Name: 発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぼう、段階的細胞播種法を用いた3D血管ネットワーク構築技術。テッセレーション足場で内皮細胞と支持細胞を配置し、制御された環境で血管形成を観察・追跡する方法を解説。血管疾患モデル作成や治療法探索への応用可能性も示す。

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この研究は、ミシガン大学- イスラエル研究パートナーシップからの資金によって支えられました。著者らは、ウリ・メルドラー、リオール・デビ、ガリア・ベン・デイビッドの大きな支援と支援、ミシガン大学ルーリー・ナノファブリケーション・ファシリティのナディーン・ワン博士とピラール・エレーラ・フィエロ博士、ルイス・ソロリオ博士のフォトリソグラフィー技術の議論に感謝したいと考えています。

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<li>Hasan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+techniques+for+development+of+3D+vascularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue.</a> Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).</li>
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<li>Gauvin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+complex+porous+tissue+engineering+scaffolds+using+3D+projection+stereolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography.</a> Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).</li>
<li>Coscoy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtopographies+control+the+development+of+basal+protrusions+in+epithelial+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets.</a> Biointerphases. 13 (4), 041003(2018).</li>
<li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+fabrication+of+soft+and+oriented+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , (2020).</li>
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<li>Zheng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-on-a-Chip+Systems%3A+Microengineering+to+Biomimic+Living+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems.</a> Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).</li>
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<li>van Duinen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+3D+angiogenic+sprouting+in+a+high-throughput+in+vitro+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform.</a> Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).</li>
<li>Nguyen, D. -H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+model+to+reconstitute+angiogenic+sprouting+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).</li>
<li>Nashimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+perfusable+vascular+networks+with+a+three-dimensional+tissue+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device.</a> Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).</li>
<li>Rosenfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+3D+vascular+networks+is+regulated+by+tensile+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).</li>
<li>Neto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+TAZ+regulate+adherens+junction+dynamics+and+endothelial+cell+distribution+during+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development.</a> bioRxiv. , 174185(2017).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

設計された組織に埋め込まれた中で豊かな血管系の必要性は、構築の生存と適切な機能1のために重要です。血管系のエンジニアリングは膨大な研究の焦点となってきましたが、24を調査して理解するために多くが残されています。特に、特定の組織を再作成する場合、マイクロバスキュアチュアは12に応じて動作し、整理する必要があります。マイクロ血管の生成のための最も一般的なアプローチは、細胞の付着、増殖、および血管形成に適合する適切な3D環境内での内皮および支持細胞の共播であり、血管形成25。この方法論は、多くの場合、非常に組織化されていないネットワークをもたらし、微小血管挙動22を研究することが困難になる。ここでは、提示されたプロトコルは、高度に組織化された血管ネットワークをハイスループットシステムで生成する新しいツールを提供し、時間を通じて容易に追跡および監視できる血管を有し、その発達および挙動を研究する...

組織工学の分野は、欠損または損傷した器官および組織を置き換えるために設計された構造の製造に向けて急速に進んでいる1.しかし、組織の栄養のための運用血管ネットワークを生成することは依然として顕著な課題であるため、完全に機能する構造はまだ達成されていません。適切な血管化がなければ、工学的組織は酸素および栄養素の受動的拡散輸送に限定され、最大生存可能な組織厚さを拡散限界まで拘束し、約200μm2。このような厚みは、大きな組織欠損を修復したり、機能的および埋め込み型組織に必須の特性を機能的な血管ネットワークの存在をレンダリングする全臓器製造のためには適していない。
血管系は、多種多様な血管から構成され、サイズ、型、組織が異なり、宿主組織と密接に関連している。開発船と発芽船によって行われた行動、応答および移行の決定を理解することは、設計された組織4におけるそれらの統合を指示することができる。現在、インビトロ血管ネットワークを作成するための最も一般的なアプローチは、3次元のマイクロ環境内に播種された内皮細胞(EC)と支持細胞(SC、壁画細胞に分化する能力)を組み合わせることです。この環境は、細胞が血管ネットワーク2、5、6、7、8に接続し、増殖し、自己組み立てできるように、化学的および物理的な手がかりを提供します。共同培養すると、SCは細胞外マトリックス(ECM)タンパク質を分泌すると同時に、管状構造を形成するECsに機械的なサポートを提供します。さらに、両細胞型間の交差相互作用は、管切垂、血管発芽および遊走を促進し、SCの成熟およびα平滑筋アクチン発現(αSMA)壁画細胞への分化に加えて4。血管ネットワークの開発は、ヒドロゲル、多孔質ポリマー足場、またはその組み合わせを使用して作成された3D環境で最も一般的に研究されています。後者のオプションは、セルに優しい環境と、セルと ECM9の両方に必要な機械的サポートを提供します。
ヒドロゲル10上の細胞を共培養する、ヒドロゲルス足場の組み合わせ11、12、2Dプラットフォーム、およびマイクロ流体デバイス13を含む血管発達を研究するために多量の作業が行われている。しかし、ヒドロゲルは細胞力14によって容易に変形することができるが、2Dおよびマイクロ流体システムは、より近い自然環境を再現できず、より外界的な応答15、16を得る。形成容器が周囲の環境にどのように反応するかを理解することは、予測可能な方法で血管の開発を導く能力を備えたエンジニアリングされた環境の製造を可能にする重要な洞察を提供することができます。血管形成現象を理解することは、ステレオリソグラフィ、デジタル投影リソグラフィ、連続液体界面生産、3Dメルトエレクトロジェットライティング、ソリューションベースの3Dエレクトロジェット書き、および新しいバイオプリンティング技術17、18、19、20、21などのサブミクロンからミクロンへのスケール製造技術の急速な出現に追いつくために特に重要である。これらのマイクロマニュファクチャリング技術の制御を血管生物学の深い理解と整合させることは、標的組織に対する適切な工学的血管構造の作成の鍵となる。
ここでは、周囲の足場幾何学に対する新しい形成および発芽容器の応答を研究し、その芽発生とその後の移行22を観察する3Dシステムを提示する。テッセレーションコンパートメントの形状を持つ3Dスキャフォールドと2段階のシード技術を駆使し、明確で簡単に解析できる血管ネットワークを作り出すことに成功しました。テッセレーションされたジオメトリは、ローカル環境に応答する容器を含む個々のユニットで高スループットシステムを提供します。多色の IC を使用して、スプラウトの形成の原点とその後の移行パターンを追跡し、コンパートメント ジオメトリと SC 位置22と相関しました。
提案されたプロトコルは、幾何学的手がかりが血管化行動に及ぼす影響を分析するために準備されているが、このアプローチは拡大され、様々な新しいアプリケーションに適用することができる。テッセレーションされた足場と容易にイメージ可能なネットワークは、異なるICおよびSC相互作用の簡単な分析、特定の器官細胞の追加および血管ネットワークとの相互作用、血管ネットワークへの薬物効果などを可能にする。私たちの提案されたシステムの結果は非常に多目的で、簡単な製造および処理の。

<table><tbody><tr><td>Angiotool フリーウェア</td><td>NIH-CCR</td><td></td><td>https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home 牛</td></tr><tr><td>アルブミン血清 Probumin</td><td>Millipore</td><td>82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>歯髄幹細胞</td><td>ロンザ</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>ECM 培地 + 弾丸キット</td><td>Sciencell</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 96%</td><td>Gadot-Group</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>エビセルフィブリンシーラント</td><td>ジョンソン&ジョンソン</td><td>EVB05IL</td><td>トロンビンとフィブリノーゲン(BAC2)の両方のソリューションを提供</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス Cy3抗体</td><td>Jackson</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ Alexa-Fluor 488</td><td>Thermo- Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>ヒト脂肪微小血管細胞</td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>ヒトフィブロネクチン</td><td>Σ</td><td>F0895-5MG</td><td>原液濃度:1mg/mL</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html で無料ダウンロード</td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>Gadot-Group</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>リフトオフ試薬</td><td>蒼薬アドバンスドマテリアルズ</td><td>G112850</td><td>商品名 オムニコート</td></tr><tr><td>低グルコース DMEM</td><td>バイオロジカルインダストリーズ</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗SMA抗体</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド溶液 4% PBS</td><td>ChemCruz</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン-ナイスタチン溶液</td><td>バイオロジカルインダストリーズ</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>ホスペイト緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗vWF抗体</td><td>アブカム</td><td>ab9378</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>シリコンバレーマイクロエレクトロニクス(SVM)</td><td></td><td>ウェーハ 4インチ、タイプ N-1-10、厚さ500-550ミクロン</td></tr><tr><td>SU-8 2050 フォトレジスト</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>Y11058</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>Kayaku Advanced Materials, Inc</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Tryton-X 100</td><td>BioLab LTD</td><td>57836</td><td></td></tr></tbody></table>

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

心血管系は、人間の生理学の重要なプレーヤーであり、体内のほとんどの組織に栄養を提供します。血管は、各特定の浸透組織に応じて異なるサイズ、構造、フェノタイプ、および性能で存在する。損傷または欠けている身体組織の修復または置き換えを目的とする組織工学の分野は、制御された血管新生に依存して、設計された組織内で適切な血管導入を生み出す。血管系がなければ、厚い工学的な構造は十分に栄養を与えられず、細胞死、生着不良、そして最終的には失敗を引き起こし得る。このように、操作された血管の挙動を理解し、制御することは、この分野における顕著な課題です。この研究は、3D足場環境における船舶行動を研究するための組織的かつ繰り返し可能な船舶ネットワークの作成を可能にするハイスループットシステムを提示する。この2段階のシーディングプロトコルは、システム内の血管が足場地形に反応し、血管が存在する区画形状に応じて独特の発芽動作を示すことを示しています。この高スループットシステムから得られた結果と理解は、より良い3Dバイオプリント足場構築設計を知らせるために適用することができ、細胞化された生物学的環境の基礎として3Dプリンティングを使用する場合、様々な3Dジオメトリの製造を迅速に評価することはできません。さらに、この高スループットシステムからの理解は、迅速な薬物スクリーニングの改善、共培養モデルの急速な開発、血管形成に関する機械的刺激の検討を行い、血管系の知識を深めるために利用することができる。

提示されたプロトコルは、ステレオリソグラフィー技術を使用して、SU-8フォトレジストで作られたテッセレーション足場の製作を可能にする。異なるコンパートメントジオメトリ(正方形、六角形、円)を持つ足場と、精度の高い再現性の高い特徴が得られました(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61995/61995fig01.jpg"> 図1:テッセレーションされた四角形、円形、六角足場の形状(スケールバー=500μm)の代表的な走査型電子顕微鏡画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61995/61995fig01large.jpg" target="_bl...

設計された組織は、重要な栄養素やガスを提供し、代謝廃棄物を除去するために適切な血管ネットワークに大きく依存しています。この研究では、内皮細胞と支持細胞の段階的な播種プロトコルにより、制御された3D環境における血管挙動の開発を研究するための高スループットプラットフォームで、高度に組織化された血管ネットワークを作成する。

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...

私たちのプロトコルは、研究者が明確かつ簡単に追跡可能な方法で血管ネットワーク形成プロセスを研究することを可能にし、新しい研究への扉を開き、血管の行動に光を当てることができます。この技術は、周囲の環境に応答して、高度に組織化され、反復可能な血管ネットワークを作成する可能性を提示します。血管疾患を患う患者由来の内皮細胞をこのシステムを用いて回収することができ、血管疾患を再現し、適切な治療法を見つけることを可能にする。提案された方法は、異なる細胞タイプと組み合わせたときに血管ネットワークの挙動を研究するために拡張することができ、特定の組織タイプとの発達血管の相互作用を観察することを可能にする。スキャフォールドを最低15分間70%エタノールに浸し、PBSで2回洗います。フィブロネクチンストック溶液1.5マイクロリットルを、スキャフォールドあたり28.5マイクロリットルのPBSと混合して播種する。ピペットのエラーを避けるために、すべての足場に使用される1フィブロネクチン希釈液を準備します。疎水性表面の上にスキャフォールドをまばらに置き、フィブロネクチン希釈液の30マイクロリットルで各足場を覆います。プレートの蓋を交換し、フィブロネクチンで覆われた足場を摂氏37度、湿度100%に設定したインキュベーターに1時間以上入れます。インキュベーション後、PBSでスキャフォールドを軽くすすいでフィブロネクチン残骸を除去する。足場は、最大1週間、摂氏4度でPBSに保管することができます。製造者が示す抗生物質溶液、FBS、および内皮細胞増殖サプリメントを含む、対応する培地キット成分と基底培地を混合して、内皮細胞またはEC培地を調製する。ヒト脂肪微小血管内皮細胞懸濁液を、1ミリリットル当たり400万個の細胞濃度でEC培地に含めます。鉗子を使用して、非TC 24ウェルプレートにウェルあたり1フィブロネクチンコーティング足場を1つ置きます。各足場を細胞懸濁液の25マイクロリットルの液滴で覆い、サスペンションが足場から流れ落ちないようにします。蓋をプレートに置き、60〜90分間、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度100%のインキュベーターに入れます。インキュベーション後、各々に700マイクロリットルのEC培地を充填します。蛍光顕微鏡を用いて、または3日間、EC合流を観察できるまで、内皮化足場をインキュベートする。1 日おきにメディアを変更します。低グルコースDMEMの500ミリリットル、FBSの57.5ミリリットル、非必須アミノ酸の5.75ミリリットル、グルタマックス5.75ミリリットル、ペニシリンストレプマイシン-ナイスタチン溶液5.75ミリリットルを混合することによってDPSC培地を調製する。内皮化された足場を新しい非TC 24ウェルプレートに移します。現在のプレートからすべての媒体を、ピ

stepwise-cell-seeding-on-tessellated-scaffolds-to-study-sprouting

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

プロトコルでは、回転楕円体の perfusable...

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

この方法は、標準化されたマイクロ流体プラットフォームにおける40の浸透した3Dマイクロ容器としてiPSC由来内皮細胞の培養を記述する。このプラットフォームは、アナストモシスや、スケーラブルで高スループットな方法での血管新芽の安定化を含む、3Dでの勾配駆動血管新生芽芽の研究を可能にします。...

iPSC由来内皮細胞の浸透した3D血管新生発芽をインビトロで研究するための標準化およびスケーラブルなアッセイ

細胞外マトリックスリガンドは、ポリアクリルアミドヒドロゲル上にパターン化することができ、準拠基板上の閉じ込められたコロニーにおけるヒト胚性幹細胞の培養を可能にする。この方法は、トラクション力顕微鏡と生化学アッセイと組み合わせて、組織形状、細胞発生力、および運命指定の相互作用を調べることができます。...

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

ここでは、マイクロ流体チップと、新生血管形成の初期微小環境を再現する、自動制御された高効率循環マイクロ流体システムを提供し、高い発光せん断応力、経経皮流の生理学的レベル、および様々な血管内皮成長因子(VEGF)分布によって内皮細胞(ECs)を同時に刺激することを可能にする。...

新血管新生初期事象を模倣する微発性モデル

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in...

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

この論文では、神経芽腫細胞株を以前に説明した3次元コラーゲンベースの足場に播種し、所定の時間枠で細胞増殖を維持し、さまざまな実験目的を満たすために適応可能な、いくつかの細胞増殖および細胞挙動分析およびダウンストリームアプリケーション用の足場を回収するために必要な手順をリストしています。...

コラーゲンベースの足場を用いた神経芽細胞腫の3次元 in vitro 生体模倣モデル

このプロトコルは、ヒト多能性および人工多能性幹細胞からの自己組織化血管の生成を記載する。これらの血管ネットワークは、周皮細胞、平滑筋アクチン、および連続した基底膜に囲まれた広範で接続された内皮ネットワークを示します。...

多能性幹細胞からのヒト血管オルガノイドの作製

この研究では、2次元(2D)スクラッチ創傷移動アッセイと3次元(3D)スフェロイドスプラウティングアッセイ、およびRNA抽出や免疫細胞化学などのそれぞれのダウンストリーム分析方法が、 in...

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

発芽血管新生は、発生と疾患の基本であり、複雑な分子的および機械的プロセスに関与しています。ブタの頸動脈からの細胞芽を解析し、硬さ依存性の血管新生と明確なリーダーフォロワー細胞力学を明らかにする、汎用性の高い2.5D ex vivo...

生体組織における発芽血管新生の ex vivo 機械的特性評価のための2.5Dモデル

自己細胞とテスト生体適合性とチタンの血液接触生体材料をシードする方法について説明する。このメソッドは、ブタ静脈cavaeに外科的に移植後数分以内に接種した内皮前駆細胞およびチタンチューブを、使用しています。この手法は、他の多くの埋め込み型医用機器に適応可能です。...

大動物モデルにおける心血管デバイス用自家血管内皮前駆細胞播種技術と生体適合性試験

学ぼう、段階的細胞播種法を用いた3D血管ネットワーク構築技術。テッセレーション足場で内皮細胞と支持細胞を配置し、制御された環境で血管形成を観察・追跡する方法を解説。血管疾患モデル作成や治療法探索への応用可能性も示す。

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

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