サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用
2020年11月9日
ここでは、架橋器の存在下でのグリセロール勾配遠心分離であるグラフィックス(勾配固定)の利用について、一過性にスプライセソーム複合体に結合するスプライシング因子間の相互作用を同定する。
架橋剤の存在下でグリセロール勾配遠心分離を行うグラジエント固定法は、マルチサブユニット複合体に一過性に結合するタンパク質間の相互作用を同定するのに役立ちます。グリセロールグラジエントでの固定試薬の使用は、沈殿物の形成なしに緩い因子の結合を安定させ、特定のタンパク質とスプライシングされた半複合体との相互作用の同定を可能にします。エンドプロトコルのデモンストレーションは、初めてのユーザーが、書かれたテキストだけでは理解しにくい情報を学ぶのに役立ちます。
酵母全抽出物の調製では、タップタグに融合したスプライシング因子の1つを発現する酵母細胞と、適切なアミノ酸または核酸塩基を補充した1リットルのYおよびBグルコース培地を増殖させます。培養物が1ナノメートルの光学密度に達したら、酵母細胞を500ミリリットルの遠心分離ボトル3本に遠心分離して収集し、1回の洗浄で10ミリリットルの冷滅菌水で細胞を2回洗浄します。2回目の洗浄後、細胞をコールドバッファーAの細胞体積の10分の1に再懸濁し、酵母細胞懸濁液の50マイクロリットル滴を液体窒素で凍結します。
凍結後、凍結細胞ペレットをボールミル装置で20ヘルツで6サイクル、3分間粉砕し、各サイクルの終わりに凍結細胞の容器を液体窒素に浸します。最後のサイクルの後、抽出物を含むチューブを室温の水に入れ、時々振とうします。溶けたら、遠心分離機で抽出物を収集します。
そして、上清が除去されたタンパク質をBCA法で定量します。次に、抽出物のアリコートを液体窒素で急速冷凍し、摂氏マイナス80度で保存します。グリセロールグラジエントを調製するには、架橋剤グルタルアルデヒドの最終濃度0.1%を30%グリセロールおよび緩衝液A溶液に加え、混合して均質化します。
12ミリリットルの遠心分離管に6ミリリットルの冷たい10%グリセロールと緩衝液A溶液を加え、長い針を備えたグラジエントマスターデバイスシリンジを使用して、チューブの底に30%グリセロールグルタルアルデヒド溶液を重ねます。グラジエントマスターデバイスを使用して、メーカーの仕様に従って線形グリセロールグラジエントを作成します。200マイクロリットルの7%グリセロールと緩衝剤Aクッションをグラジエントの上部に慎重に重ねてから、チューブの上部に約2ミリグラムの細胞抽出物を追加します。
グリセロールグラジエント生成後、サンプルを事前に冷却したスイングバケットローターに入れ、遠心分離により抽出物を回収します。各12ミリリットルのサンプルチューブからサンプルを24 500マイクロリットルのフラクションで分注し、ペリスタルティックポンプを使用して40%グリセロール溶液をチューブからフラクションコレクションまで10〜30%の勾配で押し込みます。次に、各画分50マイクロリットルをドットブロット上のニトロセルロースメンブレンに直接ロードし、続いてブロッキングバッファーを添加し、免疫ブロット上のタンパク質を検出するためにCBPに対する一次抗体を使用し、必要に応じて適切な二次抗体を使用します。
架橋剤がない場合、CWC 24はフラクション5と13の間に集中し、約80〜200メガダルトンの錯体に対応します。しかし、架橋剤の存在下では、グラジエント上のCWC 24の位置は、より大きな錯体に対応するグラジエントの下部のフラクションにシフトします。CWC 24の沈降をU5 snRNPサブユニットであるPrp8およびNTCサブユニットの沈降と比較すると、Prp19はCWC 24が同じ画分に集中していることを明らかにします。
しかし、それはスプライソソームと一過性に会合するため、軽い画分にも存在します。興味深いことに、フラクション11とフラクション12は、Prp8と19が集中し始めるフラクションであり、これがBアクト複合体が沈降し始める勾配の部分であることを示唆しています。フラクション11および12のウェスタンブロット分析により、Prp8および19のシグナルは、8%アクリルアミドゲルにほとんど入らない塗抹標本であることが明らかになり、それらが実際に大きな複合体の一部であることが示されています。
CWC 24はフラクション12にも存在しますが、はるかに低い濃度であり、B法複合体への一過性の結合と一致しています。まとめると、これらの結果は、グルタルアルデヒドが一過性因子のスプライシングサブ複合体への結合を安定化するための架橋剤として使用できることを示しています。この方法は、スプライソソームなどの一部の成分と一過性に会合する任意の動的モーターサブユニット複合体の研究に適用できます。
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概要
この記事では、グリセロール勾配遠心分離と架橋剤を用いた勾配固定法について説明し、スプライシング因子とスプライソソーム複合体間の一過性相互作用を同定する手法を紹介します。この方法は、沈殿物を形成することなく、不安定なタンパク質相互作用を安定化させ、特定のタンパク質相互作用の研究を容易にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 分子生物学
背景
- 勾配固定はタンパク質相互作用を研究するための技術です。
- 多サブユニット複合体内の一過性相互作用の同定に役立ちます。
- 架橋剤の使用によりこれらの相互作用の安定性が向上します。
- この方法は特にスプライシング因子を研究するのに有用です。
研究の目的
- タンパク質相互作用を同定するための勾配固定法を紹介すること。
- 初めての利用者が技術を理解するのに役立つプロトコルを提供すること。
- 酵母におけるスプライシング因子の研究を促進すること。
使用された方法
- 架橋剤を用いたグリセロール勾配遠心分離。
- スプライシング因子を発現する酵母全抽出物の調製。
- 酵母細胞の収集と洗浄。
- さらなる分析のために細胞懸濁液の凍結。
主な結果
- この方法は、一過性タンパク質相互作用を成功裏に安定化させます。
- スプライシング因子とスプライソソームの間の特定の相互作用が同定されました。
- このプロトコルは技術を初めて使用する研究者にとってアクセスしやすいものです。
- 最終プロトコルのデモンストレーションは実践的な理解を助けます。
結論
- 勾配固定は一過性タンパク質相互作用を研究するための効果的な方法です。
- この技術はスプライシングメカニズムの理解を深めるのに役立ちます。
- 分子生物学の研究者にとって価値あるツールを提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Identifying transient protein interactions is critical for target validation in dynamic complexes like the spliceosome, where weak or short-lived associations can be missed by conventional methods. The Grafix (Gradient Fixation) method stabilizes these interactions using glycerol gradient centrifugation with a cross-linker, enabling detection without precipitate formation. This approach supports mechanistic de-risking by clarifying binding partners in disease-relevant systems, improving predictive confidence in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transient splicing factor interactions that may represent therapeutic targets in RNA-processing pathways.
- Operational Value: Stabilizes weak binders for detection, reducing false negatives in target validation assays.
- Scientific Value: Supports pathway clarification by mapping co-sedimentation of factors like CWC 24 with U5 snRNP and NTC subunits.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares fractionated complexes for downstream analysis via dot blot, enabling quantitative assessment of splicing factor presence.
- Operational Value: Generates reproducible sedimentation profiles that can be standardized across runs for assay consistency.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness by isolating subcomplexes in defined gradient fractions for targeted probing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant insight into spliceosome dynamics, which are implicated in cancers and neurodegenerative disorders.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by stabilizing transient interactions for functional follow-up.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing stable versus transient associations in macromolecular machines.
Pipeline & Workflow Integration
The Grafix method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing of transient interactions before progressing to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about transient splicing factor binding by stabilizing interactions for detection in gradient fractions.
- Screening: Produces assay-ready fractions with standardized glycerol gradients, enabling reproducible compound or factor screening.
- Analytics: Delivers quantitative sedimentation data and co-localization outputs (e.g., CWC 24 with Prp8/Prp19) to compare conditions and assess binding shifts.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying factors whose transient binding may be modulated in disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying any dynamic sub-unit complex with transient components, not limited to spliceosome.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by revealing transient interactors otherwise lost in standard lysates.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized gradient generation and fractionation, reducing variability across labs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying mechanistic ambiguity in multi-subunit target complexes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated interaction networks in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast cell lysis, gradient preparation, and fractionation techniques.
- Depends on access to gradient master devices, swing bucket rotors, and fractionation equipment.
- Necessitates standardization of cross-linker concentration (e.g., glutaraldehyde) to avoid over-stabilization or precipitation.
- Involves adaptation considerations when applying to non-yeast systems or alternative complexes.
- Includes practical limitations such as potential epitope masking by cross-linking, requiring validation of antibody accessibility post-fixation.
