Name: キャビテーション強化療法の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学ぶキャビテーション強化療法のリアルタイム測定法。細胞培養装置を用いて気泡動態をモニタリングし、創薬やソノポレーションなどの生体効果を評価する再現性の高い実験システムを構築します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、助成金EP/L024012/1を通じてこの作業を支援してくれた工学物理科学研究評議会に感謝する。VBは、工学物理科学研究評議会(EPSRC)と医学研究評議会(MRC)(助成金EP/L016052/1)によってもサポートされています。VBとAVは、大学院奨学金のためのクラレンドン財団に感謝します.AVはまた、サンタンデール奨学金のためにエクセターカレッジに感謝します.著者らは、装置の製造における貴重な支援のためにジェームズ・フィスクとデビッド・ソールズベリーに恩恵を受けています。彼らはまた、以前のプロトタイプSTHEの開発におけるダリオ・カルゴ博士とジョシュア・オーウェン博士の貢献を感謝しています。

著者らは開示するものは何もない。

音響測定の重要なステップは、198176年にApfelによって「あなたの液体を知り、音場を知り、何かが起こったときを知る」としてカプセル化されました。このプロトコルのコンテキストでは、これらはトランスデューサのキャリブレーションとアライメントと水の準備と気泡処理のステップを包含する。まず、駆動トランスデューサおよび/またはPCDを較正するために使用されるハイドロフォンは、それ自体が通常の外部サービスまたは参照規格との社内比較を通じて正確に較正することが不可欠です。同様に、駆動トランスデューサとPCDの両方の応答は、出力の変化および/または感度の損失をチェックするために定期的に特徴付けられる必要があります。駆動条件とシステムの受け取り感度が不明な場合、暴露条件、生体効果および音響放出の間の意味のある関係を推測することは不可能です。これに直接関連して、トランスデューサ同士とサンプルチャンバの位置合わせを慎重にチェックして、チャンバー内の露光条件が期待通りであり、PCDのサンプリング量が対象領域に対応していることを確認する必要があります。示されるように、懸濁媒体の温度およびガス含有量は、最終的な結果に大きく影響し、この点で一貫性が極めて重要である77,78。同様に、キャビテーション剤懸濁液の調製、特性評価、および取り扱いは、期待されるサイズ分布および粒子の濃度がサンプル内に存在することを確実にするために非常に細心の注意を必要とする。例えば、気泡の濃度が高すぎる場合、インシデントUSフィールドからのサンプル体積の効果的なシールドが発生します。MB剤は、特に破壊および合体の影響を受けやすく、その取り扱いに関するさらなるガイダンスは、Mulvana etで見つけることができます。al. (2012)79.
キャビテーション信号の検出に関する非常に一般的な問題は、適切なSNRを達成することです。これは、説明したように、信号自体の性質の一部によるものですが、実験セットアップ内の電気的ノイズの発生源によるものでもあります。システムコンポーネント間の接続、特に同軸ケーブルを含む接続を確認すると、これらの一部を排除するのに役立ちます。同軸ケーブルの交換または修理が必要な場合があります。電気的な騒音を引き起こす可能性のあるポンプなど、実験室内の他の機器を特定および除去または非アクティブ化することも助けになります。システムコンポーネント間の電気インピーダンスの一致性が悪いと、信号対ノイズ比が低下し、機器の損傷の可能性がある場合にも、慎重にチェックする必要があります。信号発生器とオシロスコープのトリガー設定も同様にチェックして、実験に適した構成で、製造元のデフォルト設定に戻していないことを確認する必要があります。取扱い時に気泡が著しく破壊される場合、SAT2の場合には、第2の注射器を出口口に取り付け、これを使用してチャンバーから静かに流体を抽出し、懸濁液中に引き出すのが有用である。また、これは、必要に応じて、マクロバブルを排除したり、米国の露出中に流れを可能にするのに役立ちます。
サンプルチャンバー内の音響反射を完全に排除することはできないため、入射フィールドはサンプルボリューム全体にわたって完全に均一ではありません。ステップ1.3.2および1.3.3で述べたように、音響窓の透過性は周波数に依存するため、音響放射測定に必要な帯域幅を慎重に考慮する必要があります。特に、高周波成分の多重反射が大きく存在する可能性がある。これは、完全に組み立てられたシステム内のフィールドのキャリブレーションが、入射圧力の不確実性を最小限に抑えるために非常に重要であるもう一つの理由です。また、記録された信号の適切な格数は、複数の反射の影響を最小限に抑えるために考慮されるべきである。利便性と音響透過性の必要性のために商用機器を使用することは、光透過性を犠牲にしなければならないことを意味します。これは、細胞の生存率または薬物取り込みの評価を行う、その後のイメージングの品質に影響を与える可能性がある。市販装置に用いられる膜の一部は多孔質であり、したがって、試料室と周囲の水浴との間に不完全な分離が起こる。上記のように、対応する汚染のリスクは、より小さなサブチャンバを使用することによって軽減することができ、その内容物は定期的に交換することができる。 材料表 に示されている細胞培養装置は、主に、米国/キャビテーション媒介生物効果の観点から組織を代表しない細胞単層に適しています。固体表面への細胞の近接性は、生体内の条件を反映しない可能性のある方法でMBダイナミクスに影響を及ぼすもの、例えば、導入で説明したようにマイクロストリーミングおよびマイクロジェットを促進する。しかし、これらの制限は、代替組織モデルの単純な置換によって対処することができる。
SAを提案する目的は、米国が媒介する生物効果の研究の間で音響暴露条件と音響放出の再現性を向上させる手段を提供し、その基盤となるメカニズムのより良い理解と安全性と有効性を向上させるための治療モニタリング技術の開発を促進することを期待する。このシステムは、市販の細胞培養デバイスと互換性があるように設計されており、目的のアプリケーションに従って幅広い生物学的アッセイを実行し、高スループット実験のパフォーマンスを可能にし、実行間の時間のかかるアライメント手順の必要性を排除します。露光条件の特性評価と音響放出のキャプチャのためのプロトコルを標準化することにより、システム依存の変動性を減らすことができればと思います。特定の実験のために検討すべきパラメータの範囲は、用途(所望のバイオ効果、細胞タイプ、インビボの場合は標的組織の深さ)および使用されているキャビテーション剤の性質によって異なります。多数の変数(US周波数、圧力振幅、パルス長、パルス繰り返し周波数など)を考えると、パラメータ空間全体を完全に探索することは、実用的である可能性は低い。提案されたプロトコルの利点は、このパラメーター・スペースのいくつかの境界を迅速に確立できる点です。例えば、キャビテーション信号が生成される最小圧力、細胞の剥離/死が起こる前に使用できる最大圧力またはパルス長さ、および分数高調波または広帯域ノイズが発生する圧力を決定することができます。このような一連のスコープ測定は、あらゆる研究の第一歩として実施することが推奨されます。
提示されているように、SASは音響放出のリアルタイムモニタリングのために設計され、生物学的アッセイは実験の外で行われる。しかし、顕微鏡目的を介してサンプルチャンバーの直接光学観察を可能にするためにSATを改変することは比較的簡単であろう。これは、例えば、薬物取り込みおよび気泡動態の観察を可能にするために、蛍光および/または高速顕微鏡システムに結合することができる。現在電圧で示されているPCD出力は、i)キャビテーションの動作の種類とその相対的な割合を示しています。ii) これらのキャビテーション動作が持続する期間。iii) 観察された時間累積露光特性が特定の生物効果に相関しているかどうか。そしてiv)相対レベルおよび時間依存行動が暴露系における以前の実験と一致しているかどうか。PCDの受信感度を定量化できる一方で、絶対エネルギーの観点から音響放出を確実に特徴付けるためには、追加の空間情報が必要です。これは、パッシブ音響マッピング(PAM)80を実装するために、PCDをアレイプローブに置き換えることで達成できます。しかし、これは信号処理の複雑さと計算時間と必要な電力を増加させます。
膜電気抵抗の測定や物理的な標的化方法の適用のための他の計装、例えば磁場も組み込むことができる。また、腫瘍スフェロイド、オルガノイド、さらには細胞単層の代わりに音響的に「柔らかい」ゲル基質上のエキソウビボ組織サンプルなどの3次元組織構造を使用して、より現実的な組織環境における米国およびキャビテーション媒介効果を研究することもできる。

超音波(US)は、その安全で非侵襲的な性質、患者のベッドサイドでの実装の容易さ、およびその費用対効果1のために、画像診断技術として広く使用されている。その診断および監視機能の次に、米国は治療の適用のためのかなりの潜在性を持っている。初期の研究は、血栓溶解、DNAトランスフェクション、および薬物送達2、3、4および治療米国におけるその使用を探求し、現在、腫瘍治療5、6、7、免疫療法8、9、血液脳関門(BBB)破壊10、11、12、血栓溶解13、14、15、および細菌感染治療を含むアプリケーションで、研究の非常に活発な領域を表しています。これらの用途を支える重要な現象は、流体圧18,19の変化による気体腔の核形成、成長、振動である。
キャビテーションが生物学的効果を生み出すメカニズムはさまざまです。例えば、適用された米国のフィールドの影響下でのバブル振動の非常に非線形な性質は、両方の薬物対流20を増強し、気泡の近くの組織にせん断応力を及ぼすことができる周囲の液体にマイクロストリーミングを生成することができます。これは、気泡が境界の近くにあり、泡が球状でない振動を引き起こし、せん断誘発性透過性21、22、23、24を介して薬物取り込みを促進する可能性がある場合に特に流行している。より高い圧力では、大きな振幅振動および急速な気泡崩壊が観察され、直接的な機械的応力25を与え、頻繁に衝撃波を発生させ、結果的に組織26,27を破壊し、浸透させる可能性のある大きな圧力勾配を与える。表面近くの気泡の崩壊はまた、高速液体マイクロジェット28、29、30の形成をもたらすことができます。これらのマイクロジェットは、組織に浸透し、毛穴を作り出したり、二次応力波31,32を誘導したりする可能性がある。組織および細胞レベルの両方における生体膜の透過化は、様々にソノフォレスと呼ばれ、主に皮膚透過性33、34、およびソノポレーションにおける米国誘発増強の文脈で使用され、主に膜孔35、36の形成に伴う細胞膜の可逆的透過性を記述するために使用される。
発振気泡を取り囲む液体の粘性吸収は、実質的な加熱効果37を生み出すことができる。さらに、非線形振動が高い場合、米国の走行分野よりも高い周波数で音響放射を生成します。これは、周囲の組織の吸収を増加させ、さらに加熱38.気泡崩壊はまた、過渡的な高温や気泡コアの圧力に起因する化学的効果を伴い得る、例えば高反応性種および電磁放射の発生、ソノルミネッセンス32として知られている。これらの効果は、送達のための潜在的な損傷および/または関連する細胞経路の活性化を評価するために調査され、ソノダイナミック療法40、41、42、43として知られているアプローチで光感受性薬物の局所活性化において利用された。
米国が媒介する多くの生物効果は、米国のフィールドパラメータ(圧力振幅、周波数、パルス長および繰り返し周波数、および暴露の持続時間)の制御によってのみ開始される可能性がありますが、生体組織でキャビテーションを確実に発生させるには高い入力エネルギーが必要な場合が多いため、損傷のリスクが高くなります。外因性または人工キャビテーション核の導入は、上記で議論された幅広い効果を生み出すために必要な入力エネルギーを大幅に削減し、さらに米国だけでは不可能な追加の効果を導入する可能性がある。キャビテーション核は、気泡26、44、液体液滴45、46、47および固体粒子48、49、50を含み、ナノスケールキャビテーション核は、長期の循環時間、改善された外挿および長期キャビテーション活性49、51、52、53の点でそれらの利点の調査の出現領域である。
最も一般的に使用される核は、もともと画像診断において造影剤として使用されたガスマイクロバブル(MB)である。それらは典型的には直径1〜2マイクロメートルであり、周囲の媒体の水溶性が低い高分子量ガスの中心を含んでいる。コアは、保護脂質、タンパク質、または最も一般的にリン脂質54からなるポリマーシェルに囲まれている。米国のフィールドに曝露すると、MBの圧縮性が原因で体積振動が起き、その結果、造影剤としてのRBの成功を担う強力な音響散乱が生じてしまう。前述のように、これらの振動はまた、治療用途で利用することができる前述の機械的、熱的、および化学的効果につながります。MBコーティングプロセスはまた、MB構造内で薬物をカプセル化し、薬物を取り付けたり、種を標的とする場合に、MB表面に薬を取り付けるメカニズムを提供します。この技術は、全身毒性55を低減する薬剤の誘発放出を促進する。また、最近では、MB表面からの物質が生物学的構造に移され、いわゆる「ソノプリンティング」56、57、58を介して薬物送達を増強することが示されている。
米国が媒介するキャビテーション活性のモニタリングは、インビトロおよびインビボの両方で生じる生物学的効果に関する洞察を提供し、潜在的にこれらの効果の調整および最適化を可能にする。キャビテーション活性を監視するための2つの最も広く適用される方法は、i)光、超高速ビデオ顕微鏡を使用し、一般的にvivoで実現不可能である; とii)音響、振動および/または崩壊気泡によって生成された再放射音場を記録する。音響信号の振幅と周波数の両方の成分には、気泡の挙動に関する情報が含まれています。低入射米国の振幅での気泡の低濃度は、主に高調波放射(駆動周波数の整数倍)59を生成することが示されている。駆動圧力が増加するにつれて、気泡放出スペクトルは、より強い非線形挙動を示すサブハーモニクスおよび超高調波60 と呼ばれる分数成分、および慣性キャビテーションを示すブロードバンドノイズを含むことがある。整数高調波は、バブル振動の主要な指標ですが、非線形伝播などにより、実験システムのどこでも非線形性によって引き起こされる可能性があります。対照的に、分数高調波とブロードバンドノイズは、バブルダイナミクスと非常に強く相関しています。
気泡挙動と検出された音響放出との関係は、米国の入射分野、核生成環境、および検出経路60の特性を含む要因によって複雑になり得る。しかし、気泡の挙動や細胞との相互作用に関する重要な情報は、音響スペクトルの周波数とエネルギーの傾向を見極めることによって得ることができます。これらのデータは、臨床治療のモニタリング技術の基礎となる貴重な情報を提供することもできます。この情報を十分に活用するには、堅牢で翻訳可能で再現可能な実験手法の開発が必要です。
現在、システムを設計し、キャビテーション支援療法の開発を支援するための研究を行うための報告されたプロトコルに大きなばらつきがあります。装置の面では、様々な設計アプローチが行われている。いくつかのグループは、並列プレートチャンバー56、61、62、63のいずれかを使用して、カスタム構築または市販(例えば、オプティセル、サーモフィッシャーサイエンティフィック)。Hu et al. (2013) は、米国の超音波処理モジュールとリアルタイム共焦点イメージング64、Carugo らと結合したセルチャンバーを開発した。 (2015)は、米国露光65中に水浴中に水没を可能にするカスタムメイドのPDMS蓋を備えた市販の細胞培養皿を含むシステムを使用し、ペレノら(2018)は、ダイナミクスバブルと気泡細胞相互作用の同時光学的および音響特性を可能にする層状のアキソ流体共振器からなる装置を使用した66。カスタムで製作されたアプリケーション固有の設計を使用すると、米国のフィールドやその他の環境暴露条件の特徴付けが複雑になり、クロススタディの比較が困難になります。例えば、0.02~15MHzの中心周波数、1%から連続波までのデューティサイクル、0.1~20 MPa23、64、67、68、69、70(表1)を含む、ソノポレーションを成功させるために同定された米国パラメータにはかなりのばらつきがあります。スペクトル成分(高調波、副高調波など)にも同様にかなりの変動があり、特定の生物効果に関連していると同定されています。
したがって、この研究の目的は、キャビテーションモニタリング機能の特異的包含を伴うキャビテーション誘導細胞生物効果のインビトロ研究のための容易に再現可能なシステム設計および実施フレームワークを提供することである。

<table><tbody><tr><td>アブソーバー</td><td>Precision Acoustics</td><td>APTFlex F28 パネル</td><td>1.0cm 標準厚さ</td></tr><tr><td>アンプ(電源)</td><td>E&アイ株式会社</td>超音波源を駆動する<td>1040L</td><td>400Wパワーアンプ</td></tr><tr><td>アンプ(プレ)</td><td>スタンフォードリサーチシステム</td><td>ズ SR445A</td><td>PCD信号用固定ゲイン多段プリアンプ</td></tr><tr><td>アクアリウムヒーター</td><td>アクアエル</td><td>ウルトラ50W</td><td>タンクサイズごとに異なるモデル。</td></tr><tr><td>デジタイザー</td><td>TiePieエンジニアリング</td><td>HS5-110-XM</td><td>拡張メモリオプション:チャンネルあたり32Mポイント</td></tr><tr><td>ハイドロフォン</td><td>精密音響</td><td>FOH</td><td>直径0.01 mmの敏感な領域は指向性の影響を最小限に抑えます</td></tr><tr><td>マイクロバブル</td><td>ブラッコ</td><td>SonoVue</td><td>FDA承認のマイクロバブル</td></tr><tr><td>PCDミラー(SAT3)</td><td>オリンパスNDT</td><td>F-102</td><td>90度ビーム反射</td></tr><tr><td>PCDトランスデューサ</td><td>オリンパスNDT</td><td>V320-SU</td><td>液浸トランスデューサ、7.5MHz</td></tr><tr><td>PCD防水ケーブル</td><td>オリンパスNDT</td><td>BCU-58-1 W</td><td></td></tr><tr><td>PDMS(SAT2コンパートメント蓋)</td><td>Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>準備ガイドラインについてはCarugo et al.(2015)を参照してください</td></tr><tr><td>ポリマーロッド(SAT2シール)</td><td>Zeus</td><td>PTFEモノフィラメント</td><td></td></tr><tr><td>ゴムプラグ(SAT3蓋/シール)</td><td>VWR</td><td>391-2101</td><td>6mmの底径、8mmの上の直径、赤</td></tr><tr><td>信号発生器</td><td>Agilent</td><td>33250</td><td>超音波源用波形発生器</td></tr><tr><td>細胞露光コンパートメント用基板、SAT2</td><td>同上</td><td>&micro;-ディッシュ 35mm</td><td></td></tr><tr><td>細胞露光コンパートメント用基板、SAT3</td><td>コーニング</td><td>トランウェル 6.5mm</td><td></td></tr><tr><td>超音波源 (SAT3)</td><td>Sonic Concepts</td><td>H107中央の穴</td><td>HIFU対応のソースを使用すると、フォーカスとプレフォーカの両方で>1MPaの圧力を発生させることができ、空間的なカバレッジが広がります</td></tr></tbody></table>

キャビテーション強化療法の研究

Studying Cavitation Enhanced Therapy

超音波の治療用途への関心は有意で、成長しており、癌からアルツハイマー病に至るまでの潜在的な臨床標的である。キャビテーション - 超音波分野内の気泡の形成とその後の動き - これらの治療の多くを支える重要な現象を表しています。しかし、キャビテーションが治療効果を促進する詳細な作用機序に関しては、かなりの不確実性が残っており、臨床的に実施できる信頼性の高いモニタリング技術を開発する必要がある。特に、治療効果の正常な伝達とそれに対応する音響放出として報告される暴露パラメータの研究との間には有意な変動がある。本稿の目的は、キャビテーション媒介生物効果の研究を行うための広く利用可能なコンポーネントを用いた設計ガイドラインと実験プロトコルを提供すること、およびリアルタイムの音響モニタリングを含む。このプロトコルは、治療的超音波実験への音響モニタリングのより広範な組み込みを可能にし、暴露条件の研究とその関連するバイオ効果との相関関係をまたいで容易に比較することを可能にすることが期待される。

図4は、時間および周波数領域のPCD応答の例を示し、3つの異なるキャビテーション挙動を示す。すべてのデータは、ソノヴューMBを使用してSAT3上で収集され、PBSで5倍希釈され、最終的な濃度は〜2*107 MB/mlであった。このセクションのすべての例の温度は19±1 °Cでした。 米国のソースは、0.20(図4Aおよび4B)、0.30(図4Cおよび4D)、0.70MPa(図4Eおよび4F)のインシデントピーク負圧を達成するために0.5 MHzで2.0 msのパルスで駆動された。 信号記録は、米国パルスのt = 0開始の前に1.4 msを開始しました。差し込みトレースは、信号が記録された信号(赤)と、2 MHz ハイパス フィルタ(青)を備え、ソースからセルエクスポータメントから PCD への飛行時間を中心としたタイム ウィンドウを示します。この時間以前の低レベル応答は、PCDが米国のソースの背後にある構成で一般的であるソースから直接放射線を受け取ったことによるものです。
最も低い入射圧力では、PCD応答は0.5 MHzの基本的な米国周波数の整数高調波から完全に構成されています。0.20から0.30 MPaに増加すると、さらに高い整数高調波に加えて、スペクトルの顕著な超高調波をもたらします。この2つの圧力におけるタイムドメイン波形は似ていますが、0.30 MPaの結果はパルス持続時間に対してより多くの変動性を示しています。最高圧力では、スペクトルに明らかに上昇した広帯域ノイズの結果として、時間領域波形振幅は低い圧力に対して非線形に成長しています。このノイズは慣性キャビテーションの結果であると考えられ、この例では、MBの破壊に対応しています。
これをより明確に見るために、PCD応答を時間の関数として 図5に示します。左側のパネル (図 5A)では、50 秒間の露光時間に完全なスペクトルが表示され、その間、ソースは 0.20 秒ごとに 2.0 ms パルスを出力します。対応する合計、高調波、およびブロードバンドのパワーは、右側のパネルに示されています(図5B)。米国はt =3.0 sでオンにされ、その時点で大振幅ブロードバンド応答が見られました。初期スパイクは、懸濁液中の最大気泡の破壊に対応すると考えられている(SonoVueは多分散)、殻付き気泡を用いたキャビテーション実験や非脱気媒体(例えば、PBS)でのキャビテーション実験で一般的な観察である。
数秒後、ブロードバンド応答は急速に減少し、明らかにバブル破壊のために、信号は主に高調波で構成されています。これは、解放されたガスおよび残りのMBが安定して非慣性に振動していることを示唆している。t〜50sでは、ブロードバンドコンポーネントは元のバックグラウンドノイズのレベルに落ちています。したがって、このような暴露テストは、異なる気泡効果がチャンバー内の細胞に作用する可能性のあるタイムスケールを理解しようとする際に重要です。
気泡は、米国の暴露中に発生する放射線力に応じて変換され、PCD分野の中およびPCD分野外でのMBの移動は、特に希薄懸濁液を扱う場合、監視されたキャビテーション信号の変動性の増加につながる可能性があります。したがって、PCD の敏感な領域は、できるだけ多くの細胞露出面に及ぶ必要があります。同じ中心周波数を持つ焦点を合わせた非焦点のPCDと非焦点のPCDの比較(図2を参照)は、通常のPBSでの20:1のMB希釈を用いたSAT2です。パネル図6Aの時間およびサンプル平均スペクトルは、非焦点PCDが高調波(図6B)と超調和力の両方におけるサンプル対サンプル変動性の低下を伴う、より強い広帯域応答を含み、かつ超調和力を有することを示している(図6C)。
インビトロ細胞の働きに使用される培地は脱ガスされず、気泡活性の背景レベルが高まる可能性があることを認識することが重要である。 図7 は、サプライヤー提供の形態で使用されるPBSのSAT2の応答を示し、真空下で2時間の脱気後、その後、空気飽和度は光学センサーで決定された92%から46%に減少した(ドイツのPreSens)。 図7A のスペクトルは、5つの独立したサンプルで露光時間と反復で平均化され、通常のPBSで明らかに高い超高調波を示す。3つの高調波(図7B)を合計したパワーは、各実験出力の標準偏差の範囲内にあります。対照的に、 図7C の超調和的な合計は、通常のPBSがサンプル間でほぼ桁違いに高いレベルと実質的に高い変動性を有することを示している。これらの例は、一般的なセル互換メディアが、MB の存在に起因する (誤った) 動作を示すことを示しています。細胞および/またはキャビテーション剤の安定性に悪影響を及ぼすため、培養培地を脱ガスすることは通常実用的でないため、キャビテーション関連の研究において適切な制御を行うことが重要です。
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> 図1:キャビテーションモニタリングを組み込んだ2つの米国露光システム設計の図:SAT3(D-F)。(A) わかりやすくするためにサイドウォールを取り外した SAT2 のアノート付きアセンブリ。(B)サイドウォールをそのまま使用した SAT2。(C)SAT2細胞露光コンパートメント、分解。(D) SAT3 アセンティット アセンブリ。(E)SAT3 を通常(左)とレンズ(右)構成で、異なる周波数でビーム幅をマッチングします。(F)SAT3細胞露光コンパートメント、分解。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> 図2:直径12.7mmの非焦点(左)および球状に焦点を合わせる(右)トランスデューサの半振幅圧力フィールド輪郭の計算。座標原点(0,0)のPCD要素に対して、2、4、8MHzの周波数はそれぞれ赤、青、緑の輪郭として表示されます。焦点を合っていないデバイスの最も外側の輪郭は周波数に対して比較的無神経ですが、内部構造は周波数に依存します。球状に焦点を合わせるフィールドは周波数が増加するにつれて収縮しますが、輪郭の内側ではフィールドがスムーズに変化します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> 図3:キャビテーション信号調節および記録(青い矢印)、米国のソース励起(赤線)、およびデータ取得トリガのための計装。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> 図4:時間(左)と周波数(右)ドメインPCD応答は、PBSで5倍希釈されたMBで記録された。入射ピーク陰圧は(A, B) 0.2 MPa, (C, D) 0.4 MPa, (E, F) 0.7 MPa, すべて 0.5 MHz で. 信号記録は 2.0 ms 持続時間超音波パルスの t=0 開始前に 1.4 ms 開始した。(A、C、E)時間領域信号(赤)は、応答レベルがインシデント圧力でどのように変化するかを示す固定の垂直スケールで示されます。差し込みトレースは、信号が記録された信号(赤)と、2 MHz ハイパス フィルタ(青)を備え、ソースからセルエクスポータメントから PCD への飛行時間を中心としたタイム ウィンドウを示します。(B、D、F)ノイズと信号の出力スペクトル密度は、それぞれ t&lt;0 と t&gt;0 について計算されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> 図5:PBSで5倍希釈されたMBの懸濁液の50秒間の暴露に対するスペクトル履歴。(A)完全なスペクトルと(B)合計、高調波およびブロードバンド信号のパワー、すべて時間の関数として。駆動条件は0.5MHz、0.7 MPaピーク陰圧、2.0 msパルス持続時間、200 msパルス繰り返し期間であった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> 図6:PCDの焦点を合わせる幾何学の効果は、通常のPBSにおけるマイクロバブルの20:1希釈で記録された。駆動条件は、1.0 MHz、0.50 MPaピーク陰圧、3.0 msパルス持続時間、10msパルス繰り返し期間であった。(A)完全スペクトルは、暴露時間と3つの独立したサンプル反復にわたって平均化。(B)3、4、5 MHz高調波の電力、および2.5、3.5、4.5MHzの超高調波での(C)電力。太い線はサンプル平均で、シェーディングされた領域は+/- 1標準偏差を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> 図7:PBSで記録された脱気媒体の効果(A)完全スペクトルは、暴露時間と5つの独立したサンプル反復にわたって平均化。(B)3、4、5 MHz高調波の電力、および2.5、3.5、4.5MHzの超高調波での(C)電力。太い線はサンプル平均で、シェーディングされた領域は+/- 1標準偏差を示します。駆動条件は1.0 MHz、0.50 MPaピーク陰圧、1.0 msパルス持続時間、200 msパルス繰り返し期間であった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>パラメーター</td>
			<td>単位</td>
			<td>最低限</td>
			<td>最大</td>
		</tr>
<tr>
<td>周波数</td>
			<td>メガヘルツ</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>圧力(ピーク陰性)</td>
			<td>MPa</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>パルス長さ</td>
			<td>サイクル</td>
			<td>1</td>
			<td>右回り</td>
		</tr>
<tr>
<td>デューティサイクル</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>右回り</td>
		</tr>
<tr>
<td>露光時間</td>
			<td>s</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>表1: 報告されたパラメータの範囲の概要 vitro でのソノポレーションを促進する .

提示された実験プロトコルは、薬物送達および/または他の生物効果の成功に必要な条件の調査を可能にすることを目的として、細胞培養装置におけるキャビテーション活性のリアルタイム測定を行うために使用することができる。

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

これらのベンチトップシステム設計、データ収集および分析の原則は、キャビテーション強化療法のインビトロ研究のための合理的な基盤として使用することができる。当社の技術は、間隔キャビテーションモニタリング、反復可能なサンプルアライメント、一般的な細胞分析方法との互換性の重要な実験的属性を維持しながら、高スループットテストを可能にします。キャビテーション強化療法は、癌および脳卒中などの疾患の治療を含む複数の潜在的な用途を有する。下支えメカニズムをよりよく理解することで、より良い治療法を開発することができます。この研究は、多様なキャビテーション誘導細胞のバイオ効果の研究を可能にする、容易に再現可能なシステム設計および実装フレームワークを提供する。薬物送達、ソノポレーション、ソノプリンティングを含む。有意義な結果を得るには、実験のすべての変数の再現性と制御が必要です。関連するすべてのコントロールを実行し、電気的なノイズを測定することが不可欠です。音響トランスフェクション用のシステムの調製のために、100kPaの圧力で充填液を少なくとも2時間脱気して、伝播経路におけるキャビテーションの可能性を最小限に抑える。酸素の分圧が10kPa以下であることを溶存酸素プローブで確認することが推奨されます。試験室をゆっくりと充填して、脱気液への空気の再導入を最小限に抑え、トランスデューサと中容器表面から残った気泡をすぐに取り除きます。超音波の電源パワーアンプは、時間に対してゲインと出力が安定するように、メーカーの推奨に従ってウォームアップすることができます。そして、マクロの泡を包み込んだり、薬剤を破壊することなく均一な懸濁液を作るために穏やかに、そして継続的に攪拌しながらキャビテーション剤を希釈します。マイクロバブルを扱う場合は、慎重に処理してください。SAT2調製の場合、実験を開始する前に、エタノールを使用してPDMリッドを殺菌します。殺菌した蓋を培養皿に合わせて細胞コンパートメントを形成し、充填液の10ミリリットルを備えた18ゲージの鈍い針を装備した10ミリリットルの注射器を装う。PDMの1つを通して針を挿入し、ゆっくりと傾いている間にチャンバーを満たし、マクロの泡が開いた穴を通って逃げることができるようにする。チャンバーが充填されたら、開いた穴に4〜5ミリメートルのポリマーロッドを挿入し、穴が水平になるようにアセンブリを配置します。余分な液体を注入しながら針を取り除き、空気がチャンバーに引き込まれないようにし、別のポリマーロッドで充填穴を閉じます。エントラップされたマクロバブルの証拠をコンパートメントを視覚的にチェックし、セル露出コンパートメントをコンパートメントホルダーに合わせます。懸濁液中の粒子の浮力と、細胞暴露コンパートメントの向きを決定する際に、それらの浮力が細胞との接触にどのように影響するかを考えてみましょう。次に、デバイスの水没部分に安静からマクロ気泡を阻止するために水平角度でチャンバー蓋を下げ、チャンバーの上部に蓋を取り付けます。実験測定を行う前に、懸濁液をチャンバー温度と熱的に平衡化させる。チャンバー内の温度が安定していることを確認するために細かい針熱電対を使用して。リアルタイムで実験を監視するには、時間と周波数の両方のドメインで、データ収集プロセスを開始し、超音波ソースドライブ信号をオンにします。高電圧プローブを使用して、実験中に超音波源を駆動するアンプ出力信号を監視し、露光が期待どおりに進行していることを確認します。そして、オシロスコープがプローブの減衰を補うように設定されていることを確認してください。パッシブキャビテーション検出器の時間領域モニタリングは、信号が現在の計装設定に適しているかどうか、およびキャビテーション信号が予想よりも早く見られるかどうかを明らかにします。周波数領域のモニタリングは、気泡の動作の種類の分析を可能にし、所望の細胞刺激を達成するために必要に応じてドライブレベルを調整するために使用することができます。この分析では、最も低い入射圧力で、受動キャビテーション検出器応答は、0.5MHzの基本的な超音波周波数の整数高調波から完全に構成された。0.2から0.3MPaに増加すると、さらに高い整数高調波に加えて、スペクトルの顕著な超高調波をもたらした。この2つの圧力でのタイムドメイン波形は同様に見えたが、0.3MPaの結果はパルス持続時間に対してより多くの変動性を示した。最も高い圧力では、時間領域波形の振幅は、明らかに上昇したブロードバンドノイズの結果として、低い圧力に対して非線形に成長し、マイクロバブル破壊によって引き起こされる慣性キャビテーションによる可能性が高い。ここでは、完全なスペクトルが50秒間の露光時間にわたって示され、その間、ソースは0.2秒ごとに2ミリ秒のパルスを放出した。このグラフで観察されるように、対応する全高調波および広帯域電力を示し、大きな振幅広帯域応答を生成し、最大の気泡の破壊と相関すると考えられる初期スパイクを用いた。数秒後、ブロードバンド応答は急速に減少し、明らかにバブル破壊が原因です。この分析では、マイクロ気泡と正常PBSの20〜1希釈を用いて、時間およびサンプル平均スペクトルは、焦点が合っていない受動キャビテーション検出器が焦点検出器よりも強い広帯域応答を含んでいたことを示した。高調波力と超高調波力の両方で変動性をサンプリングするサンプルを減らしました。キャビテーション誘導バイオ効果は、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、生物学的アッセイなどの技術を用いて評価することができる。これにより、キャビテーション活性と生物学的影響との間に強固な関係が確立される。この技術は、キャビテーション媒介性薬物送達を支えるいくつかの潜在的な新しいメカニズムを明らかにしたバブル挙動と生物学的効果との関係をよりよく特定することを可能にした。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

マイクロバブルのInsonationは減少時間平均音響パワーで、同様に治療薬の標的化送達のための腫瘍切除のための有望な戦略である。本研究の目的は、皮下C6神経膠腫への非熱的血管アブレーションとペイロードの配信を最大にするためには、低いデューティサイクルの超音波パルス化戦略とナノキャリアを開発することである。...

コントラストの超音波は、薬剤ベアリングナノ粒子デリバリーと微小血管アブレーションを経由してマウスの神経膠腫の治療を対象と

マイクロバブル破壊（UTMD）ターゲット超音波検査は、心臓や肝臓などの超音波にアクセス可能な臓器を標的とする治療用遺伝子を含む生理活性分子の部位特異的送達を、、、指示するために使用することができます。...

超音波標的マイクロバブル破壊テクニック入門

パワー超音波に提出した液体中の音響キャビテーションは音ルミネセンスとして知られる、珍しい化学反応性と発光の起源である崩壊泡、内部の過渡的な極端な条件を作成します。希ガスの存在下では、非平衡プラズマが形成されている。 「ホット」粒子と崩壊する気泡によって生成された光子は、溶液中の化学種を励起することができる。...

分子、イオン、および音響キャビテーションと固体粒子を活性化

ヒト白血病細胞の選択的損傷は、白血病細胞および正常造血細胞の化学療法前処理の有無にかかわらず、低周波超音波を適用する新しいアプローチを通じて達成することができます。...

未処理および処理腫瘍細胞のソニック感受性を決定するための生成およびパルス低周波超音波の定量分析

マイクロ流体チップを作製し、タンデムバブル生成用の金ドットと、その近くのシングルセルパターニング用のフィブロネクチン被覆島を生成しました。得られた流れ場は、粒子画像速度測定によって特徴付けられ、細胞膜ポレーション、膜変形、細胞内カルシウム応答など、さまざまな生体効果の研究に使用されました。...

単一細胞レベルでのキャビテーション気泡（複数可） - 細胞相互作用し、得られた生体効果を調査するための表面パターニングとマイクロ流体システム

このプロトコルは、近赤外パルス レーザー光と強力集束超音波 (HIFU) の両方に同時暴露により、ファントムに生じるキャビテーションの制御可能な核生成を示します。キャビテーションの活動は、HIFU...

高強度を強化するため金ナノ粒子プラズモニックからキャビテーションの制御可能な核集中超音波アプリケーション

血液脳関門(BBB)は、マイクロバブル媒介性集中超音波(FUS)で一時的に破壊することができる。ここでは、非超音波専門家がアクセス可能なモジュラーFUSシステムを使用して、高スループットBBBのインビボでの開口のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。...

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

キャビテーションマイクロバブルは、ズームレンズに取り付けられた高速カメラを使用して画像化されます。実験のセットアップが説明され、画像解析を使用してキャビテーションの面積を計算します。画像解析は ImageJ...

高速カメラによる高速マイクロバブルのイメージングと定量化

我々は、非対称受容体柄の基板上にセルローリング軌跡を観察し、分析するためのプロトコルについて説明します。結果のデータは、ラベルフリー細胞分離と解析のための受容体柄の基板のエンジニアリングするのに便利です。...

非対称受容体のパターンでセルローリング軌道を勉強

プラズモニックピンセットとフォトニック結晶のナノ構造は、光学的にマイクロおよびナノ粒子を捕集の効率性と配向制御に有用な機能強化を作成することが示されている。...

強化されたマイクロおよびナノ操作のためのプラズモニックとフォトニック結晶ナノ構造の利用

学ぶキャビテーション強化療法のリアルタイム測定法。細胞培養装置を用いて気泡動態をモニタリングし、創薬やソノポレーションなどの生体効果を評価する再現性の高い実験システムを構築します。

キャビテーション強化療法の研究

さらに動画を探す