用します。アニーリングでは、相補配列を持つ2つの一本鎖オリゴヌクレオチドを等モル量で混合します。摂氏95度で2分間加熱します。ヒートブロックからサンプルを移し、得られた生成物を最終濃度0.5マイクロモルに希釈します。shRNAインサートをレンチウイルスベクターpLKOにクローニングする。3G、1マイクログラムのベクターをEcoR1およびPAC1制限酵素で消化する。ピペッティングで穏やかに混合し、摂氏37度で3〜4時間反応をインキュベートします。ライゲーションの場合は、消化したベクターを混合し、3:1のモル比で挿入します。T4リガーゼとリガーゼバッファーと一緒に摂氏16度で一晩インキュベートします。次に、成分大腸菌をライゲーション反応の全量と混合し、氷上で15分間冷却する。摂氏42度のお風呂に2分間入れてから、再び氷の上で15分間冷やします。ヒートショックを受けた全量を15ミリリットルのチューブに移し、Luria-BertaniまたはL-B液体培地で1, 000マイクロリットルまで容量を完成させます。約330RPMのオービタルシェーカーで摂氏37度で90分間バクテリアを振とうします。摂氏4度で5分間5, 000 Gを満たした遠心分離機。900マイクロリットルの上清を廃棄し、残りの上清を使用してペレットを再懸濁します。細菌懸濁液を固体アンピシリンL-Bプレート上に均等に広げ、摂氏37度で一晩インキュベートします。単一のコロニーを選択して、10ミリリットルのL-B液体培地とアンピシリンを入れた15ミリリットルのチューブに移します。約330 RPMで摂氏37度で細菌を振盪し、培養物を遠心分離して、摂氏4度で5分間5, 000 Gで細菌をペレット化します。上清を廃棄した後、摂氏マイナス20度で細菌ペレットを保存します。トランスフェクションの24時間前に、1〜500万個のHEK-293細胞を100ミリメートルの培養皿に播種します。14マイクログラムのpKLOを混合します。特異的インサート、10.5マイクログラムのパッキングプラスミドpsPAX、および3.5マイクログラムのエンベローププラスミドpMD2を有する3Gベクター。G.45マイクロリットルのプラスミドトランスフェクション試薬を700マイクロリットルの還元血清培地で希釈し、室温で5分間インキュベートします。次に、DNA混合物を希釈プラスミドトランスフェクション試薬と混合し、穏やかに混合し、室温で20分間インキュベートします。トランスフェクション後にHEK-293細胞の培養皿の培地を新鮮な培地で交換し、DNA溶液の全量を一滴ずつ加えます。皿を穏やかに揺り動かし、細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素で48〜72時間インキュベートして、shRNAが最適な形質導入に到達できるようにします。レンチウイルスを含む培地を回収し、摂氏4度で保存します。ウイルス上清を0.45マイクロメートルのナイロンメンブレンでろ過し、1ミリメートルのフロースルーを分注します。17, 000 Gで4時間遠心分離します。上清を捨ててペレットを保存してください。目に見えないペレットを乾燥させ、乾燥したらマイナス80°Cで保管します。初代皮質ニューロン培養物を特定のshRNAオリゴヌクレオチドで感染させ、カルシニューリンA-αまたはCHOPのいずれかの3つの主要なUTRを標的とし、摂氏37度で5%の二酸化炭素で1日間インキュベートします。その後、GM2ストック溶液を最終濃度2マイクロモルで培養皿の培地に加え、摂氏37度で5%二酸化炭素で16時間、24時間、48時間インキュベートします。細胞を4%パラホルムアルデヒドと120ミリモルスクロースでPBSで摂氏37度で20分間固定し、PBSで洗浄します。透過処理液を5分間加え、PBSで洗浄する。ブロッキングを可能にするために、PBSで希釈した5%BSAを45分間使用します。その後、抗MAP2抗体とともに摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション時間の最後に細胞をPBSで2回洗浄した後、二次抗体とともに1時間インキュベートする。細胞をPBSで洗浄した後、メガネを取り付けます。落射蛍光倒立顕微鏡で画像を取得した後、画像をロードしてImageJを取得し、[プロセス]、[背景の減算]の順にクリックして背景を減算します。画像、調整、しきい値をクリックして最小値を調整し、パスと一部のトレースを区別できるようにします。フリーハンド選択を使用してソーマを削除します。[トレース] を選択し、[編集]、[選択]、[選択の作成] をクリックします。選択範囲のコントロールキーとTキーをクリックしてROIを取得し、それを保存します。元の画像を開きます。ROIマネージャーパネルをクリックし、開始ROIを選択します。次に、元の画像をクリックします。ROIが画像にトレースされたら、CtrlキーとMキーを押して統計分析を処理します。ここでは、2pERK下流成分のサイレンシングが、ERストレス細胞モデルにおける折り畳まれていないタンパク質応答の移行期に影響を与えるかどうかを確認する試みが行われました。カルシニューリンA-α遺伝子およびCHOP遺伝子を、初代ニューロン細胞培養において2つの特定のshRNA配列によって1日間サイレンシングした。発現はウエスタンブロッティングによって分析される。ノックダウン細胞におけるERストレス媒介カルシニューリンA-αおよびCHOPレベルの上昇の明確な阻害が観察されます。GM2蓄積誘発性小胞体ストレスと神経変性との関連の可能性を、初代神経培養物のMAP2免疫染色を行うことにより検討した。神経突起萎縮は、16〜48時間でGM2のインキュベーションによって小胞体ストレスを誘発した後に有意に増加します。カルシニューリンA-α発現のサイレンシングは、特にGM2未治療群と比較してGM2蓄積の16時間で神経突起萎縮を有意に増強する。したがって、カルシニューリンA-αノックダウンはニューロンの変性プロセスを加速し、折り畳まれていないタンパク質応答の初期段階におけるカルシニューリンの生存促進効果を裏付けています。逆に、CHOPノックダウンは、正確に16〜24時間で対照と比較して神経突起萎縮を有意に減少させました。適切な初代細胞培養による細胞プロトコルにより、それぞれのレンチウイルスに感染した細胞の90以上の割合を得る。神経終末軸索の喪失は、私たちのプロセスでレイアウトする最初のステップであるため、アッセイを実行することによってこれを評価することもできます。この技術により、私たちのグループや他のグループは、潜在的な治療ツールとしていくつかの分子を評価することができます。

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神経科学

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出典: Bender, HR, et.al.カチオン性および陰イオン性リポソームを用いた中枢神経系への治療用siRNAの送達J. Vis. 経験。(2016年)このビデオでは、リポソームsiRNA-ペプチド複合体(LSPC)を使用して、プリオンタンパク質(PrP)siRNAをニューロンに標的に送達する方法を示します。カチオン性リポソームは、PrPを標的とするsiRNAに静電的に結合し、血液脳関門を介した受容体を介した輸送のためにRVG-9rペプチドによってさらに安定化されます。脳内に入ると、LSPC はニューロンでエンドサイトーシスを受け、siRNA を放出して RNA 干渉を開始し、PrP...

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