Name: ゼブラフィッシュにおける脊椎動物のセグメンテーションを研究する3D尾翼植物培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ3D尾翼培養法による脊椎動物の体節形成と軸伸長の動態観察。透明な胚を用いた高解像度ライブイメージングで、形態形成素制御と組織ダイナミクスを詳細に解析する手法を習得できます。

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私たちは、魚のメンテナンスのためのAECOMゼブラフィッシュコア施設とシンシナティ子供獣医サービス、技術的支援のためのシンシナティ子供イメージングコア、ビデオ制作の支援のためのディダルサパロフと原稿を編集するためのハンナシーウォールに感謝します。この出版物で報告された研究は、E.M.Öに賞番号R35GM140805の下で国立衛生研究所の国立一般医学研究所によってサポートされました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

このプロトコルは、1日より若い脊椎動物胚の使用を含む受精後1日未満。すべての動物実験はシンシナティ小児病院医療センターの倫理ガイドラインの下で行われました。動物の議定書は、制度的動物の世話と使用委員会によって見直され、承認された(プロトコル#2017-0048)。
1. 胚コレクション
<ol><li>胚採取の日の前夜に交差タンクにゼブラフィッシュのペアを設定します。胚の発達を正確にステージング制御するには、交配ペア間の障壁を使用します。</li>
	<li>好ましい産卵時間の前に障壁を上げ、100 mmペトリ皿で15分以内に卵を集めます。<ol>
<li>ペトリ皿からきれいな破片。1つのクラッチから50個以上の胚が集められた場合は、それに応じてクラッチを複数のペトリ皿に分割します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>28°Cの魚系水中の胚を、50%エピボリー段階(受精後5時間)に達するまでインキュベートする。E3のような標準化された胚成長培地は、ステップ3.2まで水槽系の水の代わりに使用することもできる。<ol>
<li>ステレオスコープの下で未受精卵を取り除き、胚を一晩23.5°Cのインキュベーターに移動させます(O/N)。胚は、コレクションの日の翌朝に8-10スマイトステージでなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 工具の準備
<ol><li>マイクロサージャスナイフブレード、針の先端(組織の解剖に使用)、ガラスパスツールピペットを100%エタノール(EtOH)に浸して消火し、ガラスガラスを消毒します。</li>
	<li>25 mm x 75 mm の顕微鏡スライドに透明テープ (約 100~120 μm) の 2 層を使用します。メスで覆う各スライドのテープの中央に、〜18mm×18mmの正方形の井戸を切ります。<ol>
<li>準備したスライドチャンバーを70%のEtOHで拭きます。これらのウェルは、培地の約40 μLを保持します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. サンプル準備
<ol><li>ステレオスコープ下で2本の針注射器の先端を用いたデコリオネート胚。胚を魚系の水で別のペトリ皿に移して洗い流します。</li>
	<li>火ガラス無菌ガラスパスツールピペットを使用して、解剖媒体を含む6cmペトリ皿(フェノールレッドなしL-グルタミンを含むライボヴィッツ-15細胞培養培地、0.8 mM CaCl2 および1×抗生物質抗ミコティック溶液)で胚を移す。 注:このステップに続くすべての転送のために滅菌ガラスピペットを使用し続けます。<ol>
<li>剥離時にポリスチレンチップを避けるために、外植手順のためにガラスペトリ皿を使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>スライドチャンバに組織成長培地(解剖媒体、および10%FBS)を50μL入れます。</li>
	<li>後脳近くの黄身組織の交差部に針の先端を使用して、ステレオスコープ下での解剖のために胚を安定させる。</li>
	<li>針で胚組織を安定に保ち、45°に保持されたブレードを持つマイクロサージカルナイフを使用して、後脳に前部組織を切断し、前部から始まり、尾芽に向かって動く胚組織から黄身を剥がす(図1A)。 注:黄身を洗浄する際に皮膚組織を失わないように注意してください。皮膚は、解剖中に胚の周りの横向きの単層弾性組織として容易に剥がれるので、認識しやすい。</li>
	<li>卵黄が胚体から完全に取り除かれたら、尾芽から横腹の皮膚組織を切断する。最後に形成された3〜4のスマイトをそのままにして、より前組織を切り取る(全軸外植)。<ol>
<li>黄身は、この手順から主にそのまま外れるはずです。黄身が破裂した場合、卵黄の重要な顆粒は組織の腹側表面に付着したままであり続けることができる。その場合は、まつげツールを使用して、残りの黄身顆粒を穏やかにきれいにしてください。 注:外植の側面の皮膚組織の不均衡は、組織がまっすぐな成長方向を維持することを許さない。代わりに外植は、より伸びた皮膚の側面に向かって曲がります。この不均衡は、マイクロ外科用ナイフの助けを借りて皮膚層を破裂させることによって、立体鏡下で修正することができる。</li>
		<li>皮膚のない外植の場合は、針で皮膚層の先端を押し、ミクロ外科ナイフで組織の外植を剥がします。これらの外植は、文化の中で自分の体の軸を伸動しません。</li>
		<li>全軸外植に加えて、このステップで代替外植を作ることができます。例えば、マイクロサージカルナイフ(完全PSM外植)を使用して既にセグメント化されたスマイトを解剖するか、PSMを半分後部(半PSM外植)に解剖します。このような代替外植の適用については、セクション5.1を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>すぐに、除剖した外植を、イメージングが行われる22mm x 22 mmのカバースリップに移します。<ol>
<li>外植をドーソベントラ軸上に平らに配置し、腹側がカバースリップに触れる(図1B)。20 μLの濾過したチップピペットを使用して、ティッシュ外植の周囲の余分な培地を静かに取り除きます。 注:解剖された外植木のカバースリップへの遅延移動は、黄身の幾何学的拘束から解放されるので、組織の変形をもたらす。</li>
	</ol></li>
	<li>成長培地充填スライドチャンバーの上に外植でカバースリップを迅速かつ慎重に反転させます。<ol>
<li>泡の形成を防ぐために、正方形のカバースリップの側面をテープチャンバーに置き、反対側を穏やかに解放します。このステップでは、外植を移動/変形しないように注意してください。</li>
		<li>実験室のティッシュのスライドの部屋を押すことによって部屋から余分な媒体の出血を穏やかに取除く。カバースリップは、シールを行わずに液体媒体の表面張力のために、スライドチャンバーに安定して座ってライブイメージングを行います。</li>
		<li>長期培養(>6時間)には、より大きなチャンバーを使用してください。22 mm x 50 mm の長方形カバーリップと、スライド上のテープ層の 2 つの平行なレーンを、このような場合に利用できます。成長媒体への空気アクセスを容易にするために2つのテープレーンの間に~1mmの広いギャップを残すことができる。</li>
	</ol></li>
	<li>手順 3.3 ~ 3.8 を繰り返して、さらに外植を準備します。準備された外植は、平均30μm/hの速度でA-P体軸を伸長し、25°Cで〜40分間隔でスマイトをセグメント化します(図2A、ビデオ1)。<ol>
<li>伸びずら外植の場合は、ステップ3.8.2でサンプルを保持するスライドの側面に穏やかな圧力をかけ、余分な媒体を実験室組織に吸い出します。あるいは、外植は単一テープ層スライドチャンバで培養することができる。また、I型コラーゲンでスライドチャンバー表面を化学的に活性化すると、非伸びる外植が生じる(図2B、ビデオ2)。<ol>
<li>1時間室温で15〜20mLの事前希釈コラーゲン溶液でスライドチャンバーを完全に覆い、事前にI型コラーゲンでチャンバーのコーティングを行います。このプロトコルには、無菌性を維持するために層流フードを使用してください。最後に解剖媒体と慎重にチャンバーをすすいします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>15以上のスマイト段階の胚の場合、平らな(ドーソベントラル)マウントの代わりに尾部外植組織を横に取り付ける(ビデオ3)。筋けいれんを防ぐために、麻酔薬として培養培地に0.004%トリカイン溶液を含める。</li>
	</ol></li>
</ol>4. ライブ画像の取得
<ol><li>画像サンプルは、スマイトセグメンテーションサイズおよび期間の広視野透過光イメージングのための解剖スコープ上、またはトランスジェニックレポーター魚線を使用した構造化された照明/共焦点/光シート顕微鏡検査のいずれかである。</li>
	<li>組織外植物の温度を、少なくとも15分間イメージング室温と平衡化する。<ol>
<li>より正確な温度制御のために、逆の顕微鏡に取付けられた商業温度制御システムを使用しなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>目的の生物学的プロセスに応じて、画像取得フレーム間隔を2〜10分に設定します。 注:ゼブラフィッシュのスマイトセグメンテーションは、胚全体で30°C〜21.5°Cの生存可能な温度のために20〜55分の間の速いプロセスです。外植は胚全体よりも約30%遅くなります。<ol>
<li>生きている組織に可能な光毒性を避けるためにチャネル獲得のセットの間に十分な遅延を残すために注意してください。画像化の持続時間の半分以上の励起ビームに組織を露出させ、ビーム強度をできるだけ下げないでください。 注:活性酸素種(ROS)の蓄積は、一般的に、ライブサンプル4における光毒性の主な原因である。ROSスカベンジャーとしてのアスコルビン酸は、ROS活性を緩衝し、光毒性を軽減するために4 mM濃度で増殖培地に添加することができる。光毒性の悪影響は、ライブイメージング中に気づくのが難しい場合があります。尾部外植は、有糸分裂、障害組織の発達(すなわち、スマイトの形成、尾伸長)、および崩壊組織のような光毒性のいくつかの視覚的マーカーが気づきやすいため、この局面で有利である。詳しい説明については、提供されているリファレンス4 を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>単一細胞ステージRNA注入胚を使用して、細胞分解能レベルでセグメント化および分析を意図した4D画像を取得する。<ol>
<li>インビトロ転写膜および核蛍光レポーターマーカープラスミド(pCS-膜-プラスミド#53749)またはpCS-memb-mCherry(Addgene)などの300pgのRNAを使用する プラスミド#53750)を注射においてpCS2+H2B-mTagBFP2(アプゲンプラスミド#99267)またはpCS2+H2B-TagRFP-T(アプジーンプラスミド#99271)と組み合わせた。細胞膜と核マーカーを含むサンプルムービーについては 、ビデオ4を参照してください。 注:PSM組織の平均細胞サイズは直径約5μmで、その核は~3~4μmを含みます。ピクセルサイズは~0.5 μm、z断面は1μm程度と、適切なセルセグメンテーションのために記録する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 尾部外植の免疫染色
注:平らな取り付けられた尾部外植体5 として様々な解剖シナリオ(伸び、非伸び、尾芽解剖、半分PSMなど)の後に成長した組織は、目的のタンパク質のさらなる免疫染色定量のためにスライドチャンバーから回収することができる。ここでは、FGFシグナル伝達勾配読み出しとして、外植植物のジリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ(ppERK)染色に用いられるプロトコルを提示する。
<ol><li>目的の段階までスマイトの形成後、慎重に持ち上げることなくスライドチャンバーの角にカバースリップを途中でシフトします。</li>
	<li>ガラスパスツールピペット中の補助解剖培地の約100 μLの助けを借りて、スライドから外植を回収し、64ウェル細胞培養プレートに移します。 注:このステップから、すべてのソリューションの交換は、固定サンプル用の別のガラスピペットを使用して、解剖スコープの下で行うことができます。これは、井戸内の外植組織を失ったり、その間にそれらを転送しないことを保証します。</li>
	<li>すべての外植を移した後、1つずつ井戸から過剰な媒体を吸い出し、PBS(PFA)の4%パラホルムアルデヒドの100 μLを各ウェルに入れます。 注意: PFAは発がん性の作用を有する有毒な溶液である。処理中は適切なPPEを使用する必要があります。</li>
	<li>シェーカーで室温で64ウェルプレートに外植物を1時間固定します。<ol>
<li>組織外植物は、胚全体よりも変形に敏感である。それに応じてシェーカーの速度を調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>150 μLのPBS-Tw(PBSでは0.1%Tween20)で固定液を3回洗い流します。特定の「PFA廃棄物」容器に最初の洗浄を収集します。</li>
	<li>毎回約40μLの溶液を100%メタノール(MeOH)に置き換えることで、4×5分のステップで外植を脱水します。 注意: MeOHは揮発性で可燃性の有毒な化学物質です。換気の良い空間で働き、取扱いのために適切なPPEを使用してください。</li>
	<li>脱水の最後のステップとして、ウェルからすべての溶液を取り除き、MeOHの100 μLに置き換えます。-20°Cで15分間インキュベートします。 注: ステップ 5.11 までソリューションを収集するために特定の「MeOH 廃棄物」コンテナを使用してください。</li>
	<li>MeOHを50μL加え、室温で5分間振ります。</li>
	<li>40 μL の溶液を PBS-T (PBS では 0.1% Triton-X 100) に交換することで、4×5 分のステップで水分補給を行います。特定の「MeOH廃棄物」コンテナを使用してソリューションを収集します。</li>
	<li>水分補給の最後のステップとして、ウェルからすべての溶液を取り除き、PBS-Tの100 μLに置き換えます。</li>
	<li>組織透過性のためにシェーカーの室温で20分間PBSで1.5%トリトン-X 100と外植を治療します。</li>
	<li>MAB-D-T(0.1%トリトン-X 100洗剤と1%ジメチルスルホキシド(DMSO)を150 mM NaCl 100 mMマレイン酸緩衝液pH7.5)で3×5分洗浄します。 注意: DMSOは可燃性であり、有毒な変異原である。処理中は適切なPPEを使用する必要があります。</li>
	<li>100 μL/well 血清遮断液(MAB-D-Tの2%胎児ウシ血清)の外植を室温で2時間インキュベートします。</li>
	<li>すべてのブロッキング溶液を50-100 μL/well一次抗体溶液(血清ブロック中のppERKに対するモノクローナルマウス抗体の1:1000希釈)に置き換えてください。4 °CのO/N(>16h)のサンプルをシェーカーでインキュベートする。</li>
	<li>MAB-D-T 5×5分で一次抗体溶液を洗浄します。</li>
	<li>二次抗体溶液中のインキュベートサンプル(Alexa Fluor 597ヤギ抗マウスIgG2b(1:200)およびHOEchst 33342(1:5000)を4°Cで4°Cで、または室温で3時間用。 注:このステップから始まり、二次抗体処理サンプルの光暴露を避けるためにアルミニウム箔で64ウェルプレートをカバーします。 注意: Hoechst 33342は潜在的な発がん性物質である。処理中は適切なPPEを使用する必要があります。</li>
	<li>2次抗体溶液をPBS-Tw 3×5分で洗浄します。</li>
	<li>室温で15分間PFAでサンプルを固定します。</li>
	<li>PBS-Twで固定剤を洗浄し、60%グリセロール内のサンプルを平衡化します。顕微鏡スライドに外植物をマニキュアで取り付け、イメージング用に60%グリセロールを取り付けます。代表的な免疫染色結果については 、図3を参照してください。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは利益相反を開示し、宣言するものは何もない。

この記事では、ゼブラフィッシュ胚のために最近開発し、使用した組織培養外植技術の詳細なプロトコルを提示します。私たちの技術は、ひよこ8とゼブラフィッシュ9、10、11モデル生物の以前の外植方法に基づいています。このプロトコルで調製された尾の外植は、単純なスライドチャンバーで>12hまで生き残ることができ、その主要な体の軸とセグメントスマイトを、ソミト形成の終わりまで伸び続ける。
外植組織を健康に保ち、長期間正常に伸びるように注意する必要があります。まず、組織外植は、後部組織の無傷性を損なうことなく解剖されるべきである。我々は、皮膚細胞が後尾芽に侵入する神経中胚葉前駆細胞のパウチを提供していることを観察した。外植の皮膚がこれらの非常に可動性細胞を剥がれた場合は、尾芽組織を離れ、組織の限界を超えてカバースリッ...

生物のメタメリックセグメンテーションは、自然界で広く使用されています。反復構造は、椎骨、筋肉、神経、血管、手足、またはボディプラン1の葉のような側面器官の機能性に不可欠である。このような軸対称性の生理学的および幾何学的制約の結果として、アネリド、節足動物、およびそれらの胚組織(例えば、外胚、メソダーム)の後方のセグメンテーションのようなビラテリアの大部分のフィラテリアの系統。
脊椎動物胚は、主体軸に沿ってパラキシャル中胚を、種固有の間隔、カウント、およびサイズ分布を持つスマイトに順番にセグメント化します。種内の個々の胚の間でこのような堅牢性にもかかわらず、脊椎動物種の間ではスマイトセグメンテーションが汎用性が高い。セグメンテーションは、時間間隔の広大な管理(ゼブラフィッシュの25分からヒトでは5時間まで)、サイズ(ゼブラフィッシュの尾節からマウスの幹スマイトで〜200μmまで)およびカウント(ゼブラフィッシュの32からトウモロコシヘビの〜300まで)2で起こる。さらに興味深いことに、魚の胚は、セグメンテーション間隔と軸伸び速度の両方を補うことによって、適切なサイズの分布でスマイトをそのまま維持しながら、幅広い温度(ゼブラフィッシュでは約20.5°Cから34°Cまで)で発達することができます。このような興味深い特徴を超えて、ゼブラフィッシュは、兄弟胚の豊かさの外部、同期的、透明な発達だけでなく、そのアクセス可能な遺伝的ツールのために脊椎動物のセグメンテーションを研究するのに有用なモデル生物として残ります。顕微鏡の観点から悪いことに、テレオスト胚はかさばる球状の黄身上で発達し、その周りの胃組織を伸ばし丸める(図1A)。本稿では、ゼブラフィッシュの尾に対する平坦化された3次元組織外植培養を紹介する。この外植体系は、黄身質量の球面制約を回避し、スマイトパターニングのための魚の胚の高解像度のライブイメージングへのアクセスを可能にする。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61981/61981fig01.jpg"> 図1:ゼブラフィッシュ胚用スライドチャンバー外植システム(A)ゼブラフィッシュ胚は、胚組織(青)の透明化などの生画像化に有利であるが、組織は、無傷の胚におけるほぼ客観的で高解像度のイメージングを防ぐ、かさばる球状黄身塊(黄色)の周りに形成される。尾部の外植は、スマイトの組織前部(赤)から切り取られ、後部の黄身との境界で続くマイクロサージカルナイフ(茶色)で解剖することができる。(B)解剖された尾の外植はカバースリップ(水色)のドーソベントラリーに置くことができる。神経組織(明るい灰色)を上に、脊索(濃い灰色)を底に保ちます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61981/61981fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>1 mL Sub-Q シリンジ (PrecisionGlide Needle</td><td>Becton, Dickinson and Co.)</td><td>REF 309597</td><td>胚の解体および操作用</td></tr><tr><td>200プルーフエタノール、免疫</td><td>染色用</td>無水<td>デコンラボ</td><td>2701</td></tr><tr><td>抗生物質抗真菌薬溶液 (100回;)</td><td>組織解剖培地用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td></tr><tr><td>塩化カルシウム無水物、粉末</td><td>組織解剖培地用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td> 免疫<td>染色用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td></tr><tr><td>ディスポーザブルメス、#10 ステンレススチール</td><td>インテグラ-ミルテック</td>ス <td>MIL4-411</td><td>テープスライドウェル調製用</td></tr><tr><td>エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩 (トリカイン)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td> <td>(オプション) 20 体節より古い組織の麻酔用</td></tr>ステージ <tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A3160601</td><td>組織培養培地に追加</td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス IgG2b、Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat#A-21145;RRID:</td><td>免疫染色用AB_2535781二次抗体</td></tr><tr><td>L-15培地 L-グルタミン w/o フェノールレッド</td> 組織<td>解剖培地用</td><td>GIBCO</td><td>21083-027</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>免疫染色用</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>179337</td></tr><tr><td>マイクロサージカル 角膜ナイフ 2.85 mm 角度付きチップ ダブルベベルブレード</td><td>組織解剖用</td><td>外科専門</td><td>72-2863</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル反ppERK</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>猫#M8159;RRID:</td><td>ppERK免疫染色用AB_477245</td></tr><tr><td>NucRed Live 647 ReadyProbes 細胞</td><td>核の生染色用</td>試薬 <td>Invitrogen</td><td>R37106</td>(オプション)</tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粉末、95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>免疫</td><td>染色用サンプル固定</td>用158127</tr><tr><td>ラットテールコラーゲンコーティング液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>122-20</td><td>(オプション) 化学活性化スライドチャンバー用</td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーター</td><td>Tokai Hit</td><td>tokai-hit-stxg</td><td>(オプション) ライブイメージング時の温度制御用</td></tr><tr><td>透明テープ 3/4インチ</td><td>スコッチ</td><td>S-9782</td><td>テープスライドウェル調製用</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>免疫染色用</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ用:Tg(actb2:2xMCP-NLS-EGFP)</td><td>Campbell et&nbsp;al., 2015</td><td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-150624-4</td><td>transgenic fish with nuclear localized EGFP</td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュ: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)</td><td>Cooper et&nbsp;al., 2005</td><td>ZFIN: ZDB-TGCONSTRCT-070117-75</td><td>transgenic fish with cell membrane localized EGFP</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュにおける脊椎動物のセグメンテーションを研究する3d尾翼植物培養

A 3-D Tail Explant Culture to Study Vertebrate Segmentation in Zebrafish

脊椎動物の胚は、脊椎、筋肉、および皮膚の前駆体である反復性スマイトとして主体軸をパターン化する。節内皮(PSM)から徐々に胚の尾端が後方に伸びる。スミテは、周期性とサイズの尺度を持つ形をする。ゼブラフィッシュは、遺伝的に難解であり、生きたイメージングを可能にする透明な胚を有するため、人気のあるモデル生物です。それにもかかわらず、ソミト生成の間に、魚の胚は大きな丸い黄身に包まれる。この幾何学は、特に近い目的の作業距離を必要とするより高い解像度で、ゼブラフィッシュ胚におけるPSM組織の生画像を制限する。ここでは、ゼブラフィッシュの尾葉の生画像化のための平坦化された3次元組織培養法を提示する。尾部外植は、軸伸びの比例減速とロストロコーダルスマイト長さの短縮を表示することによって、無傷の胚を模倣する。さらに、外植培養を通じて軸伸び速度を失速させることができる。これにより、信号勾配の化学入力を軸伸長の機械化入力から解き放つ。今後の研究では、この方法をマイクロ流体セットアップと組み合わせて、薬物侵入の懸念なしに、時間制御された医薬品摂動または脊椎動物セグメンテーションのスクリーニングを可能にすることができる。

このプロトコルは生きているゼブラフィッシュ尾の外植の平らな幾何学的培養を可能にする。組織培養は、全胚に対して3つの大きな利点を提示する:1)軸伸長速度の制御、2)単純解剖による様々なシグナル伝達(モルフォゲン)源の制御、および3)ほぼ客観的で高い拡大および高NAライブイメージング。
化学的に未処理のスライドチャンバーは、尾部外植が下の組織の周りに包む皮膚外皮によってその主軸(図2A)を伸長することを可能にする。化学活性スライドチャンバー(I型コラーゲン付き)の外植物を培養すると、皮膚外皮が伸びてスライドチャンバーに付着し、外植の軸伸びが止まりました。それにもかかわらず、スマイトはセグメント化を続けました(図2B、補助映画S1およびS2)。プロトコルに記載されているように、軸伸長は、取り付けプロセス中に物理的な圧力を加えたり、より浅いスライドチャンバに外植を取り付けることによって直接停止することもできる。このような身体拘束の下での軸...

ここでは、ゼブラフィッシュ後部体軸の3次元組織培養に関するプロトコルを提示し、脊椎動物のセグメンテーションの実生研究を可能にする。この外植モデルは、軸伸長、モルフォゲン源の変化、および細胞内分解能組織レベルのライブイメージングを制御します。

ゼブラフィッシュにおける脊椎動物のセグメンテーションを研究する3D尾翼植物培養

Vertebrate embryos pattern their major body axis as repetitive somites, the precursors of vertebrae, muscle, and skin. Somites progressively segment from ...

3Dゼブラフィッシュの尾の外植は、スマイトの発達と脊椎動物のセグメンテーション中にゼブラフィッシュ胚の透明性を最大限に活用しましょう。空の交配タンクに魚のシステム水を入れます。システム水でストレーナーをきれいにします。交配ペア間の障壁を上げます。魚のペアを淡水タンクに選択的に移動します。空のタンクで水の移動を通してストレーナーで胚を収集します。リンスは、魚のシステム水で胚を収集し、ペトリ皿にフリップ。エタノール釉薬解剖ツール。スライド上にテープを 2 層作成します。深い部屋の水平側面をカットします。垂直側面と完全な部屋の切り傷。テープをチャンバー表面からはがします。細胞培養培地をチューブに注ぎます。塩化カルシウム2.8ミリモル最終濃度を混合します。抗生物質溶液を追加します。別のチューブ内のアリコート解離メディア。ティッシュ培養培地を作るために牛の血清を補完する。針で胚を脱コリオンさせる。淡水皿に胚を洗い流し、植え出しのためにそれらを収集します。針で胚を安定させ、脱ヨークを開始します。残った組織をトリミングします。外植をカバースリップに移します。組織を平らにし、ピペットで余分な培地を吸い出します。スライドチャンバーを含む成長培地にカバースリップを置きます。外植組織をティッシュワイプに置きます。目的に浸漬油を適用します。スライドチャンバを顕微鏡に取り付けます。画像取得用にレーザーチャンネルを調整します。サンプルの Z レイヤーの制限を確認します。時間イメージングとZレイヤーを設定します。3次元尾外植システムは、細胞の統合を尾芽に保ち、余分な伸びを胚全体のようにそのまま維持します。また、1種類のコラーゲンで表面を化学的に活性化させることにより過剰な伸びを止めることもできる。3Dゼブラフィッシュの尾の外植システムは、高解像度とほぼ客観的な顕微鏡画像を撮らせることによって、ゼブラフィッシュ胚の透明性を利用することができます。それに加えて、過剰な伸びをモルフォゲンシグナル伝達から切り離し、単純な解剖方法でモルフォゲンシグナル伝達源を制御することができます。

a-3-d-tail-explant-culture-to-study-vertebrate-segmentation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

体節形成には、その空間的なパターン脊椎動物の胚の体軸リズミカルな発達過程である。以前、我々はこのプロセスを駆動する巡回遺伝子を観察する蛍光レポーターを使用したトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を開発しました。ここでは、in vitroでの時間をかけて、これらの線とイメージ、その振動からの培養分散した細胞。...

シングル細胞におけるゼブラフィッシュセグメンテーション時計のイメージングのための分散前体節中胚葉細胞培養物の世代

このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。...

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

神経学的および非神経疾患の多くのゼブラフィッシュモデルは成魚ではなく、胚/幼虫で研究されているため、我々は大人のゼブラフィッシュの疾患モデルに適用することができ、定量的側線再生アッセイを開発しました。アッセイは、1）感丘および2）個々の有毛細胞レベルでの解像度を含んだ。...

アダルトゼブラフィッシュ側線再生のためのアッセイ

私たちは、明視野ベースの立体顕微鏡を使用して、ゼブラフィッシュの幼生の尾びれの再生のダイナミクスを全組織スケールで捉えるためのプロトコルを提示します。この技術により、単一細胞の分解能で再生ダイナミクスを捉えることができます。この方法は、CCDカメラとタイムラプスソフトウェアを搭載したあらゆる実体顕微鏡に適用できます。...

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

ゼブラフィッシュは、遺伝学および発生研究のための優れたモデルシステムです。ビーズ移植は、局所的な細胞環境の変化を導入することにより、発生メカニズムを調査するために使用できる貴重な組織操作技術です。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚にマイクロビーズ移植を行う方法について説明します。...

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

ここでは、正常な発達を乱すことなく、生きたゼブラフィッシュの胚の後部体の発達を長期間のタイムラプスイメージングを可能にする汎用性の高いマウント方法を紹介します。...

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

ここでは、通常の発達過程を妨げずにゼブラフィッシュの胚のサイズを小さくする方法について述べる。この手法により、サイズ変更に対するパターンのスケーリングと開発の堅牢性の検討が可能になります。...

胚性パターンスケーリングの研究のためのゼブラフィッシュの外科的サイズ縮小

ここでは、in toto光投影断層撮影法、多光子顕微鏡を用いたライブイメージングおよびホールマウント免疫蛍光染色によって得られた、軸方向の伸長およびセグメンテーションの文脈におけるマウス胚の3次元および4次元画像データの視覚化および解析を可能にする計算ツールおよび方法について説明する。...

脊椎動物の軸の伸びとセグメンテーションを研究するための3次元および4次元の可視化と解析アプローチ

ゼブラフィッシュ・ブラソドルム外植は、初期胚内の内在性シグナル伝達センターから胚細胞を単離することによって生成され、比較的ナイーブな細胞クラスターを容易に操作し、 培養したex...

ゼブラフィッシュ胚からのナイーブ・ブラストデム・エクスプラントの生成

ここでは、2つのゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)細胞株、ZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)のスフェロイドを形成するための効果的で簡単かつ高速な3D培養プロトコルを紹介します。...

ゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株のスフェロイドの3D培養法

学ぶゼブラフィッシュ3D尾翼培養法による脊椎動物の体節形成と軸伸長の動態観察。透明な胚を用いた高解像度ライブイメージングで、形態形成素制御と組織ダイナミクスを詳細に解析する手法を習得できます。

ゼブラフィッシュにおける脊椎動物のセグメンテーションを研究する3D尾翼植物培養

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