Name: 神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶ 皮膚線維芽細胞から筋芽細胞への直接リプログラミング法。レンチウイルスを用いてMYOD遺伝子を導入し、神経筋障害の病態解明と治療法開発のための患者由来細胞モデルを迅速に構築する技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

過去にモデルに関する知識を共有してくれたヴィンセント・ムーリー博士に感謝したいと思います。この研究は、米国国立衛生研究所神経障害・脳卒中研究所(R01 NS043264(K.M.F.、 R.B W.))、米国国立国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所(NIAMS)(P50 AR070604-01(K.M.F.、K.M、R.N.、N.W.)。N.W.は、オハイオ州立大学/全国小児病院マッスルグループとフィリップ財団からフェローシップサポートを受けています。この作品はまた、内部の裁量資金によってサポートされ、エキソン2スキップ作業の一部は、CureDuchenne(K.M.F.)とアソシエーションフランセーズコントレミオパシーによってもサポートされています。IRB 番号: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 および IBCSC#: IBS00000123.

<ol><li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+down-regulates+the+myogenic+regulatory+factors+in+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Replicative aging down-regulates the myogenic regulatory factors in human myoblasts.</a> Biology of the Cell. 100 (3), 189-199 (2008).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (34), (2011).</li>
<li>Pantic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+versatile+immortal+muscle+cell+models+from+healthy+and+myotonic+dystrophy+type+1+primary+human+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reliable and versatile immortal muscle cell models from healthy and myotonic dystrophy type 1 primary human myoblasts.</a> Experimental Cell Research. 342 (1), 39-51 (2016).</li>
<li>Thorley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+characteristics+are+preserved+in+hTERT%2Fcdk4+human+myogenic+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle characteristics are preserved in hTERT/cdk4 human myogenic cell lines.</a> Skeletal Muscle. 6 (1), 43(2016).</li>
<li>Chaouch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+skin+fibroblasts+expressing+conditional+MyoD+as+a+renewable+and+reliable+source+of+converted+human+muscle+cells+to+assess+therapeutic+strategies+for+muscular+dystrophies%3A+Validation+of+an+exon-skipping+approach+to+restore+dystrophin+in+duchen%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Immortalized skin fibroblasts expressing conditional MyoD as a renewable and reliable source of converted human muscle cells to assess therapeutic strategies for muscular dystrophies: Validation of an exon-skipping approach to restore dystrophin in duchen.</a> Human Gene Therapy. 20 (7), 784-790 (2009).</li>
<li>Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+cell+and+animal+models+of+human+disease+by+genome+editing+using+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9.</a> The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).</li>
<li>Echevarría, L., Aupy, P., Goyenvalle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-skipping+advances+for+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Exon-skipping advances for Duchenne muscular dystrophy.</a> Human molecular genetics. 27 (2), 163-172 (2018).</li>
<li>Hwang, J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+exon-skipping+therapies+using+antisense+oligonucleotides+and+genome+editing+for+the+treatment+of+various+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in exon-skipping therapies using antisense oligonucleotides and genome editing for the treatment of various muscular dystrophies.</a> Expert reviews in molecular medicine. 21, 5(2019).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Skipping+of+Single+Exon+Duplications+in+DMD+Patient-Derived+Cell+Lines+Using+an+Antisense+Oligonucleotide+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Efficient Skipping of Single Exon Duplications in DMD Patient-Derived Cell Lines Using an Antisense Oligonucleotide Approach.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (3), 199-207 (2017).</li>
<li>De Angelis, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+snRNA+molecules+carrying+antisense+sequences+against+the+splice+junctions+of+exon+51+of+the+dystrophin+pre-mRNA+induce+exon+skipping+and+restoration+of+a+dystrophin+synthesis+in+%CE%9448-50+DMD+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Δ48-50 DMD cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (14), 9456-9461 (2002).</li>
<li>Gorman, L., Suter, D., Emerick, V., Schümperli, D., Kole, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+alteration+of+pre-mRNA+splicing+patterns+by+modified+U7+small+nuclear+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stable alteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclear RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 4929-4934 (1998).</li>
<li>Wein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+from+a+DMD+exon+5+IRES+results+in+a+functional+dystrophin+isoform+that+attenuates+dystrophinopathy+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translation from a DMD exon 5 IRES results in a functional dystrophin isoform that attenuates dystrophinopathy in humans and mice.</a> Nature Medicine. 20 (9), 992-1000 (2014).</li>
<li>Auré, K., Mamchaoui, K., Frachon, P., Butler-Browne, G. S., Lombès, A., Mouly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+on+oxidative+phosphorylation+of+immortalization+with+the+telomerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Impact on oxidative phosphorylation of immortalization with the telomerase gene.</a> Neuromuscular Disorders. 17 (5), 368-375 (2007).</li>
<li>Barde, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+control+of+gene+expression+in+the+hematopoietic+system+using+a+single+Tet-on+inducible+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector.</a> Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).</li>
<li>Amack, J. D., Mahadevan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+defects+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myogenic defects in myotonic dystrophy.</a> Developmental Biology. 265 (2), 294-301 (2004).</li>
</ol>

全国小児病院は、オーデンテス・セラピューティクスにここに記載されているエクソン2スキッププログラムをライセンスしています。K.M.F.とN.W.は、このライセンスの結果としてロイヤリティ支払いを受け取りました。

良質のFM細胞株を得るためには、いくつかのステップが重要です。皮膚生検が早く処理されるほど、健康な線維芽細胞を得る可能性が高くなります。線維芽細胞培養の通過数も重要である。原発細胞は増殖能力が限られており、多くの通過後、それらは複製老化に入る。したがって、できるだけ早い通路で低い通過数で線維芽細胞のストックを有し、細胞を変換する方が良い。 
もう一つの重要なステップはまた、最大の純度と正確な定量を有するウイルス産生を有することです。例えば、qPCRを用いたウイルスゲノム定量は合理的な測定を提供するが、ddPCR(デジタル液滴PCR)による定量はより正確である。
さらに、筋芽細胞変換のための線維芽細胞の適切な合流点が重要である。細胞が70%以下または80%以上のコンフルエントである場合、筋原性分化が損なわれる可能性がある。細胞があまりにもコンフルエントである場合、染色およびイメージングを妨げる筋管の層の重ね合わせがあります。ドキシサイクリンの濃度は、 ミオド 遺伝子の正確な活性化および持続的な発現のために重要で...

ヒト組織から直接得られた細胞モデルは、元のゲノムコンテキストを有し、多くの場合、患者に観察された同じ分子および細胞の特徴を再現するという利点を有する多くのヒト遺伝性疾患をモデル化するのに有用である。神経筋疾患の分野では、筋肉生検はヒト重芽細胞の大きな源であり、病理学的メカニズムの解明に役立っています。さらに、それらは、薬物および遺伝子治療のインビボ試験のための重要なツールである。一方で、筋断片からの筋芽細胞の導出は比較的容易である。一方、プライマリ・ミオブラテストの培養や維持は、その増殖速度が限られており、vitro1では老化が反復的であるため、困難である。これらの制限の代替は、骨格筋特徴4の保存を伴うヒトテロメラーゼ(hTERT)および/またはサイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)遺伝子2、3を挿入して筋芽細胞を不死化させることである。それにもかかわらず、原発性筋芽細胞の鈍化は、多くの場合、進行した変性において筋肉を有する患者に不利益を伴う外科的処置である筋肉生検に依然として依存している。したがって、これらの患者の筋肉は、線維性および/または脂肪組織の有意な割合で構成され、より少ない筋肉細胞を生み出し、以前は不死化に細胞の精製を必要とする。
筋肉生検とは対照的に、皮膚生検はよりアクセスしやすく、患者にとって有害性が低い。原発性線維芽細胞は、 インビトロの皮膚断片に由来する。線維芽細胞は主に神経筋障害を引き起こす突然変異の影響を受けませんが、筋芽細胞にトランス分化することができます。これは 、ミオド 遺伝子の挿入によって達成され得る、筋原性調節転写因子5.本稿では、線維芽細胞培養の確立から分化された筋管の隠れにまで、トランス分化された筋芽細胞を得るためのプロトコルについて述べる(この方法の代表的な要約は 図1に示されている)。
治療戦略の前臨床検査は、ヒト患者に見られる突然変異と同様の突然変異を運ぶ細胞および動物モデルに依存する。CRISPR/Cas96などの遺伝子編集技術の進歩により、動物モデルの開発は実現可能になりましたが、依然として困難でコストがかかります。したがって、患者由来細胞株は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)などの疾患の突然変異の大きなスペクトルをカバーするモデルを有するアクセス可能な選択肢である。細胞モデルの隠れと作成は、このような病理のためのパーソナライズされた治療法の開発に不可欠です。
調査されたパーソナライズされた治療法の中で、エキソンスキップ戦略は、異なる筋ジストロフィー7、8のための有望なものの一つです。この戦略は、より短いが機能的なタンパク質を産生する。これは、最終的なメッセンジャーから変異したエキソンを除外して、スプライセソームにエキソン定義を隠すことによって実行されます。これは、DMDのためのFDAによって承認されている非常に有望な技術です.したがって、我々はまた、このプロトコル、アンチセンスオリゴヌクレオチド(AON)およびU7snRNA-アデノ関連ウイルス(AAV)の2つの異なるエキソンスキップ関連技術を有するミコールトをトランスフェクトする方法を記述する。AONトランスフェクションは、エキソンスキップ9を促進するように設計されたいくつかの配列の初期スクリーニングのための良いツールです。ただし、AnIN のアクティビティは一時的なものです。アンチセンス配列の持続的発現を得るために、我々はまた、AAVと結合した小型核RNA(snRNA)を探索し、核の局在化およびスプライシング機構10への包含を可能にした。U7は、スプライセソームにリダイレクトし、アンチセンス配列11を送達するタンパク質を結合するように操作することができるヒストンmRNAの処理に関与するsnRNAである。AAVベクターと組み合わせて修飾されたU7 snRNAを使用すると、AINの継続的な発現および関心のある組織の優れた伝達をもたらすAOの限界を克服する。このプロトコルにはDMD患者由来の細胞を使用して、エキサボッピング戦略を説明します。

<table><tbody><tr><td>100 mm ディッシュ</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>2500056</td><td></td></tr><tr><td>10X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>20X トランスファーバッファー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>NP00061</td><td></td></tr><tr><td>20X トリス酢酸 SDSランニングバッファー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>LA0041</td><td></td></tr><tr><td>3-8% トリス-アセテートゲル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>EA0378BOX</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗ミオシン 100X</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>抗ミオシン重鎖、サルコメア抗体</td><td>開発研究 ハイブリドームバンク</td><td>MF20 上清</td><td>希釈 1:50</td></tr><tr><td>抗酸化剤</td><td>サーモフィッシャー</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>BCA タンパク質アッセイ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D3571</td><td>希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>ジジトニン</td><td>ミリポア Sigma</td><td>300410250MG</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、GlutaMAX サプリメント、ピルビン酸</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10569044</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I セット (250U)</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>E1010</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン塩酸塩</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2653-5</td><td></td></tr><tr><td>Dup2 ヒトプライマー</td><td>Fw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG TTTCTC 3'Rv_5</td><td>' CTTTTGGCAGTTTTTGCC CTGT 3'</td><td></td></tr><tr><td>ジストロフィン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td>希釈率 1:200</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス、アレクサ フルーア 488</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A11001</td><td>希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>停止プロテアーゼ阻害剤カクテル 100X</td><td>サーモフィッシャー</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>ハウサーサイエンティフィック</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD ヤギ 抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Li-Cor</td><td>926-68071</td><td>希釈 1:5000</td></tr><tr><td>Lab-Tek II CC2 チャンバースライドシステム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15852</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli</td><td>Bioworld</td><td>105700201</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 3000 トランスフェクション試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル GFR 膜マトリックス</td><td>コーニング</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>Mr. フロスティ 冷凍容器</td><td>サーモフィッシャー</td><td>51000001</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロース メンブレン 0.45 & マイクロ;m</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat serum control</td><td>Thermo Fisher</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer (PBS)</td><td>Li-Cor</td><td>927-40003</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PCR マスターミックス</td><td>Thermo Fisher</td><td>K0172</td><td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤</td><td>Thermo Fisher</td><td>A32957</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1113803</td><td></td></tr><tr><td>Revert 700 Total Protein Stain for Western Blot Normalization</td><td>Li-Cor</td><td>926-11021</td><td></td></tr><tr><td>RevertAidキット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNA クリーン&Concentrator-25</td><td>Zymo Research Corporation</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Aspen Surgical</td><td>372611</td><td></td></tr><tr><td>Skeletal Muscle Cell Differentiation medium</td><td>Promocell</td><td>C23061</td><td></td></tr><tr><td>Skeletal Muscle Cell Growth medium</td><td>Promocell</td><td>C23060</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>超低温フリーザー</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>7402</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA、pH 8.0</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド退色防止封入剤</td><td>Vector Labs</td><td>H1000</td><td></td></tr></tbody></table>

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

Direct Reprogramming of Human Fibroblasts into Myoblasts to Investigate Therapies for Neuromuscular Disorders

筋ジストロフィーにおける病態生理学と治療標的の両方に関する調査は、ヒト近母細胞の限られた増殖能力によって妨げられている。いくつかのマウスモデルが作成されましたが、彼らは本当に病気の人間の生理病理学を表していないか、ヒトに見られる突然変異の広いスペクトルを代表していません。ヒトの原発筋細胞の不死化は、この制限に代わるものである。しかし、それはまだ侵襲的で簡単に利用できない筋肉生検に依存しています。対照的に、皮膚生検は患者に対して入手しやすく、侵襲性が低い。皮膚生検に由来する線維芽細胞は、不死化し、筋芽細胞にトランスファノファナイズすることができ、優れた筋形成電位を有する細胞の供給源を提供する。ここでは、線維芽細胞を筋原性系統に迅速かつ直接的にリプログラミングする方法について述べている。線維芽細胞は2つのレンチウイルスでトランスタイブされる:一次培養を不滅にする hTERT とテト誘導性 MYODは、ドキシサイクリンの添加時に線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その後、後期分化マーカーを発現する成熟した筋芽細胞の変換を誘導する。この迅速なトランスセ分化プロトコルは、病理学的メカニズムを調査し、神経筋疾患に対する革新的な遺伝子ベースまたは薬理学的生物療法を調査するための強力なツールを表しています。

このプロトコルは、ヒト皮膚由来線維芽細胞培養を確立し、それらを筋芽細胞に変換し、次に分化された筋管に変換する方法を示しています。このタイプの細胞株は、神経筋障害の研究や潜在的な治療法の インビトロ試験に非常に 有用である。
線維芽細胞変換の概略図を図1に示す。図2Aは、皮膚の断片とそれから出てくる線維芽細胞を示す。合流に達したら、線維芽細胞を新しい皿に渡す必要があります(図2B)。図3Aは、ドキシサイクリンを補充した筋芽細胞増殖培地に変化する前の線維芽細胞の理想的な合流点を示す。細胞は変換プロセス中にまだ増殖するため、約70%のコンフルエントである必要があります。細胞が80%以上のコンフルエントである場合、分化が損なわれる可能性があります。筋芽細胞への変換には2~4日かかり、形態の観察によって確認されます。<strong cla...

このプロトコルは、皮膚線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その分化を筋管に変換することを記述する。細胞株は神経筋疾患の患者に由来し、病理学的メカニズムを調査し、治療戦略をテストするために使用することができる。

Investigations into both the pathophysiology and therapeutic targets in muscular dystrophies have been hampered by the limited proliferative capacity of ...

みなさん。私の名前はニコラス・ウィーンです。私はオハイオ州コロンバスの全国小児病院の主任研究者です。そして今日、私たちはあなたに皮膚生検を取り、筋芽細胞と筋管に変換する方法についてのビデオを紹介するつもりです。これは神経筋障害を研究するための非常に有用なツールです。さらに、このタイプの細胞と直接戦うために2種類のウイルスを使用しているため、IPSCと比較して技術が高速化されます。このビデオは、ヒト皮膚由来線維芽細胞培養物、筋芽細胞への転換、および分化された筋管を確立するためのプロトコルを示す。皮膚生検は、皮膚線維芽細胞を導出するために細胞培養物に移される。hTERTおよびMYOD遺伝子を運ぶレンチウイルスは、これらの線維芽細胞をトランスデュースするために使用される。ドキシサイクリンを添加した筋芽細胞増殖培地を添加すると、MYOD遺伝子が発現し、線維芽細胞の重芽細胞の重芽への変換を誘導する。次に、培地を分化培地に切り替え、またドキシサイクリンを添加する。その後、筋芽細胞は互いに融合し、多核筋管を形成する。チューブから培地を吸引し、生検を10ミリリットル、室温で1xPBS、3回洗いすす。3回目の洗浄後、PBSをチューブに残します。PBSと皮膚生検を10センチメートルの正方形の皿に注ぎます。無菌メスを使用して、生検をできるだけ小さく切ります。ピペットを使用して、個々のスキンピースを無菌10センチメートルの正方形の皿に移します。各部分の周りからPBSの過剰を吸引します。作品自体を吸引しないように注意してください。蓋を部分的に蓋で覆い、皮膚生検片を5〜20分間乾燥させます。作品が長く乾かないようにしてください。片が乾燥したら、皿を45度の角度で傾け、皿の隅に12ミリリットルの線維芽細胞培地をゆっくりと加えます。皿を下ろし、慎重にメディアを配布して、メディアによって破片が持ち上げられないようにします。食器をインキュベーターに入れる。5~7日でメディアを交換し、その後週に1回交換してください。翌日の12ウェルプレートの30%と12ウェルプレートの2つのウェルで一次線維芽細胞をシードし、1ウェルあたり約20,000個の細胞を有する。レンチウイルス伝達の場合、hTERP プロマイシン レンチウイルスの 20 億から 50 億のウイルスゲノムと線維芽細胞培地の 400 マイクロリットルを追加します。レンチウイルスミックスを1つの井戸に加えます。第二の井戸に、線維芽細胞培地のわずか400マイクロリットルを追加します。翌日、1ミリリットルのメディアを追加します。1〜2日後、細胞を6つのウェルプレートに移し、60〜70%の合流に達するまで増殖させる。プロマイシンのミリリットルあたり1マイクログラムで線維芽細胞培地を補い、各井戸に2ミリリットルを加えます。コントロールウェル内のすべてのセルが少なくとも12日間死んでしまい、2~3日ごとにメディアが変化するまで、セルを選択したままにします。12ウェルプレートの3つのウェルで30%合流で線維芽細胞を発現するシードHチャートは、翌日に約50%の合流を有する。レンチウイルス伝達の場合、MYODハイグロマイシンBレンチウイルスの2〜50億個のウイルスゲノムと400マイクロリットルの線維芽細胞培地を混合し、2つの井戸に加える。翌日に1ミリリットルの培地を加えます。1〜2日後に細胞を6つのウェルプレートに移し、60〜70%コンフルエントまで成長させる。ハイグロマイシン B のミリリットルあたり 400 マイクログラムを含むサプリメントの成長培地.コントロールウェル内のすべての細胞が死ぬまで細胞を選択し、通常は少なくとも12日かけて、2〜3日ごとに培地を変更します。筋芽細胞の誘導のために、彼らは70%コンフルエントになるまで線維芽細胞を成長させます。ミオシルト成長培地にドキシサイクリンのミリリットル当たり8マイクログラムを追加します。.常にドキシサイクリンと培地の新鮮なアリコートを使用してください。メディアは、メディアが変更される直前に準備する必要があります。さらに、ドキシサイクリンは再凍結してはならない。線維芽細胞培地を吸引し、PBSで細胞をすすいだ。補充された筋芽細胞培地の10ミリリットルを追加します。2〜3日後、細胞は90〜95%コンフルエントであり、その形態は変化している。筋芽細胞増殖培地を吸引し、細胞表面をPBSですすいだ。新鮮なドキシサイクリンのミリリットルあたり8マイクログラムで補われた分化培地の10ミリリットルを追加します。.myotube が形成されるまで、2~3 日ごとにメディアを変更し続けます。myotube 分化の開始から 7 ~ 10 日、細胞は完全に分化する必要がありますが、これは細胞株によって異なります。最初の線維芽細胞は、皮膚片が培養された5日後に出現する可能性がある。図Bでは、線維芽細胞はコンフルエントであり、さらなる増殖のために75センチメートルの正方形フラスコに移される準備ができている。原発細胞が複製老化に入るにつれて、低い通過数で線維芽細胞のいくつかのバイアルを凍結することが重要です。筋芽細胞のミオチューブへの変換のためにFM細胞株が確立されると、線維芽細胞は、A図に示すように70%コンフルエントまで増殖しなければならない。ドキシサイクリンを培地に添加した後、2〜4日以内に細胞は、画像B.分化筋管に見られるように細長い形態と平行配向によって特徴付けられる筋芽細胞となり、画像Cに示されている。セルは、デタッチする前に収集または固定する必要があります。剥離の始まりは、この写真の矢印で指摘されているように、myotubeの縁の色と明るさによって観察することができます。免疫蛍光によって、成熟した筋肉特異的タンパク質の発現は、線維芽細胞の筋管への正常な変換を確認する。これらの写真では、3つの異なるセルが示されています。分化の程度は細胞によって異なり、図BおよびC.RnAseqによってさらに検証されたモデルの細胞の場合、一次突然変異によって影響を受けるかもしれないし、影響しない場合もある。このプロットに示すように、FM筋で検出された12,000以上の微分発現遺伝子は骨格筋の遺伝子と比較してある。両方のトランスクリプトムの有意な相関関係は、FM細胞が筋肉由来細胞株の有用で信頼性の高いサロゲートであることを示す筋肉特異的発現プロファイルを有することを支持する。このin vitroモデルの有用性を説明するために、DMD遺伝子の中で最も一般的なエキソン重複の1つを使用しました。Exon 2の重複はDMDの読書フレームの中断につながり、そのスキップは、その読み取りフレームの復元または内部リボソームエントリサイトの利用につながる可能性があります。この治療法は既にインビボ研究で検証されており、図Aは、この特定の変異細胞株のRTPCR分析により、エキソンスキップによる治療の有無にかかわらず概念実証を実証した。図Bのウェスタンブロットは、機能性ジストロフィンタンパク質が処理細胞で発現していることを示している。この治療法の効率を生体内モデルと比較すると、細胞分化技術の信頼性をサポートし、変異特異的遺伝子治療の試験に使用をサポートします。臨床研究の前に、動物および細胞モデルの能力に応じて、神経筋疾患に対する公式の治療支援の有効性をテストする必要があります。動物モデルの開発は、今日では容易であるが、その各特定の突然変異のための実現可能な選択肢ではない。真皮線維芽細胞に由来するIPS細胞を介した筋芽細胞の生成は代替手段ですが、時間のかかる技術です。したがって、この手順は、線維芽細胞を筋芽細胞に直接変換することを可能にするIPS生成に代わる単純な方法である。これは、筋肉生検のより侵襲的な適用を避けることによってヒト細胞モデルへのアクセスを容易にする結論として、線維芽細胞の筋芽細胞へのこの直接変換は、特定の文脈において神経筋障害の治療をテストするための強力なツールである。

direct-reprogramming-human-fibroblasts-into-myoblasts-to-investigate

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

筋芽細胞移植の成功を評価するための非侵襲的な手段が記載されている。この方法は、その発現が異なる撮像モダリティで撮影することができる遺伝子を統合的融合レポーター遺伝子を利用しています。ここでは、利用すること...

移植筋前駆細胞を標的とする分子イメージング

このプロトコルは、筋ジストロフィー患者からの尿由来細胞の分離のための詳細な手順を伴います。それらは、センダイウイルスの形質導入を通じて効率的かつ迅速に再プログラミングされます。...

筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

このプロトコルは、筋肉または皮膚組織からの筋原性および線維芽細胞株の生細胞単離および初代培養の技術について説明しています。 これらの細胞株を不死化するための技術についても説明する。...

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

直接神経細胞リプログラミングと、開始の体細胞の年齢を維持するニューロンが生成されます。ここでは、大人の人間のドナーから得られる皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞を生成する単一ベクトル...

ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

機能的な心筋細胞発現 Tbx5、ミール 1 とミール 133 Mef2c、Hand2 GATA4 (GHMT2m) と一緒に TGF-β シグナルの阻害を介してプライマリ胚性線維芽細胞を再プログラムする手法をご紹介します。我々 のプロトコル 60% までの 7...

プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した

ここで初期化因子をエンコード変更された Mrna を用いた誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞をプログラムし直すための臨床的に関連性の高い、高効率、フィーダー フリー法について述べるし、成熟したマイクロ Rna 367/302 を模倣しています。リプログラミング効率を評価する手法クローン iPSC のコロニーを拡大し、トラ 1 60...

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

ヒト皮膚由来線維芽細胞を誘発ニューロン前駆細胞(iNIC)に再プログラムするプロトコルと、その後の誘導アストロサイト(iA)への分化について説明する。この方法は、iNPCとiAを大量に高速かつ再現可能に生成します。...

線維芽細胞からニューロン前駆細胞への直接変換とアストロサイトへの分化を用いた神経疾患のインビトロモデリング

ここでは、メラノサイト用に最適化されたダイレクトリプログラミングシステムと、スムーズなダイレクトリプログラミングを保証する高効率で濃縮されたウイルスパッケージングシステムについて説明します。...

マウス線維芽細胞のメラノサイトへの直接リプログラミング

学ぶ 皮膚線維芽細胞から筋芽細胞への直接リプログラミング法。レンチウイルスを用いてMYOD遺伝子を導入し、神経筋障害の病態解明と治療法開発のための患者由来細胞モデルを迅速に構築する技術です。

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

さらに動画を探す