モジュラーゴールデンゲートクローニングを用いた多遺伝子構造の迅速な組み立て
2021年2月5日
このプロトコルの目的は、ゴールデンゲートクローニングに基づくモジュラークローニングシステムを使用して、マルチ遺伝子構造を組み立てるための詳細なステップバイステップガイドを提供することです。また、当社の経験に基づいて最適なアセンブリを確保するための重要な手順に関する推奨事項も示します。
これは、酵母MoCloキットを用いて多遺伝子プラスミドを組み立てるための詳細なプロトコルです。この方法により、さまざまな多遺伝子級のクローン作成が可能になります。関連部品の大きなライブラリを生成するのに理想的です。
ゴールデンゲート反応ミックスを設定することで始めます。各PCR産物とエントリーベクターのフェムトモレを20個加え、10X T4リガーゼバッファーの1マイクロリットル、Esp3Iの0.5マイクロリットル、およびT4リガーゼの0.5マイクロリットルを加える。二重蒸留水を加え、総体積を10マイクロリットルにします。
次に、クローニング反応を実行します。熱ショックにより、反応ミックス全体をDH5アルファ株または同等のエシェリヒア・コリ化学的に有能な細胞に変換します。1ミリリットルクロラムフェニコールあたり35マイクログラムのlbプレートに細胞を広げます。
その後、一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。16~18時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、約5時間摂氏4度にして、スーパーフォルダグリーン蛍光タンパク質またはsfGFPがより強い緑色に発達させます。プレートをスクリーニングするには、紫外線または青色光のトランスイルミエータに置きます。
コロニーを含むsfGFPは、UV光の下で蛍光を発する。緑色のコロニーは、ノーカット部分プラスミドが含まれているため、負です。白いコロニーは陽性である可能性が高い。
クローニングは、30〜100%白色のコロニーがある場合に成功します。中間ベクターを、左コネクタ、sfGFPドロップアウト、右コネクタ、酵母選択マーカー、複製酵母起源、mRFP1、大腸菌起源、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドの一部を組み立てます。テキスト原稿に記載されているとおりにクローニング反応を行います。
DH5アルファ株に全体の反応ミックスを変換し、ミリリットルカルベニシリンまたはアンピシリンあたり50マイクログラムでlbプレート上の細胞を広げます。一晩摂氏37度でインキュベートします。16~18時間後、インキュベーターからプレートを取り出します。
プレートには淡い赤と淡い緑のコロニーの両方が含まれます。mRFP1とsfGFPを成熟させるために約5時間摂氏4度に保ちます。UV またはブルー ライト のトランスイルミネーターを使用して、正しい中間ベクターを含む緑のコロニーを特定します。
lbカルベニシリンプレートに緑色のコロニーを取り出し、一晩で摂氏37度でインキュベートします。翌日、クロラムフェニコールプレートに再びストリークアウトし、一晩で摂氏37度でインキュベートします。クロラムフェニコールプレート上に成長するコロニーには、誤って組み立てられたプラスミドが含まれています。
中間ベクターが正常に組み立てられたら、転写ユニットの組み立てに進みます。この4ピースアセンブリには、中間ベクター、プロモーター、CDS、および決定要因が含まれています。プラスミドを精製し、その濃度を記録し、各プラスミドをマイクロリットル当たり20フェムトモレに希釈します。
クローニング反応を行った後、クローニング反応ミックス全体をDH5アルファまたは同等の大腸菌のコンピテントセルに変換し、LBNカルベニシリンにプレートします。その後、一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。16~18時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、約5時間摂氏4度に保ち、sfGFPを成熟させます。
UV または青色光のトランスイルミネーターを使用して、正しい転写ユニットを含む非蛍光白色コロニーを特定します。テキスト原稿に記載されているように、多遺伝子プラスミドの中間ベクターを組み立てる。その後、全体のクローニング反応ミックスをDH5アルファ細胞に変換し、ミリリットルカナマイシンあたり50マイクログラムでlbにそれらをプレートします。
一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。赤と緑の色ベースのスクリーニングを実行し、前に示したように誤ったアセンブリをスクリーニングするためにlbカナマイシンプレート上の緑のコロニーをストリークし、成長させます。次に、テキスト原稿に記載されているようにクローニング反応を設定して多遺伝子プラスミドを組み立てる。
全体のクローニング反応ミックスをDH5アルファ細胞に変換し、lbカナマイシンにそれらをプレートします。一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。次に、先に説明したとおりにグリーンとホワイトのスクリーニングを行います。
このプロトコルは、ADE2遺伝子座を破壊するための1つの統合的な多遺伝子プラスミドを構築するために使用された。4つの複製性および1つの統合的な多遺伝子プラスミドを組み立てた。中間ベクタークローニングに対する潜在的に正しいコロニーの比率は、中間プラスミドをクローニングすると1.83%であったが、中間体からのマルチ遺伝子プラスミドの組み立て成功率は93.77%であった陽性白色コロニーの無視できる数は、多遺伝子プラスミドの最適以下の集合を示す。
酵母に変えた後、β-カロテンとリコピンを産生するコロニーは3日目に成長した。各プレートから4つのコロニーを新鮮なプレートにストリークアウトし、さらに2日間成長させた。カロテノイドを抽出し、UV-Vis分光光度法によって定量した。
BTS1/ERG20は、ERG20単独の株に比べてβ-カロテンの35倍高い生産につながります。同様に、リコピンの生産は、ERG20単独と比較して、BTS1/ERG20の株で約16.5倍高い。多遺伝子統合プラスミドは、gRNAとヘルパーDNAを持たないか、gRNAとヘルパーDNAとして多遺伝子統合プラスミドのいずれかで、ADE2遺伝子座の破壊のために使用されました。
3~4日後、YPDプレートにNourseothricinを用いて赤色コロニーが観察され、ADE2が正常に破壊されたことを示す。この方法を試みている間に覚えておかねばなることが最も重要なことは、この反応ミックスを設定しながらDNA濃度を正確に測定し、ピペットを注意深く測定することです。この技術により、酵母代謝工学の分野の研究者は、製品収量を最大化するために多数の遺伝子およびプロモーターを調査することができます。
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概要
このプロトコルは、ゴールデンゲートクローニングに基づくモジュラークローニングシステムを使用して多遺伝子コンストラクトを組み立てるための詳細な段階的ガイドを提供します。これは様々な多遺伝子プラスミドのクローニングを効率的に行うことを目的としています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 遺伝学
- 分子生物学
背景
- 多遺伝子コンストラクトは様々な生物学的応用に不可欠です。
- Yeast MoCloキットはこれらのコンストラクトの組み立てを簡素化します。
- ゴールデンゲートクローニングはモジュラークローニングに広く使用されている方法です。
- 最適な組み立てには重要なステップへの注意が必要です。
研究の目的
- 多遺伝子コンストラクトを組み立てるための包括的なプロトコルを提供すること。
- 実践的な経験に基づく推奨事項を共有すること。
- 研究者が関連する部位の大きなライブラリを生成できるようにすること。
使用された方法
- ゴールデンゲート反応ミックスの設定。
- PCR製品とエントリーベクターの組み込み。
- 組み立てのためのT4リガーゼとEsp3Iの使用。
- 最適な条件のための反応量の調整。
主な結果
- 多遺伝子プラスミドの成功的な組み立て。
- 組み立て効率を高めるための重要なステップの推奨。
- 多様なコンストラクトライブラリの生成。
- 実践的な適用を通じたプロトコルの検証。
結論
- このプロトコルは多遺伝子組み立てのための信頼できる方法を提供します。
- 重要なステップに従うことの重要性を強調しています。
- 研究者は様々な遺伝学研究にこの方法を利用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid, modular assembly of multi-gene constructs using Golden Gate cloning accelerates the design-build-test cycle in synthetic biology and metabolic engineering. This hierarchical, scar-less workflow enables scalable construction of complex plasmids, supporting high-throughput pathway optimization and functional genomics in yeast and other systems. The approach enhances predictive confidence and portfolio flexibility at key discovery and engineering inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene combinations and regulatory elements for pathway elucidation.
- Supports functional validation of synthetic constructs in disease-relevant or production strains.
- Facilitates rapid prototyping for mechanistic de-risking and target prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, modular parts for reproducible assay development and screening workflows.
- Enables high-throughput generation of variant libraries for quantitative phenotype assessment.
- Streamlines preparation of validated constructs for downstream functional or screening assays.
Translational & Preclinical Research
- Supports metabolic pathway engineering for production strain optimization and biomarker discovery.
- Enables continuity from construct design through preclinical validation in engineered yeast models.
- Reduces risk by allowing parallel testing of multiple genetic configurations.
Pipeline & Workflow Integration
This modular cloning system integrates from early discovery through lead optimization and preclinical engineering, enabling iterative design and rapid construct validation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway mapping by enabling combinatorial gene assembly.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for construct performance comparison.
- Analytics: Facilitates visual and spectrophotometric readouts for rapid colony screening and product quantification.
- Translational Research: Bridges construct design with functional validation in production-relevant yeast systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized platform for multi-gene assembly across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in pathway engineering.
- Operational Value: Delivers high-throughput, standardized, and scalable construct assembly.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and efficient resource allocation in R&D pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and rapid advancement of engineered strains or pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning and quantitative DNA handling.
- Needs access to type IIS restriction enzymes, ligases, and fluorescence screening infrastructure.
- Demands rigorous standardization of DNA concentrations and pipetting accuracy for reproducibility.
- Adaptable to various model systems but may require optimization for non-yeast hosts.
- Success rates depend on careful assembly and screening; suboptimal conditions reduce efficiency.
