Name: サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 学ぶグリセロール勾配遠心法と架橋剤を用いたグラフィックス法で、サッカロミセス・セレビシエのスプライスソームとスプライシング因子の過渡的相互作用を検出する技術。沈殿物を形成せずに緩いタンパク質相互作用を安定化し、分子生物学研究に有用です。

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1. 酵母総抽出物の調製
<ol><li>1 L YNB-glu培地(酵母窒素基底に2%m/vグルコースを補充)のTAPタグ9 に融合したスプライシング因子の1つを発現する酵母細胞を、適切なアミノ酸または核塩基で増殖させ、 この場合、アデニン(20μg/mL)、ロイシン(30μg/mL)、トリプトファン(30μg/mL)、OD600= 1.0まで。</li>
	<li>1L培養から細胞を1L培養から採取し、4°Cで10分間17,000xgの3本の500mL遠心分離器ボトルで遠心し、10mL冷たい滅菌水で2回洗浄します。 </li>
	<li>採取した酵母細胞をコールドバッファーAの細胞体積の1/10に再懸濁させる(10 mmolL-1 HEPES pH = 7.9,1.5 mmolL-1 MgCl2,50mmolL-1 KCl,5%v/vグリセロール,0.5 mmol L-1 DTT,EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル)。</li>
	<li>液体窒素中の細胞懸濁液の小さな滴を凍結します。小さな滴は、再懸濁された細胞溶液をピペット化し、50 μLを液体窒素に直接滴下することによって得ることができる。 注意:液体窒素は皮膚や目と接触して傷害を引き起こす可能性があります。適切な安全装置を使用して取り扱います。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。細胞懸濁液の凍結滴は-80°Cで保存することができる。</li>
	<li>ボールミル装置で20 Hz/sで6サイクル3分間粉砕して、酵母細胞のライセートを調製します。 注:各サイクルの後、凍結した細胞を含む容器を液体窒素に浸して、溶融を避けてください。プロトコルはここで一時停止することができます。凍結した抽出物は、-80°Cで保存することができる。 酵母スプライシング抽出物は、ホモジナイザーを用いて、スフェロプラスト10をリセートしたり、乳鉢および害虫11,12を使用して調製することもできる。</li>
	<li>それを含むチューブを室温で水に入れ、時折揺れ動かして抽出物を溶かします。</li>
	<li>遠心分離機抽出物は4°Cで1時間45,000xgで抽出する。 </li>
	<li>BCA法13によりクリアされた上澄みのタンパク質含有量を定量化する。</li>
	<li>抽出物のアリコートを準備し、液体窒素で速く凍結し、-80°Cで保存します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>2. グリセロール勾配製剤
<ol><li>バッファーAに2つのグリセロール溶液を調製し、1つは10%v/vを含み、もう1つは30%v/vグリセロールを含みます。</li>
	<li>30%v/vグリセロール溶液中に0.1%v/vに架橋剤グルタルアルデヒドを加え、均質化するために混合する。 注意:適切な安全装置を使用して、ヒュームフード内のグルタルアルデヒドを取り扱います。</li>
	<li>12 mL 遠心管の底部に冷10%v/vグリセロール溶液(14 x 89 mm)を加えます。</li>
	<li>10%v/vグリセロール溶液のすぐ下に、チューブの底にグラジマスターデバイスを備えた長い針に付着した注射器を備えたグルタルアルデヒドを添加した冷たい30%v/vグリセロール溶液の6 mLを加えます。 注:または、10%v/vグリセロール溶液は、30%v/vグリセロール/グルタルアルデヒド溶液の上部に慎重にパイプすることができます。</li>
	<li>グラデーションマスターデバイスを使用して、連続した密度勾配を生成します。 注:勾配マスターデバイスでは、チューブは適切なラックに配置され、パラメータ(時間/角度/速度)を決定するためのメーカーの推奨事項に従って、短時間回転されます。この作業では、2:25分/81.5°/11rpmを使用しました。</li>
	<li>細胞抽出物を添加する直前に、7%v/vグリセロール/バッファーAクッションを200 μL慎重に加えます。 注:クッションのグリセロール濃度は、線形勾配を作成するために使用されるあまり濃縮されたグリセロール溶液よりも低くなければなりません。</li>
</ol>3. 遠心分離を抽出する
<ol><li>各12 mLリニアグリセロール勾配10%~30%のグルタルアルデヒドの上部に、合計タンパク質の約2mgをクッション付きでロードします。</li>
	<li>チューブをあらかじめ冷却されたスイングバケットローターに入れ。 メモ:超遠心分離の前に混合を避けるために、チューブを穏やかに処理します。</li>
	<li>遠心分離機 194,000 x g で 16 時間 4 °C.</li>
	<li>アリコート 24 500 μL フラクションで、適合した Econo システムを使用するか、慎重にピペット処理を行います。 注:適合Econoシステムは、蠕動ポンプ、UV検出器、チューブ穿光装置に接続された分数コレクターで構成されています。沈み込みプロファイルは、280 nmでの吸光度の測定によって監視することができます。</li>
	<li>ペリスタリポンプを通して40%v/vグリセロール溶液を使用して、グリセロールをチューブから分画コレクターに10%~30%の勾配で押し込みます。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。分数は使用するまで-80°Cで保管してください。</li>
	<li>ドットブロットまたはスロットブロットデバイス上のニトロセルロース膜に直接各画分の50 μLをロードします。2次抗体としてCBPに対する抗体(1:6,000、TAPタグのCBP部分を検出する)と抗ウサギIgG(1:15,000)を併用してタンパク質を検出した。</li>
</ol>

<ol><li>Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+nuclear+pre-mRNA+splicing+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417(2019).</li>
<li>Yan, C., Wan, R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+pre-mRNA+splicing+through+structural+biology+of+the+spliceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409(2019).</li>
<li>Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+regulation+of+spliceosomal+RNA+helicases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).</li>
<li>Kastner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GraFix%3A+sample+preparation+for+single-particle+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.</a> Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).</li>
<li>Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafix%3A+stabilization+of+fragile+macromolecular+complexes+for+single+particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).</li>
<li>Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+yeast+activated+spliceosome+at+3.5+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution.</a> Science. 353 (6302), 895-904 (2016).</li>
<li>Ohi, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+analysis+revelas+stable+multiprotein+complexes+in+both+fission+and+budding+yeasts+containing+Myb-related+Cdc5p%2FCef1p%2C+novel+pre-mRNA+splicing+factors%2C+and+snRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).</li>
<li>Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+yeast+mutant+RNA+exosome+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes.</a> Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).</li>
<li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterizatioin+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+fractionation+of+yeast+splicing+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and fractionation of yeast splicing extract.</a> Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).</li>
<li>Umen, J. G., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+a+U5+snRNP+protein+in+3%27+splice+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection.</a> Genes & Development. 9, 855-868 (1995).</li>
<li>Dunn, E. A., Rader, S. D. Preparation of yeast whole cell splicing extract. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunn%2C+EA+%22Spliceosomal+Pre-mRNA+Splicing%3A+Methods+and+Protocols.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology</a>. Hertel, K. J. 1126, 123-135 (2014).</li>
<li>Hill, H. D., Straka, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+determination+using+bicinchoninic+acid+in+the+presence+of+sulfhydryl+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Analalytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents.</a> Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).</li>
<li>Cepeda, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+assembly+factor+Nop53+controls+association+of+the+RNA+exosome+with+pre-60S+particles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).</li>
<li>Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mRNA+splicing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Yeast mRNA splicing in vitro.</a> The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).</li>
</ol>

著者は利益相反を持っていません。

タンパク質とリボ核酸-タンパク質相互作用は、架橋剤を使用して安定化することができます。得られた複合体は、グリセロール勾配に対する超遠心化に耐える安定であることが重要である。さらに、バッファー条件では、相互作用を許可する必要がありますが、非特異的なバインドを回避するのに十分な厳格な必要があります。ここに示す実験では、インビトロスプライシング反応15に対して既に確立されている緩衝溶液を用いた。
遠心分離の速度と時間は、解析される複合体に合わせて最適化する必要があります。我々は、同様の結果で、94,000 x g で遠心サンプルと194,000 x g の16 hで異なる沈み込み条件をテストしました。これらのコントロールは、解析対象の複合体が沈殿しない条件を決定するために重要です。
また、ドットブロットがより再現性の高い結果を与えたことを示したスロットブロットまたはドットブロットシステムを使用して、膜上で直接ピペット化する異なるブロット法をテストしま...

スプライシングは、多数の因子の結合と解放を必要とする非常に動的なプロセスです。これらのスプライシング因子は、RNA結合タンパク質、ATPAses、ヘリカーゼ、タンパク質キナーゼおよびホスファターゼ、ユビキチンリガーゼ、とりわけ1、2、3を含む。また、分子の再調整を可能にするために、これらの要因のいくつかは、スプライセソームサブコンプレックスに非常に一時的に結合し、これらのRNP中間複合体の単離および同定を非常に困難にする。
ここでは、Grafix法4,5を使用して、酵母スプライシング因子Cwc24とBアクトコンプレックス6との相互作用を安定させ、そのサブ複合体に付随して結合する他の因子を同定し、ユビキチンリガーゼPrp19がCwc24の結合または放出に何らかの役割を果たしているかどうかを判断しました。場所。グリセロール勾配に沿って架橋剤の濃度を増加させる高分子を暴露する利点は、複合体間架橋4、5、したがって、凝集体の形成を回避することです。
この方法は、タンパク質共免疫沈降およびプルダウンアッセイの補完として使用されたが、これは、大きな複合体の単離を可能にするにもかかわらず、大きな動的複合体7,8内の一過性相互作用を維持するために信頼できない可能性がある。グリセロール勾配における固定化試薬の使用は、このような因子の結合を安定化させ、特定のタンパク質とスプライシングサブコンプレックスとの相互作用を確認することを可能にする。選択した架橋剤は化学的に不可逆的であったため、回収された画分に存在するタンパク質を、勾配遠心分離後のドットブロットで分析した。

<table><tbody><tr><td>抗カルモジュリン結合蛋白質エピトープ</td><td>Millipore</td><td>07-482</td><td></td></tr><tr><td>ECLの反ウサギIgG</td><td>GEのヘルスケア</td><td>NA934</td><td></td></tr><tr><td>EconoSystem</td><td>Bio-Rad</td><td>1-800-424-6723</td><td>使用されるEconoSystemの部品:蠕動ポンプ、紫外線探知器およびフラクションコレクターEDTA</td></tr><tr><td>フリーのプロテアーゼの抑制剤のカクテル</td><td>Roche</td>の<td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>フラクション回収システム</td><td>ベックマン・コールター</td><td>270-331580</td><td>EconoSystem</td></tr><tr><td>Gradient Master Model 107ip</td><td>Biocomp</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>ミキサーミル MM 200</td><td>Retsch</td><td>207460001</td><td>ボールミル装置</td></tr><tr><td>ローター F12-6x500Lex</td><td>Thermo Scientific</td><td>096-062375</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>36-101-0816</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケットローター P40ST</td><td>日立</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機 CP 80 NX 日</td><td>立</td><td>901069</td><td></td></tr><tr><td>超透明遠心チューブ (14 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr></tbody></table>

サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

プレmRNAスプライシングは、組立、RNA処理、および複合成分の放出中に、多くの分子再構成を伴う非常に動的なプロセスです。グリセリン勾配遠心分離は、機能および構造研究のためのタンパク質またはRNP(RiboNucleoProtein)複合体の分離のために使用されています。ここでは、単一粒子の凍結電子顕微鏡用の高分子複合体を精製・安定化するために最初に開発されたGrafix(勾配固定)の利用について述べ、一過性のスプライセソー複合体と結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。この方法は、複合体を安定化させる固定化試薬の濃度の増加にサンプルの遠心分離に基づいています。グリセロール勾配にロードされた酵母総抽出物の遠心分離後、回収された分率は、個々のスプライシング因子の存在の決定およびスプライセソームサブ複合体の同定のためにドットブロットによって分析される。

Cwc24-TAPの沈殿プロファイルを解析し、グラフィックス法がスプライシングサブコンプレックスへの結合を安定化するのに有効であったかどうかを判断するために、Cwc24-TAPを発現する細胞の全酵母抽出物を、クロスリンク剤としてのグルタルアルデヒドの存在下または存在下にグリセロール勾配に遠心分離して分離した。24個の500 μL画分のサンプルを、次に、TAPタグのCBP部分に対する抗体を用いてスロットブロットで分析した。結果は、架橋器の不在時に、Cwc24が分数5と13(図1B)の間に集中し、約80〜200MDa14の複合体に対応することを示す。しかし、架橋器の存在下では、グラデーション上のCwc24の位置は、より大きな複合体に対応するグラデーションの下部の分数にシフトされる(図1)。これらの結果は、グルタルアルデヒドがCwc24とスプライシング複合体との関連を安定化させることを示す。
Cwc24を保持する複合体が、...

ここでは、架橋器の存在下でのグリセロール勾配遠心分離であるグラフィックス(勾配固定)の利用について、一過性にスプライセソーム複合体に結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

架橋剤の存在下でグリセロール勾配遠心分離を行うグラジエント固定法は、マルチサブユニット複合体に一過性に結合するタンパク質間の相互作用を同定するのに役立ちます。グリセロールグラジエントでの固定試薬の使用は、沈殿物の形成なしに緩い因子の結合を安定させ、特定のタンパク質とスプライシングされた半複合体との相互作用の同定を可能にします。エンドプロトコルのデモンストレーションは、初めてのユーザーが、書かれたテキストだけでは理解しにくい情報を学ぶのに役立ちます。酵母全抽出物の調製では、タップタグに融合したスプライシング因子の1つを発現する酵母細胞と、適切なアミノ酸または核酸塩基を補充した1リットルのYおよびBグルコース培地を増殖させます。培養物が1ナノメートルの光学密度に達したら、酵母細胞を500ミリリットルの遠心分離ボトル3本に遠心分離して収集し、1回の洗浄で10ミリリットルの冷滅菌水で細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞をコールドバッファーAの細胞体積の10分の1に再懸濁し、酵母細胞懸濁液の50マイクロリットル滴を液体窒素で凍結します。凍結後、凍結細胞ペレットをボールミル装置で20ヘルツで6サイクル、3分間粉砕し、各サイクルの終わりに凍結細胞の容器を液体窒素に浸します。最後のサイクルの後、抽出物を含むチューブを室温の水に入れ、時々振とうします。溶けたら、遠心分離機で抽出物を収集します。そして、上清が除去されたタンパク質をBCA法で定量します。次に、抽出物のアリコートを液体窒素で急速冷凍し、摂氏マイナス80度で保存します。グリセロールグラジエントを調製するには、架橋剤グルタルアルデヒドの最終濃度0.1%を30%グリセロールおよび緩衝液A溶液に加え、混合して均質化します。12ミリリットルの遠心分離管に6ミリリットルの冷たい10%グリセロールと緩衝液A溶液を加え、長い針を備えたグラジエントマスターデバイスシリンジを使用して、チューブの底に30%グリセロールグルタルアルデヒド溶液を重ねます。グラジエントマスターデバイスを使用して、メーカーの仕様に従って線形グリセロールグラジエントを作成します。200マイクロリットルの7%グリセロールと緩衝剤Aクッションをグラジエントの上部に慎重に重ねてから、チューブの上部に約2ミリグラムの細胞抽出物を追加します。グリセロールグラジエント生成後、サンプルを事前に冷却したスイングバケットローターに入れ、遠心分離により抽出物を回収します。各12ミリリットルのサンプルチューブからサンプルを24 500マイクロリットルのフラクションで分注し、ペリスタルティックポンプを使用して40%グリセロール溶液をチューブからフラクションコレクションまで10〜30%の勾配で押し込みます。次に、各画分50マイクロリットルをドットブロット上のニトロセルロースメンブレ

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