Name: モジュラーゴールデンゲートクローニングを用いた多遺伝子構造の迅速な組み立て (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶモジュラーゴールデンゲートクローニングによる多遺伝子構造の組み立て法。Yeast MoCloキットを用いて、T4リガーゼとEsp3Iで効率的にプラスミドライブラリを構築し、酵母代謝工学研究に応用する。

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この作品は、ニューヨーク州立大学研究財団(賞#71272)とバッファロー大学のインパクト賞(賞#:000077)によって資金提供されました。

著者らは開示するものは何もない。

Leeらが開発したMoCloベースのクローニングキットは、酵母ゲノムへの複製または統合のために、1〜5個の転写ユニットを多遺伝子プラスミドに迅速に組み立てる優れたリソースを提供します。このキットを使用すると、酵母で複数の遺伝子を発現する際に頻繁に存在する時間のかかるクローニングのボトルネックを排除します。
T4 DNAリガーゼでクローニングするゴールデンゲートの消化/ライゲーションサイクルについて、5つの異なる条件をテストしました。我々は、37°Cで5分間30サイクルの消化と5分間の16°Cでのライゲーション、50分間50°Cでの最終消化ステップ、10分間の80°Cでのタンパク質不活性化ステップが4ピースアセンブリで潜在的に正しい99.5%のコロニーをもたらしたことを発見した(補足図S1およびS33)。16°Cでのライゲーションにより、最適なリガーゼ活性とオーバーハングアニールが保証されます。50°Cでの最終消化は、消化された製品の再結紮を防ぎます。このサイクルは、特に指定されていない限り、すべてのアセンブリ反応に続いた。
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合成生物学は、製薬、農業、化学産業に役立つ新しい機能を備えた生物学的システムの設計を目指しています。大量のDNA断片をハイスループットに組み立てることは、合成生物学の基礎技術です。このような複雑なプロセスは、複雑さの減少に伴って複数のレベルに分けることができます, 基礎工学科学から借用概念1,2.合成生物学では、DNA断片は通常、機能性に基づいて階層的に組み立てられる:(i)部分レベル:「部品」は、プロモーター、コーディング配列、ターミネーター、複製の起源などの特定の機能を持つDNA断片を指します。(ii) 転写単位(TU)レベル:TUは、プロモーター、コード配列、および単一の遺伝子を転写することができるターミネーターからなる。(iii) 多遺伝子レベル:多遺伝子プラスミドは、代謝経路全体からしばしば構成される複数のTUsを含む。BioBrick コミュニティによって開拓されたこの階層的なアセンブリは、合成生物学3での大量の DNA の組み立てのための基本的な概念です。
過去10年間で4,5,6,7,ゴールデンゲートクローニング技術は、階層DNAアセンブリ2を大幅に促進しました。ギブソンクローニング8、ライゲーション非依存クローニング(SLIC)9、ウラシル切除基クローン(USER)10、リガーゼサイクリング反応(LCR)11、およびインビボ組換え(DNAアセンブラー)12、13など、他の多部クローニング法もこれまでに開発されてきた。しかし、ゴールデンゲートクローニングは、遺伝子固有の配列から独立しているため、理想的なDNA組み立て方法であり、1ポット反応で瘢痕のない方向性のあるモジュール式アセンブリを可能にします。ゴールデンゲートクローニングは、非パリンドローム配列を認識するタイプIIS制限酵素を利用して、認識部位2の外側にずらした突出しを作成する。リガーゼは、その後、アニールされたDNA断片を結合して、マルチパートアセンブリを得る。このクローニング戦略をモジュラークローニング(MoClo)システムに適用することで、正しく組み立てられたコンストラクト4を含む90%以上の形質転換体をスクリーニングした最大10個のDNA断片の組み立てが可能になりました。
MoCloシステムは合成生物学の設計ビルドテスト周期を加速させた大きな利点を提供する。まず、交換可能な部分は、パラメータの大きなスペースを迅速にテストするために組み合わせクローニングを可能にします。例えば、代謝経路を最適化するには、通常、経路フラックスのバランスをとるために、各遺伝子に対して多くのプロモーターを循環させる必要があります。MoCloシステムは、このような厳しいクローン作成タスクを容易に処理できます。第二に、一部のプラスミドを配列する必要がありますが、通常はTUまたは多遺伝子プラスミドではありません。ほとんどの場合、コロニーPCRまたは制限消化によるスクリーニングは、TUおよび多遺伝子プラスミドレベルでの検証に十分です。これは、プラスミドの部分をクローニングすることがPCRを必要とする唯一のステップであり、突然変異を頻繁に導入するためである。第三に、MoCloシステムは、多遺伝子複合体代謝経路を構築するのに理想的である。最後に、普遍的な張り出しのために、一部のプラスミドを再利用し、バイオエンジニアリングコミュニティ全体と共有することができます。現在、MoCloキットは、植物14、15、5、16、17、真菌6、18、19、20、21、22、細菌7、23、24、25、26、27、および動物28、29のために利用可能です。マルチ王国のMoCloプラットフォームも最近導入されました30.
サッカロミセス・セレビシエのために、Leeら6は、酵母合成生物学コミュニティのための優れたリソースである汎用性の高いMoCloツールキットを開発しました。このキットは便利な96ウェル形式で提供され、適切に特徴づけられるプロモーター、蛍光タンパク質、ターミネーター、ペプチドタグ、選択マーカー、複製の起源、およびゲノム編集ツールを多様に集め、8種類の交換可能なDNA部品を定義します。このツールキットは、最大5つの転写ユニットを多遺伝子プラスミドに組み立て可能にします。これらの特徴は、部分的または全体の経路が標的化学物質を産生するために過剰発現される酵母代謝工学にとって貴重である。このキットを用いて、研究者は、酵母におけるゲラニオール、リナロール31、ペニシリン32、ムコニン酸33、インジゴ34、およびベタレイン35の生産を最適化しました。
ここでは、MoCloツールキットを使用してエピソードまたはゲノム発現のための多遺伝子経路を生成する方法を導く詳細なステップバイステップのプロトコルを提供します。このキットを多用することで、ゴールデンゲート反応における各部の正孔分布を確保するために、DNA濃度の正確な測定が重要であることを発見しました。また、T7 DNAリガーゼよりもT4 DNAリガーゼを使用することをお勧めします。最後に、BsmBIおよびBsaIの内部認識サイトは、組み立て前に削除または家畜化する必要があります。あるいは、複数の内部部位を除去し、同時にコドン最適化を達成するために、部品を合成することを検討してもよい。我々は 、S.セレビシエ でβカロテンおよびリコピン産生のための5遺伝子経路を発現することによって、このツールキットを使用する方法を実証する。さらに、このキットのゲノム編集ツールを使用して ADE2 軌跡をノックアウトする方法を示します。これらの色ベースの実験は、可視化を容易にするために選択された。また、ゴールデンゲートクローニングを用いて融合タンパク質を生成し、アミノ酸変異を作り出す方法も実証します。

<table><tbody><tr><td>0.5 mmガラスビーズ</td><td>RPI研究製品</td><td>9831</td>酵母<td>細胞の溶解用</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD &会社</td><td>214010</td>酵母<td>完全合成培地(CSM)の成分バ</td></tr><tr><td>クトペプトン</td><td>BD&</td><td>211677</td>酵母<td>抽出物ペプトンデキストロース培地(YPD)</td></tr><tr><td>BsaI-HFv2</td>ニュー<td>イングランドバイオラボ</td><td>R3733S</td><td>の成分BsaI制限酵素</td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>4800-94-6</td>の高効率バージョン転写<td>ユニットレベルでのスクリーニングのための抗生物質</td></tr>クロ<tr><td>ラムフェニコール</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>56-75-7</td>で<td>スクリーニングするための抗生物質エントリーベクターレベル</td></tr><tr><td>CSM-His</td><td>Sunrise Sciences</td><td>1006-010</td><td>酵母完全合成培地(CSM)のアミノ酸サプリメント</td></tr>デ<tr><td>キストロース</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>D16-500</td><td>酵母完全合成培地(CSM)の炭素源</td></tr><tr><td>Difco酵母窒素ベースw / oアミノ酸</td><td>BD&会社</td><td>291940</td><td>酵母の窒素源 完全な合成媒体 (CSM)</td></tr><tr><td>dNTP ミックス</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>dNTPs PCR</td></tr><tr><td>Esp3I</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0734S</td><td>の高効率なアイソシゾマー BsmBI</td></tr><tr><td>Frozen-EZ 酵母 Trasformation II キット</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td>酵母変換</td></tr><tr><td>用 ヘキサンズ</td><td>フィッシャー ケミカル</td><td>H302-1</td><td>酵母細胞からのカロテノイド抽出用</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>25389-94-0</td><td>多重遺伝子プラスミドレベルでのスクリーニング用抗生物質</td></tr><tr><td>LB寒天培地、ミラー</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1425-2</td><td>E. coli培養</td></tr><tr><td>LBブロス、ミラー</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1426-2</td><td>E.コリ</em用の溶解性液体培地></td></tr><tr><td>リコピンケイ</td><td>マン化学NC1142173</td>の培養 <td></td><td>リコピン定量化</td></tr><tr><td>用 MoClo YTK</td><td>Addgene</td><td>1000000061</td><td>デポジットラボ:ジョン・デューバー</td></tr><tr><td>モナーク プラスミド Miniprep Kit</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>T1010L</td><td>E.coli</td></tr><tr><td>Nanodrop Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000c</td><td>正確なDNA濃度を測定するため</td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>統合的多遺伝子プラスミド線形化のための制限酵素</td></tr><tr><td>Nourseothricin Sulphate</td><td>Goldbio</td><td>N-500-100</td><td>この研究で使用したpCASプラスミドの抗生物質選択マーカー</td></tr><tr><td>Phusion HF反応バッファー (5X)</td><td>New England Biolabs</td><td>B0518S</td><td>Buffer for PCR using Phusion polymerase</td></tr><tr><td>Phusion ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0530S</td><td>すべてのPCR反応のためのハイフィデリティポリメラーゼ</td></tr><tr><td>pLM494</td><td>Addgene</td><td>100539</td><td>この研究で使用されたcrtI、crtYB、およびcrtEを増幅するために使用されるプラスミド</td></tr><tr><td>クォーツキュベット</td><td>サーモエレクトロン</td><td>10050801</td><td>カロテノイドの定量化用</td></tr><tr><td>T4リガーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td>ス <td>ゴールデンのためのM0202S</td><td>リガーゼゲートクローニング</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>BIO-RAD</td><td>1851148</td><td>すべてのPCRおよびクローニング反応を行うため</td></tr><tr><td>組織ホモジナイザー</td><td>ブレットブレンダー</td><td>モデル:BBX24</td><td>酵母細胞の均質化用</td></tr><tr><td>UV-Vis分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>Genesys 150</td><td>カロテノイドの定量用</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1422-500</td><td>酵母抽出物ペプトンデキストロース培地(YPD)の成分</td></tr><tr><td>&beta;-カロチン</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAH6010603</td><td>&beta;-カロチン定量用</td></tr></tbody></table>

モジュラーゴールデンゲートクローニングを用いた多遺伝子構造の迅速な組み立て

Rapid Assembly of Multi-Gene Constructs using Modular Golden Gate Cloning

ゴールデンゲートクローニング法は、ユーザー定義の配置で複数の遺伝子の迅速な組み立てを可能にします。それは彼らの認識部位の外に切り取り、短い突出しを作成するタイプIIS制限酵素を利用する。このモジュラークローニング(MoClo)システムは、プロモーター、コード配列(CDS)、ターミネーターなどの異なるDNA部分を最初にエントリーベクターにクローン化する階層的なワークフローを使用します。複数のエントリ ベクターは、転写単位に組み立てられます。その後、いくつかの転写ユニットが多遺伝子プラスミドに接続します。ゴールデンゲートクローニング戦略は、1ポット反応で、瘢痕、方向性、モジュール式の組み立てを可能にするため、大きな利点があります。階層ワークフローは通常、エントリベクターを超えてシーケンシングを必要としない、さまざまな多遺伝子構造の簡単なクローニングを可能にします。蛍光タンパク質ドロップアウトを使用することで、簡単な目視スクリーニングが可能です。この研究は、酵母モジュラークローニング(MoClo)キットを使用してマルチ遺伝子プラスミドを組み立てるための詳細なステップバイステップのプロトコルを提供します。多遺伝子プラスミド集合体の最適および最適以下の結果を示し、コロニーのスクリーニングのためのガイドを提供する。このクローニング戦略は、酵母代謝工学や多遺伝子プラスミドクローニングが必要な他の状況に非常に適用可能です。

ここで、βカロテン(黄色)およびリコピン(赤色)産生に対する4つの複製多遺伝子プラスミドの結果。 ADE2 遺伝子座を破壊するための1つの統合的な多遺伝子プラスミドが構築され、そのコロニーは赤色である。
CDS をエントリベクトルにクローニングする (pYTK001) ERG20は、記載したようにプラスミドpLM49448から酵母ゲノムと3つのカロテノイド遺伝子からpYTK001の入り口ベクターに増幅した。酵母プロモーター pENO2、pTIP1、pPYK1およびpPDC1およびターミネーター tTDH2、tHSP26、tADH2、tACS2を一部プラスミドとしてクローニングした。リコピンを産生するためにCrtYB(G247...

このプロトコルの目的は、ゴールデンゲートクローニングに基づくモジュラークローニングシステムを使用して、マルチ遺伝子構造を組み立てるための詳細なステップバイステップガイドを提供することです。また、当社の経験に基づいて最適なアセンブリを確保するための重要な手順に関する推奨事項も示します。

The Golden Gate cloning method enables the rapid assembly of multiple genes in any user-defined arrangement. It utilizes type IIS restriction enzymes that ...

これは、酵母MoCloキットを用いて多遺伝子プラスミドを組み立てるための詳細なプロトコルです。この方法により、さまざまな多遺伝子級のクローン作成が可能になります。関連部品の大きなライブラリを生成するのに理想的です。ゴールデンゲート反応ミックスを設定することで始めます。各PCR産物とエントリーベクターのフェムトモレを20個加え、10X T4リガーゼバッファーの1マイクロリットル、Esp3Iの0.5マイクロリットル、およびT4リガーゼの0.5マイクロリットルを加える。二重蒸留水を加え、総体積を10マイクロリットルにします。次に、クローニング反応を実行します。熱ショックにより、反応ミックス全体をDH5アルファ株または同等のエシェリヒア・コリ化学的に有能な細胞に変換します。1ミリリットルクロラムフェニコールあたり35マイクログラムのlbプレートに細胞を広げます。その後、一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。16~18時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、約5時間摂氏4度にして、スーパーフォルダグリーン蛍光タンパク質またはsfGFPがより強い緑色に発達させます。プレートをスクリーニングするには、紫外線または青色光のトランスイルミエータに置きます。コロニーを含むsfGFPは、UV光の下で蛍光を発する。緑色のコロニーは、ノーカット部分プラスミドが含まれているため、負です。白いコロニーは陽性である可能性が高い。クローニングは、30〜100%白色のコロニーがある場合に成功します。中間ベクターを、左コネクタ、sfGFPドロップアウト、右コネクタ、酵母選択マーカー、複製酵母起源、mRFP1、大腸菌起源、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドの一部を組み立てます。テキスト原稿に記載されているとおりにクローニング反応を行います。DH5アルファ株に全体の反応ミックスを変換し、ミリリットルカルベニシリンまたはアンピシリンあたり50マイクログラムでlbプレート上の細胞を広げます。一晩摂氏37度でインキュベートします。16~18時間後、インキュベーターからプレートを取り出します。プレートには淡い赤と淡い緑のコロニーの両方が含まれます。mRFP1とsfGFPを成熟させるために約5時間摂氏4度に保ちます。UV またはブルー ライト のトランスイルミネーターを使用して、正しい中間ベクターを含む緑のコロニーを特定します。lbカルベニシリンプレートに緑色のコロニーを取り出し、一晩で摂氏37度でインキュベートします。翌日、クロラムフェニコールプレートに再びストリークアウトし、一晩で摂氏37度でインキュベートします。クロラムフェニコールプレート上に成長するコロニーには、誤って組み立てられたプラスミドが含まれています。中間ベクターが正常に組み立てられたら、転写ユニットの組み立てに進みます。この4ピースアセンブリには、中間ベクター、プロモーター、CDS、および決定要因が含まれています。プラスミドを精製し、その濃度を記録し、各プラスミドをマイクロリットル当たり20フェムトモレに希釈します。クローニング反応を行った後、クローニング反応ミックス全体をDH5アルファまたは同等の大腸菌のコンピテントセルに変換し、LBNカルベニシリンにプレートします。その後、一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。16~18時間後、プレートをインキュベーターから取り出し、約5時間摂氏4度に保ち、sfGFPを成熟させます。UV または青色光のトランスイルミネーターを使用して、正しい転写ユニットを含む非蛍光白色コロニーを特定します。テキスト原稿に記載されているように、多遺伝子プラスミドの中間ベクターを組み立てる。その後、全体のクローニング反応ミックスをDH5アルファ細胞に変換し、ミリリットルカナマイシンあたり50マイクログラムでlbにそれらをプレートします。一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。赤と緑の色ベースのスクリーニングを実行し、前に示したように誤ったアセンブリをスクリーニングするためにlbカナマイシンプレート上の緑のコロニーをストリークし、成長させます。次に、テキスト原稿に記載されているようにクローニング反応を設定して多遺伝子プラスミドを組み立てる。全体のクローニング反応ミックスをDH5アルファ細胞に変換し、lbカナマイシンにそれらをプレートします。一晩摂氏37度でプレートをインキュベートします。次に、先に説明したとおりにグリーンとホワイトのスクリーニングを行います。このプロトコルは、ADE2遺伝子座を破壊するための1つの統合的な多遺伝子プラスミドを構築するために使用された。4つの複製性および1つの統合的な多遺伝子プラスミドを組み立てた。中間ベクタークローニングに対する潜在的に正しいコロニーの比率は、中間プラスミドをクローニングすると1.83%であったが、中間体からのマルチ遺伝子プラスミドの組み立て成功率は93.77%であった陽性白色コロニーの無視できる数は、多遺伝子プラスミドの最適以下の集合を示す。酵母に変えた後、β-カロテンとリコピンを産生するコロニーは3日目に成長した。各プレートから4つのコロニーを新鮮なプレートにストリークアウトし、さらに2日間成長させた。カロテノイドを抽出し、UV-Vis分光光度法によって定量した。BTS1/ERG20は、ERG20単独の株に比べてβ-カロテンの35倍高い生産につながります。同様に、リコピンの生産は、ERG20単独と比較して、BTS1/ERG20の株で約16.5倍高い。多遺伝子統合プラスミドは、gRNAとヘルパーDNAを持たないか、gRNAとヘルパーDNAとして多遺伝子統合プラスミドのいずれかで、ADE2遺伝子座の破壊のために使用されました。3~4日後、YPDプレートにNourseothricinを用いて赤色コロニーが観察され、ADE2が正常に破壊されたことを示す。この方法を試みている間に覚えておかねばなることが最も重要なことは、この反応ミックスを設定しながらDNA濃度を正確に測定し、ピペットを注意深く測定することです。この技術により、酵母代謝工学の分野の研究者は、製品収量を最大化するために多数の遺伝子およびプロモーターを調査することができます。

rapid-assembly-multi-gene-constructs-using-modular-golden-gate

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Bioengineering

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