Name: 質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートとの共有結合標識 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学ぶジエチルピロカーボネートを用いたタンパク質の共有結合標識法。質量分析で溶媒接触性アミノ酸残基を同定し、高次構造と機能の関係を解明する。生化学研究に有用な手法です。

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著者らは、グラントR01 GM075092の下で国立衛生研究所(NIH)からの支援を認めている。ここで説明したデータの一部を取得するために使用されるサーモオービトラップ核質量分析計は、国立衛生研究所の助成金S10OD010645からの資金で取得されました。

1. タンパク質および試薬の調製
注: このプロトコルには、DEPC でタンパク質を標識するワークフローの例が含まれています。一部の条件および試薬濃度は、選択したタンパク質に基づいて異なる場合があります。
<ol><li>1.5 mLマイクロ遠心チューブですべての試薬溶液を調製します。</li>
	<li>pH 7.4で所望の濃度のタンパク質溶液を、通常は数十μMの範囲で10 mM 3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)緩衝液で調製します。あるいは、サンプルにDEPCで反応性となる求核バッファーが含まれている場合は、10 mM pH 7.4 MOPS でバッファー交換既存のタンパク質溶液を調製します。他の緩衝剤(例えば、リン酸緩衝食塩基)も、求核性官能基を有しないものであれば使用することができる。</li>
	<li>1.45 μLのストック6.9 M DEPC溶液をACNの98.55 μLにピペット処理して、乾燥アセトニトリル(ACN)に100 mM DEPC溶液を調製します。 注:すべてのタンパク質で動作する濃度のセットはありませんが、最適な濃度は、HisとLys残基の数に基づいて推定することができます23.例えば、50μM β2マイクログロブリン溶液の50μLで、100mM DEPCの0.2 μLでタンパク質を反応させて、最終的なDEPC濃度200μM(4倍のタンパク質濃度に等しい)を用いて、この一般的な例を用いて所望のモル比を確保する(表1)。DEPC標識は2次 反応であるため、反応混合物中のタンパク質またはDEPCの濃度を変化させると、標識速度が変化する。</li>
	<li>10 mgのイミダゾールを計量し、146.9 μLのHPLC級水に溶解して、1 Mイミダゾール溶液を調製します。</li>
</ol>2. インタクトタンパク質のコバレント標識
<ol><li>水浴温度を37°Cに設定し、お風呂が安定した温度に達するのを待ちます。 注: 例示のラベル付けプロトコルの試薬濃度と容積は 、表 1に記載されています。</li>
	<li>新しいマイクロ遠心管で、 表1に記載されているボリュームにMOPSバッファーとタンパク質溶液を混ぜ合わせる。</li>
	<li>タンパク質とバッファーに、DEPC溶液の0.2 μLを加え、得られた溶液を適切に混合し、その後、反応混合物を含むチューブを37°Cの水浴に1分間入れます。 注:ACNの添加量は、標識反応中にタンパク質の構造が摂動するのを避けるために、全反応量の1%を超えてはならない。反応時間はユーザまでであり、例条件下での1分間の反応は、DEPC14の過剰標識および電位加水分解を最小限に抑える。</li>
	<li>1分後、水浴から反応混合物を含むチューブを取り出し、1Mイミダゾール溶液の1μLで反応を焼き付け、残りの未反応DEPCを清掃する。 注:反応混合物中のイミダゾールの最終濃度は、反応混合物中のDEPCの濃度の50倍に等しくする必要があります。これにより、残りの未反応 DEPC が清掃されます。</li>
</ol>3. ボトムアップLC-MS用タンパク質消化の調製
注: 目的のタンパク質に適した消化条件を選択してください。一般的なステップは、タンパク質を展開し、任意の二硫化物結合を減少させ、アルキル化することを含む。
<ol><li>反応混合物に適当な展開試薬を加えてタンパク質を展開する。 注:一般的な展開剤には、ACN、尿素、グアニジン塩酸塩(GuHCl)が含まれます。</li>
	<li>トリス(2-カルボクセチル)ホスフィン(TCEP)とヨウオアセトアミド(IAM)の溶液をそれぞれ5mgの計量し、10mM pH 7.4 MOPSバッファーの174.4および270.3 μLの新しいマイクロ遠心チューブに溶解して、還元およびアルキリエーションステップの手順を調製します。</li>
	<li>反応混合物に2μLの100 mM TCEP(反応混合物中の2mMの最終濃度)溶液を加え、室温で3分間反応させることにより、二硫化結合を低減します。 注: TCEP の最終的な濃度は、溶液中に存在する二硫化物結合あたりのタンパク質濃度の 40 倍に等しいはずです。</li>
	<li>アルキル酸は、100 mMのIAM溶液(反応混合物中の4 mMの最終濃度)を暗い中で30分間4μLで減少させたシステインを減少させた。IAMは光に敏感で、直接光の下で分解します。 注: 溶液中の IAM の最終的な濃度は、TCEP に使用される濃度の 2 倍、つまり、200% の結合あたりのタンパク質濃度の 80 倍である必要があります。</li>
	<li>トリプシンやキモトリプシンなどの適切な酵素でタンパク質を消化します。300ストローク/分の揺れ速度で固定化酵素を用いた37°Cでの3時間消化に対する10:1タンパク質:酵素比は、通常、DEPC標識タンパク質に十分である。「ディスカッション」を参照してください。</li>
	<li>消化後、消化したペプチドから固定化した酵素を12,000rpmで5分間遠心分離して分離する。</li>
	<li>サンプルをLC-MS/MSで直ちに分析するか、液体窒素でサンプルをフラッシュフリーズして、サンプルの劣化とラベルの損失を最小限に抑えます。フラッシュ冷凍サンプルは、LC-MS/MS分析の準備ができるまで、&lt; -20 °Cで保管してください。</li>
</ol>4. LC-MS/MS分析
注: ボトムアッププロテオミクスの標準 LC-MS/MS パラメータを使用して、タンパク質分解ペプチドフラグメント上の標識部位を同定することができます。一般的な例を以下に示します。
<ol><li>逆相C18定常相を用いてDEPC標識ペプチドを分離する。典型的なLC移動相の2つの溶媒を使用する:(A)水+0.1%のギ酸および(B)ACN+0.1%のギ酸を使用して、勾配(例えば、 図2)を使用してペプチドの最良の分離を達成する。 注:分離時間はサンプルの複雑さに基づいて最適化することができ、移動相流量は毛細管またはナノLCが使用されているかどうかによって異なります。</li>
	<li>オンラインLC-MSおよびMS/MSを行うことができる質量分析計を使用して、ペプチド上のDEPC修飾部位を同定する。我々の実験では、質量分析計のいくつかのタイプを使用することに成功しました。LC-MS分析の過程で多くのペプチドのMS/MSを自動的に実行できる質量分析計は、適切であるべきです。関連するMSパラメータには、ESIソース電圧= -4000 V(通常のESI用)が含まれます。ナノスプレー用-2000 V;軌道上解像度 = 60,000;動的除外期間 = 30 s;MS/MS アクティベーション タイプ: CID、ETD、またはその両方。質量スキャン範囲 = 200-2,000;自動ゲイン制御 = 4.0E5 (オービトラップの MS1)および 5.0E4 (線形四重極イオントラップの MS2)</li>
	<li>消化された標識タンパク質サンプルをLCシステムにロードして注入し、LC-MS/MSの取得を開始します。サンプルがフラッシュ凍結されている場合は、分析前に解凍します。過度の塩がESI源に入るのを避けるために、LCの排水を最初の5分間無駄にします。 注意:5 μLの注入ループは一般に利用され、およそ2.5 μgのタンパク質をLC-MS/MSに注入することを可能にします。これは、サンプルインジェクタを詰まらせないように、LCの負荷条件に依存する。</li>
</ol>5. データ分析
<ol><li>使用する質量分析計に適したソフトウェアを使用して、DEPCラベル部位を特定し、ペプチドピーク領域を定量化します。</li>
	<li>DEPC添加(72.02 Da)およびカルバミドメチル化(57.02 Da)を可変的な変更として含める。MS/MS 分析の追加の検索パラメーターは次のとおりです: 最大切断を逃した = 3;フラグメントイオンタイプ = bおよびy;前駆体 m/z 許容値 = 10 ppm (四重極イオントラップ質量分析計を使用する場合、この値は高くなる必要があります)。フラグメント m/z 許容値 = 0.5 Da (製品イオンスキャンに高解像度の質量分析計を使用する場合、この値は低くなる必要があります)。前駆体電荷 = 1-4. 注: 異なるデータベース検索アルゴリズムは、異なるスコアリングシステムを持っており、多くは、変更レベルが低い可能性があるため、DEPC修飾ペプチドを識別することが困難な場合があります。スコアカットオフを調整することは、より多くの標識ペプチドを同定するために必要である場合がある。その場合は、MS/MSデータの手動による問い合わせを使用して、低スコアペプチドを検証する必要があります。加水分解されたDEPCが求核側鎖に対して反応性を持たなくなったため、DEPCラベルの加水分解の産物はデータ検索に含まれない。</li>
	<li>ペプチドの修飾および未改変バージョンのクロマトグラフィーピーク領域を使用して、残基レベルの改変率を決定します。 注: 対象の修飾残基を含むペプチドは考慮する必要があり、含まれるすべての電荷状態は、すべての測定サンプルに存在する必要があります。異なるイオン化効率を有し、異なる時間に溶出するペプチドは、この値が特定の部位の修飾の絶対的尺度ではなく相対的なものである。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61983/61983eq01.jpg"> ここで、A,zは 、対象の残基を含む任意のペプチド(i)のピーク面積を表し、すべての検出された電荷状態(z)を考慮します。</li>
	<li>統計的評価を使用して、コントロールと実験サンプルの間のラベリングの変化が有意かどうかを判断します。各サンプルの3つの反復測定が典型的であり、t検定は95または99%の信頼区間で最も一般的に利用される。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

重要なステップ 実験計画に関するいくつかの点を考慮して、信頼性の高いラベル作成結果を確保する必要があります。まず、タンパク質標識を最大化するためには、DEPCと反応して標識の程度を低下させることができるため、強い求核基(例えば、Tris)を有する緩衝液を避ける必要がある。また、このようなバッファーが標識残基と反応し、ラベルの除去を引き起こし、したがって構造情報の損失を引き起こす可能性もあります。MOPS はバッファとして推奨しますが、リン酸緩衝生理食塩分も同様に機能します。第二に、ジチオスレイトールは、この試薬中の遊離チオールが標識残基と反応し、DEPC修飾を除去することができるので、ジスルフィド結合の減少のために避けるべきである。この同じ化学は、遊離Cysがタンパク質内標識スクランブル33を引き起こす可能性があるため、ジスルフィドをアルキル化することが不可欠である理由である。第三に、イミダゾール(プロトコルステップ2.4)を用いたクエンチステップは、残りのDEPCがタンパク質と反応し続けることができないように標識反応を停止するために重要である。
<p cl...

タンパク質は、事実上すべての生理学的プロセスにおいて不可欠な生体分子です。タンパク質が採用する構造と他の生体分子との相互作用のために、タンパク質が果たす様々な機能が可能です。タンパク質の機能を深く理解するためには、これらの重要な構造特徴と相互作用を解明するために生化学的および生物物理学的ツールが必要です。従来、X線結晶学、極低温電子顕微鏡、核磁気共鳴(NMR)分光法は、タンパク質構造を明らかにするために所望の原子レベルの詳細を提供してきました。しかし、結晶化の挙動、タンパク質の入手可能性の制限、過剰なサンプルの不均一性、分子量の制限など、これらの手法では、多数のタンパク質システムを問い合せることはできません。その結果、これらの制限を克服する新しい分析方法が登場しました。タンパク質の構造情報を提供できる新たな技術の中には、質量分析があります。
質量分析(MS)は分子の質量電荷(m/z)比を測定するため、所望の構造情報をタンパク質の質量にコードすることにより、タンパク質の高次構造情報を取得する必要があります。この情報をコード化するためのいくつかのアプローチは、水素重水素交換(HDX)1、2、3、4、化学架橋(XL)5、6、および共有結合標識(CL)7、8、9、10を含む開発された。HDXでは、溶媒の入手可能性とH結合の範囲に依存する速度でわずかに大きい重水素によって、骨格アミド水素が交換されます。HDXの範囲は、タンパク質をペプチド断片に素早く消化してから、質量分析計でこれらの断片を分離して測定するか、またはトップダウン実験でタンパク質を解離することによって局在化することができる。交換速度を決定することで、タンパク質のダイナミクスに関するさらなる洞察が得られます。HDXは、バック交換に伴う課題や、再現性を最大限に高める特殊な機器の必要性にも関わらず、タンパク質構造を特徴付けるための貴重なツールであることが証明されています。XL-MSでは、タンパク質は、特定のタンパク質内または2つのタンパク質間で隣接する残基側鎖を共有結合する二機能性試薬と反応する。その際、XL-MSは、タンパク質構造を特徴付けるために使用できる距離制約を提供することができます。架橋されたタンパク質の領域は、タンパク質分解消化と続く液体クロマトグラフィー(LC)-MS分析によって同定することができる。XL-MSは、細胞内を含む様々なタンパク質複合体を研究するために使用されてきた汎用性の高いツールですが、XL製品の同定は困難であり、特殊なソフトウェアが必要です。
CL-MSは、タンパク質の構造と相互作用を研究するための補完的で、時には代替MSベースのツールとして最近登場しました。CL-MSにおいて、タンパク質またはタンパク質複合体は、溶媒暴露側鎖と反応し得る単一機能試薬で共有修飾される(図1)。異なる条件下でタンパク質またはタンパク質複合体の修飾範囲を比較することにより、立体構造変化、結合部位、およびタンパク質-タンパク質のインターフェースが明らかになる。CL反応後、部位特異的情報は、多くの場合、単一アミノ酸レベルで、タンパク質がタンパク質分解され、ペプチド断片がLCによって分離され、改変部位がタンデムMS(MS/MS)を使用して同定される典型的なボトムアッププロテオミクスワークフローを使用して得ることができる。バイオコンジュゲート化学の豊富な歴史により、CL-MS実験に数多くの試薬が利用可能になりました。CL試薬は、(i)特異的および(ii)非特異的の2つの一般的なカテゴリーに分類される。特定の試薬は、単一の官能基(例えば、遊離アミン)8、10と反応し、実装が容易であるが、それらは限られた構造情報を提供する傾向がある。非特異的試薬は、広範囲の側鎖と反応しますが、多くの場合、これらの反応性の高い種を生成するためにレーザーやシンクロトロン源などの特殊な機器が必要です。ヒドロキシルラジカルは、最も一般的に使用される非特異的試薬であり、ヒドロキシルラジカルフットプリント(HRF)7、11、12、13実験を行い、様々な条件下で幅広いタンパク質およびタンパク質複合体を研究した。
我々の研究グループは、CL-MS実験14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25の文脈におけるタンパク質構造および相互作用を研究するために、ジエチルピロカーボネート(DEPC)と呼ばれる別の比較的非特異的な試薬を使用することに成功した。DEPCは、特定の標識試薬のシンプルさを提供し(すなわち、反応を行うために特別な装置は必要ありません)、一方で、平均タンパク質中のアミノ酸の最大30%と反応します。高い電気反応試薬として、DEPCはシステイン、ヒスチジン、リジン、チロシン、セリン、スレオニン残基のN末端および求核側鎖と反応することができる。典型的には、これらの反応の単一の産物が生成され、結果として72.02Daの質量増加が生じる。この単一タイプの製品は、タンパク質がヒドロキシルラジカルと反応するときに生成することができる最大55種類の製品と対比する7。このような単純な化学は、標識された部位の同定を容易にする。
ここでは、DEPCベースのCL-MSを用いてタンパク質の構造と相互作用を研究するためのプロトコルを提供します。試薬調製、DEPC-タンパク質反応、タンパク質消化条件、LC-MSおよびMS/MSパラメータ、およびデータ分析に関連する詳細が記載されています。また、タンパク質-金属、タンパクリガンド、タンパク質-タンパク質相互作用、加熱時に構造変化を起こしているタンパク質の結果の例を提供することで、DEPC標識の有用性を実証します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL微量遠心チューブ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3448</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸ナトリウム塩</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M9381</td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap RSLC C18 カラム</td><td>Thermo Scientific</td><td>164537</td><td>300 &mu;m x 15 cm、C18、2 &mu;m、100 A</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A998-1</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート</td><td>ミリポア シグマ</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>HPLC グレードの水</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>W5-1</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>ミリポア シグマ</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>固定化キモトリプシン</td><td>ProteoChem</td><td>g4105</td><td></td></tr><tr><td>固定化トリプシン、TPCK処理</td>済み<td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>20230</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>ミリポアシグマ</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>C4706</td><td></td></tr></tbody></table>

質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートとの共有結合標識

Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate for Studying Protein Higher-Order Structure by Mass Spectrometry

タンパク質の高次構造を特徴付けて、その機能を理解するためには不可欠です。質量分析(MS)は、特に従来の方法では研究が困難なタンパク質系に対して、この目的のための強力なツールとして登場しました。MSによるタンパク質の構造を研究するために、タンパク質の構造情報をその質量にコードする溶液中で特定の化学反応が行われます。特に効果的なアプローチの1つは、溶媒のアクセス可能なアミノ酸側鎖を共有的に修飾する試薬を使用することです。これらの反応は、タンパク質分解性消化およびタンデム質量分析と組み合わせると残留レベルの分解能に局在化できる質量増加を招く。ここでは、MS検出と共に共有標識試薬としてのジエチルピロカーボネート(DEPC)の使用に関連するプロトコルについて説明する。DEPCは、平均タンパク質中の残基の30%まで標識することができる高い電気電子分子であり、それにより優れた構造分解能を提供する。DEPCはMSと共に、β2-ミクログロブリンなどの小さな単一ドメインタンパク質の構造情報をモノクローナル抗体などの大きな多ドメインタンパク質に対して得るのに成功しています。

DEPC 変更サイトと変更率の特定 共有結合標識による質量付加は、(a)インタクトタンパク質及び(b)ペプチドレベル8,9で測定することができる。無傷レベルでは、標識数の異なるタンパク質種の分布を、直接分析またはLC-MSの標識タンパク質サンプルから得ることができます。より高い分解能構造情報(すなわち、部位特異的標識データ)を得るためには、測定はペプチドレベルで行わなければならない。標識および焼入段階の後、標識されたタンパク質はボトムアッププロテオーム分析(すなわち、ジスルフィド還元、アルキル化、タンパク質分解、およびLC-MS/MS)に供される。図3は、DEPC標識部位が同定され、それらの修飾レベルがタンパク質β−2-ミクログロブリン(β2m)21に対するDEPC CL-MS実験に対して計算される方法を示す。MS/MSは、標識されたペプチドを配列し、DEPC標識部位を特定するために使用され...

質量分析検出を用いてジエチルピロカーボネートベースの共有標識を行うための実験的手順について説明する。ジエチルピロカーボネートは、単に目的のタンパク質またはタンパク質複合体と混合され、溶媒にアクセス可能なアミノ酸残基の修飾につながる。修飾残基は、タンパク質分解と液体クロマトグラフィー/質量分析分析の後に同定することができる。

Characterizing a protein&#39;s higher-order structure is essential for understanding its function. Mass spectrometry (MS) has emerged as a powerful tool ...

タンパク質構造の特徴付けは、その機能を理解するために不可欠です。質量分析は、特に従来の方法では研究が困難なタンパク質系に対して、この目的のための強力なツールとして登場しました。質量スペックによるタンパク質構造の研究のために、タンパク質構造情報をその質量にコードする溶液中で特定の化学反応が行われる。特に効果的なアプローチの1つは、共有化して、解析可能なアミノ酸側鎖を修飾する試薬を使用することです。これらの反応は、タンパク質分解性消化およびタンデム質量分析と組み合わせると残留レベル分解能に局在化できる質量増加を招く。ここでは、質量スペック検出と共に共有標識試薬としてのジエチルパイロカーボネートまたはDEPCの使用に関連するプロトコルについて説明した。DEPCは、平均タンパク質中の残基の30%まで標識することができる高い電気電子分子であり、それにより、優れた構造分解能を提供する。DEPCは、多くの異なるタンパク質の構造情報を得るためにマススペックと一緒にうまく使用されています。まず、目的のタンパク質の緩衝溶液を数十マイクロモルの範囲の濃度で調製します。我々は一般的に10ミリモルpH 7.4 MOPSバッファーを使用しています。あるいは、既存のタンパク質溶液は、元のサンプルが求核官能基を有する緩衝液を含む場合にMOPSまたは別のバッファーへのバッファー交換をすることができる。彼らはDEPCタンパク質反応を妨げるので、バッファーは、求核機能基を有しないことが必要です.別のマイクロチューブでは、乾燥アセトニトリルに100ミリモルDEPCのストック溶液を調製する。乾燥アセトニトリルでストック溶液を調製することは、DEPCの加水分解を防ぐために必要である。新しいマイクロチューブで、HPLCグレードの水に1モルイミダゾールの溶液を調製します。新しいマイクロチューブで、MOPSバッファーとタンパク質溶液を混合します。タンパク質とバッファーにDEPCストック溶液のアリコートを追加し、反応混合物を37°Cの水浴に1分間入れる前に適切に混合していることを確認します。使用されるDEPCストック溶液の体積は、望ましい最終的なDEPCタンパク質濃度比に基づいて選択されるべきである。すべてのタンパク質で動作するDEPCとタンパク質濃度のセットはありませんが、最適なDEPC濃度は、タンパク質に存在する溶媒アクセス可能なヒスチジンおよびリジン残基の数に基づいて推定することができます。なお、アセトニトリル添加の体積は、効果的に添加されるDEPC溶液の体積が、反応中のタンパク質構造の摂動を避けるために全反応量の1%を超えてはならないことに留意すべきである。反応時間は最終的にユーザ次第であるが、例の条件下での1分間の反応は、DEPCのタンパク質の標識および加水分解を最小限に抑える。1分経過した後、反応したDEPC上で残りのを清掃するためにイミダゾールを添加することによって反応をクエンチする。イミダゾールの最終濃度がDEPC濃度の50倍であることを確認してください。DEPCによって修飾された残基を同定するために、タンパク質はタンパク質分解的にペプチド断片に消化されなければならない。消化のために、目的のタンパク質に適した条件を選択してください。ここで説明する一般的なステップは、タンパク質を展開し、消化効率を改善できるようにジスルフィド結合を減少およびアルキル化することを含む。我々の経験では、消化前に変性剤と熱でタンパク質を展開すると、消化の効率が向上します。タンパク質が展開されている間、適切な消化バッファー内のTCEPとヨウドアセトアミドの溶液を比較します。DTTはDEPC改変残基と反応することができるので、TCEPはジチオスレイトールまたはDTTの代わりに還元剤として使用されるべきである。還元後に得られるファイルのアルキル化は、フリーファイルとタンパク質が改変アミノ酸と反応する標識スクランブルを避けるために不可欠です。展開ステップが完了したら、反応混合物にTCEPを加えて二硫化物結合を減らし、室温で3分間反応させます。還元後、反応混合物にヨウアドアセトアミドを加え、暗闇の中で室温で30分間反応させた。ここで、反応混合物を箱に入れることによって達成する。ヨウドアセトアミドの最終濃度は、TCEPに使用される濃度の2倍、またはタンパク質濃度またはジスルフィド結合の80倍である必要があります。目的の酵素を準備します, 通常、メーカーの仕様に従ってトリプシンまたはキモトリプシン.選択した酵素を調製した後、消化を開始し、37°Cで反応混合物をインキュベートします。固定化酵素を用いた3時間の消化を伴う10:1タンパク質と酵素比は、典型的にはDEPC標識タンパク質に適した選択である。消化後、試料は直ちにLC-MS/MSで分析するか、液体窒素で凍結して、サンプルの劣化と標識の損失を最小限に抑える必要があります。ボトムアッププロテオミクスの標準LC-MS/MSパラメータは、タンパク質分解ペプチド断片上の標識部位を同定するために使用することができます。逆相C18定常相は、ペプチドの最良の分離を達成するために使用されるべきである。当社の経験では、キャピラリーLCは、使用されるサンプル量が多いため、ナノLCよりも修飾レベルに関するより信頼性の高い定量情報を提供します。DEPC標識ペプチドを分離するために使用される典型的なLC移動相は、2つの溶媒で構成される。溶媒Aは0.1%のギ酸を含む水であり、溶媒Bは0.1%のギ酸を有するアセトニトリルである。勾配溶出が使用され、サンプルの複雑さに基づいて分離時間を最適化できます。オンラインLC-MSおよびMS/MSを行うことができる質量分析計は、ペプチド上のDEPC修飾部位を同定するために必要とされる。我々の実験では、質量分析計のいくつかのタイプを使用することに成功しました。我々は、熱軌道融解核が優れた結果を提供することを発見したが、LC-MS分析の過程で多くのペプチドのMS/MSを自動的に行うことができる質量分析計は適切であるべきである。測定前にHPLC条件と質量分析パラメータを適切に設定する必要があります。サンプルがフラッシュフリーズされている場合は、分析の直前に解凍する必要があります。サンプル調製とHPLC注入の間の時間を最小限に抑えるために最善を尽くしてください。LCシステムに消化された標識タンパク質サンプルをロードして注入し、LC-MS/MSの取得またはDEPCラベルサイトの同定およびピーク面積の定量を開始し、複数の方法が存在する。サーモフィッシャーの機器では、エクスカリバーまたはプロテオームの発見者が使用される可能性があります。プログラムでペプチドの同定に適切なパラメータを設定します。DEPC付加およびカルバミドメチル化は、残基を補助または割り当てる可変的な修飾として含まれる。ペプチドの修飾および未改変バージョンのクロマトグラフィーピーク領域は、残基レベルの修飾パーセンテージを決定するために使用される。MS検出によるDEPC標識は、タンパク質に対する高次構造変化を特徴付けるための貴重なツールでもあります。我々の研究から、DEPC共有結合標識は熱および酸化的ストレスの構造変化を受ける特定の蛋白質領域を同定できる。この図では、ラベル付けの増加に対しては変更率の有意な変化が青色で示され、ラベル付けの増加に対して赤色が示され、有意な標識変更のない残基は淡い緑色で示されています。例えば、β-2ミクログロブリンが熱ストレスにさらされた後、標識範囲の有意な減少を受ける多くの残基は、N末端、セリン28、ヒスチジン31、セリン33、セリン55、セリン57、およびリジン58がこのタンパク質の領域がタンパク質の一方の側よりも近いことを示唆している。タンパク質が酸化ストレスにさらされた後、標識の減少を伴う異なる残基は、セリン11、ヒスチジン13、リジン19、リジン41、およびリジン94が他の場所で酸化誘導された確認変化が起こることを示す別の相のクラスターからなる。この研究は、現在、医薬品市場で最も急速に成長している分野であるタンパク質治療薬にとって重要な意味を持っています。我々のグループからの他の研究はまた、DEPC共有標識質量スペックがストレスモノクローナル抗体治療の確認変化の部位を検出し、同定できることを示している。ご覧のように、DEPCによる共有ラベルは実験的に実装するのが簡単ですが、タンパク質に対する貴重な構造情報を提供することができます。DEPC標識質量の質量の分析によって提供される構造分解能は、X線結晶学やNMRのような技術と比較すると控えめですが、そのサイズや結晶化能力に関係なく、ほぼすべてのタンパク質に適しています。DEPC共有バレントラベリング質量スペックは、タンパク質混合物でも作用し、細胞ライセートやhaCat細胞などの非常に複雑なサンプルタイプで動作します。このビデオを見た後、私たちはDEPCがタンパク質構造を特徴付けるための有用なツールを標識することを確信しています。

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私たちは、真と偽のタンパク質 -...

に基づいて、タンパク質 - タンパク質相互作用の同定のためのプロトコル<sup&gt; 15</sup&gt; Nの代謝標識、免疫沈降法、定量的質量分析法と親和性調節

本論文では、自己組織化の自発的プロセスによる高度に秩序ペプチドベースの構造の形成を説明しています。この方法は、市販のペプチドおよび共通実験装置を利用しています。この技術は、ペプチドの多種多様に適用することができる、新たなペプチドベースアセンブリの発見につながることができる。...

短いペプチドの自己組織化によって順序付け生体分子構造の形成

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。...

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

ここでは、固体粉末中のタンパク質に対する固体アミド水素/重水素交換質量分析(ssHDX-MS)および固体光分解標識質量分析(ssPL-MS)の詳細なプロトコルを紹介します。この手法は、アモルファス固体におけるタンパク質の立体構造と相互作用に関する高分解能情報を提供し、製剤設計に役立つ可能性があります。...

質量分析は、凍結乾燥粉末中のタンパク質の構造と相互作用を研究するためのアプローチ

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

タンパク質複合体の建築はその機能は欠かせません。様々...

化学架橋と複合体タンパク質複合体の建築を学びそのまま蛋白質の複合体の質量分析法を組み合わせた

質量分析 (MS) は、高分子アセンブリのダイナミクスと構造調査のための重要なツールとして浮上しています。ここでは、我々 はタンパク質複合体形成とリガンドを尋問する MS ・ ベース ・...

タンパク質のアーキテクチャと統合構造質量分析法によるタンパク質-リガンド複合体の分析

タンパク質チオール酸化は、通常の生理学的および病態生理学的条件下で重要な意味を持ちます。レジンアシストキャプチャー、アイソバリック標識、質量分析を利用して、タンパク質の可逆的に酸化されたシステイン残基の部位特異的同定と定量を可能にする定量的レドックスプロテオミクス法の詳細について説明します。...

タンパク質チオール酸化の多重化定量のための同重体タンデム質量タグ標識と組み合わせた樹脂支援キャプチャ(英語)

ここでは、キャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換(HDX)アプローチとトップダウン質量分析を組み合わせたプロトコルを紹介します。このアプローチは、同時差動HDXおよび電気泳動分離を行うことによって、異なる状態および異なるプロテオ形態のタンパク質を含む、異なるタンパク質種間の高次構造の違いを特徴付ける。...

トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換

学ぶジエチルピロカーボネートを用いたタンパク質の共有結合標識法。質量分析で溶媒接触性アミノ酸残基を同定し、高次構造と機能の関係を解明する。生化学研究に有用な手法です。

質量分析によるタンパク質高次構造の研究のためのジエチルピロカーボネートとの共有結合標識

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