Name: 鶏胚のレチナから、ロッドからコーン細胞相互作用を研究するコーンエンリッチ培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ鶏胚レチナ由来コーン光受容体培養法。網膜変性治療薬スクリーニングのため、コーン細胞生存因子を同定する手法を確立。神経科学と細胞培養の重要モデルとして応用可能。

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著者らは、ジャック・ベラロウ、ローレライ・フルニエ、エマニュエル・クレラン、フレデリック・ブロンド、そして彼らの貴重な助けに対する責任あるア・レスポンサビリテ・リミテ(EARL Morizeauの危険性、フランス)に感謝する。この研究は、インサーム、ソルボンヌ大学、アジェンス・ナショナル・プール・ラ・レシェルシュ(ANR、Labex Lifesenses)、財団ファイティング・ブラインドネス(米国)、IHU FOReSIGHT[ANR-18-IAHU-0001]によって支えられました。

この議定書は、ピエール大学とマリー・キュリー大学の動物実験倫理委員会とフランス研究省(許可番号:APAFIS#1028 2015070211275177)によって承認されました。動物実験は次の認可の下で行われました: "セルティフィカト・ド・オートリゼーション・ド・デ・エクスペリメンター・シュル・レ・アニモー・ヴェルテブレA-75-1863。パリ警察のプレフェクチャー(2011年11月9日~2016年11月8日)」。
1. 受精卵のインキュベーション
<ol><li>産業孵化場で、自然に得られる毎週の受精卵(株I 657、赤いラベル)を収集します。</li>
	<li>受精卵は鶏によって「産まれた」後、実験室で17°C(生物学的ゼロ)で維持します。</li>
	<li>各培養物に対して、7個の受精卵を20°Cで24時間、37°Cで136時間培養し、加湿室で卵の傾斜(片側から反対側へ2時間の進行動、4時間周期)を間欠的に反転させます。</li>
</ol>2. 鶏胚の回収
<ol><li>7個の卵の表面を消毒剤で洗います(例えば、Pursept A急行)。</li>
	<li>卵殻を壊すために、大きなまっすぐなペンチでシェルの上部に穴を開けます。その後、殻を切って卵から帽子を柔らかいゆで卵として取り除きます。</li>
	<li>卵殻から各胚を緩やかに引き出し、37°Cに加熱した無菌リン酸緩衝液生理塩水(PBS)を含むペトリ皿に移す。 胚(絨毛膜または絨毛管膜)を取り囲むエンベロープをそっと取り除きます。</li>
	<li>ハンブルガーとハミルトン42と視覚的に比較して、各胚の発達段階を検証する。</li>
	<li>開発の第29段階 で2つの胚を選択します(図1)。翼は肘で曲がる。襟が目に見えて目立ちます。法案は28番目 の段階よりも顕著です。</li>
	<li>これらの選択した胚の目を核とし、CO2-独立培地(生命技術)でそれらを移す。 注意: 胚がステージ 29 にあり、ステージ 28 または 30 (図1)にないことを非常に重要です。2個しか使わなくても、少なくとも7個の卵をインキュベートする必要があるのはそのためです。絨毛は非常に薄く、区別するのが難しいが、胚と非常に近いので、胚に触れることなく取り除かねばなっている。</li>
</ol>3. レティナの解剖
<ol><li>切断し、湾曲した鉗子で選択した胚を核とします。</li>
	<li>4つの目をCO2-独立培地に移します。この媒体は0.9 mM CaCl2 および0.65 mM MgCl2を含んでいる。</li>
	<li>角膜を下にして眼を下に、実験者に向かって視神経を置く。2つのストレート鉗子を使用して視神経に穴を開けます。</li>
	<li>網膜と色素上皮の間に各鉗子の分岐を挿入する(図2)。各鉗子を引っ張り、眼を回転させて網膜から上皮を取り外します。角膜を取り除き、レンズとガラス膜を取り除きます。</li>
	<li>pH 7.2でリンガーの媒体を含むペトリ皿に4つのレチナを移します。 注意:網膜だけが残っていることを確認し、色素性および残存網膜色素上皮の痕跡を取り除く。</li>
</ol>4. 細胞の細胞懸濁液の準備
<ol><li>2つのまっすぐなペンチを使用して非常に小さな部分に4つのレチナをカットします。</li>
	<li>リンガーの媒体で2回、レチンの部分を洗います。</li>
	<li>リンガーの媒体で2回目の洗浄を行った後、レティナの破片をチューブの底に落とし、リンガーの媒体を取り除きます。トリプシン(0.25%w/v)の溶液で37°Cで20分間、レチナルピースを処理します。</li>
	<li>連続吸引により10分後に溶液を分散させる。パスツールピペットを使用して排出し、レチナルピースの解離を確認します。10%不活性化胎児子牛血清を添加した培養培地を添加して反応を停止する。</li>
	<li>DNase Iの0.05mgで細胞懸濁液をインキュベートし、DNaseを添加した直後にパスツールピペットを使用して連続吸引および排出することによって細胞クラスターとDNAを解震させる。</li>
	<li>レチナル細胞懸濁液を化学的定義培養培地(CDCM)で2回洗浄する:100 μg/mLリノール酸/BSAを添加したダルベッコの修飾イーグル培地およびM199培地の等量 0.86 μMインスリン、0.07 μMトランスフェリン、2.0 μMプロゲステロン、0.28 μMプロスタグランジン、0.29 μM Na2SeO 3、182 μM プトレシン、3 mMタウリン、 4.7 μMシチジン5′ジホスホコリン、2.7 μMシチジン5'ジホスホエタノールアミン、0.55 μMヒドロコルチゾン、0.03 μMトリヨードチロニン、1 mMナトリウムピルビン酸、20μMゲンタマイシン。</li>
</ol>5. レティナル細胞の播種
<ol><li>37°Cで2時間透明な底を持つ2つの黒い96ウェル培養プレートをポリL-リジンで32.25 μg/cm2で扱います。</li>
	<li>これらのプレートをM199培地で2回リンスします。CDCMの1 mLで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
	<li>細胞懸濁液トリパンブルーの10μLのアリコートに加えて、生きている細胞を染色します。細胞懸濁試料を血球計(マラッセの細胞計数室)に加える。<ol>
<li>顕微鏡下で、血球計の4列(すなわち40四角)の染色された細胞を数え、1行の平均細胞数を計算する。懸濁液の細胞の濃度を計算するには、次の方法を適用します: 細胞/mLの懸濁液の数 = 行内の平均セル数 (10 四方) x 10 トリパンブルー x 1,000 での血球減少の総平方数を 1,000 (セル/mL として結果を表す)</li>
	</ol>
</li>
	<li>CDCMを使用して、2つのめっき密度(1 x 105細胞/cm2および2 x 10 5細胞/cm2)に対応する2つの濃度(5.6 x 104細胞/mLおよび1.12 x 105細胞/mL)に細胞懸濁液を持って来なさい。</li>
	<li>2つの細胞懸濁液の種子50μLを、2つの前処理された黒96ウェル培養プレートに入った。プレートの右側から左側にマルチチャンネルピペットを使用してプレート内の細胞を分配し、各カラム間で均質化し、細胞の分布が均質になるようにします。</li>
	<li>あらかじめ定義されたパターンを用いてスクリーニングされる分子のライブラリの50μL(例えば、cDNAライブラリからのコンディションされたメディア、下記参照)を加える(表1)。</li>
	<li>培地交換なしで、37°CのCO2 の下で7日間プレートをインキュベートします。</li>
</ol>6. 生存可能な細胞を数える
<ol><li>プレートの各ウェルに、カルセインAMの2.7 μMとエチジウムホモモマーの0.3 mMを加えます。 注:カルセインは、エチジウムホモメータとして大きな分子に不浸透性である細胞を貫通します。生細胞の細胞質では、カルセインは内因性エステラーゼによって加水分解され、485nmで励起されると520nmで発光することにより蛍光化する。エチジウムホモジマーは死んだ細胞上のDNAに結合する。エチジウムDNA-ホモジマー結合は、520nmで励起した後、635 nmで赤色蛍光を放出する。</li>
	<li>光が当たらなくて室温でプレートを1時間インキュベートします。</li>
	<li>485と520 nmの2つの励起フィルターを備えた水銀ランプを備えた反転顕微鏡、520および635 nmの2つの発光フィルター、目的(x10)、プロセッサと電荷結合デバイスカメラ(CCD)によって制御される電動ステージで構成された自動プレートリーダーで蛍光を読み取ります。このカウントプラットフォームは、メタモルフソフトウェア19によって制御されます。96ウェルプレートの各ウェルで生きている細胞と死細胞の蛍光画像を同時に取得し、ウェルA1からウェルA12に向かい、次いでB12からB1に向かって、C12に向かってC12などを得ることを可能にする(表I)。</li>
	<li>負のコントロールの 18 ウェルを使用して、単一セルの平均領域 A を計算します (表 I)。</li>
	<li>各プレートウェル内のセルをカウントし、次の経験的な式A x 29 / 20.7を適用して、セルダブレット(2つのセルのグループ化)がカウントされるのを防ぎます。分子による円錐の保護効果を、負の対照の18ウェル内の分子対平均細胞数を試験した4つのウェルにおける平均細胞数との比率としてスコアを付けます( 表1 および 補足図1を参照)。</li>
	<li>1 x 105 細胞/cm2 で播種したプレートの結果と2 x 105 細胞/cm2 で播種したものを組み合わせて、スクリーニングされた各分子による潜在的保護(生存率)を評価します。</li>
</ol>

TL、J-ASおよびVFは、EdCVFを使用して、レチン系退性退化を治療するための特許を取得しています[WO2009071659(A1)。2007年6月12日]。

鶏の胚からのコーン濃縮培養の産生を制限する可能性のある多くのパラメータの中で、最初の重要なステップは、孵化卵中の胚の発達段階を正確に同定することです。ED8(第34段階)における胚のレチナからの細胞の培養は35%の感光体しか産生しない、残りの65%は他のニューロン4で作られていることが観察されている。孵卵を得るために適用されるロジスティックが何であれ、温度とインキュベーション時間を微調整し、開発42、45のすべての段階の参照写真と比較して胚を注意深く調べる必要がある。
もともと、コーンを豊かにした培養システムは、ホワイトレグホーン株4を用いて開発された。その株の卵の白い色はフランスでは特に評価されていないので、茶色の卵を生産する鶏肉の株を使用しました。JA57鶏5とI 66の雄鶏を交わして作られたI 657株を利用しました。オリジナル文化の特徴を再現することができました。これは、鶏肉の遺伝的背景がコーン濃縮培養を得るために重要ではないことを示しています。
我々は、培地中のサプリメントの個々の除去の効果を試験していないが、 インスリンがrd1 マウスにおけるコーンの生存に及ぼすインスリンの効果に従って重要な役割を果たしていることを観察した、常染色体劣性RP46のモデル。トリヨードサイロニン(T3)は、発達40の間のレチナル細胞運命における甲状腺ホルモン受容体の役割に従って、鶏胚の前駆体細胞の円錐への分化にも関与し得る。その結果、コーン濃縮培養システムは、発現クローニング46によってインスリンを同定するために使用することができない。
コーンエンリッチ培養システムは、一次ニューロンの培養に依存し、細胞株661W24、25、26として不死化細胞の使用に依存するはるかに適切なthaメソッドである。
ここで説明する方法は、プラスミドDNA20で前のエレクトロポレーションを行うことにより修飾することができる。レチナル細胞懸濁液を調製する前に、レチナ全体を、10 mM Tris-HCl pH 8.0,1 mM EDTAで0.5 μG/μLのプラスミドDNAの120 μLのカスタムメイドエレクトロポレーターのチャンバーに配置します。50 msのそれぞれ15Vの5つのパルスは950ミリ秒間隔22で分けて適用される。コンネ富化培養物への複製有能な鳥類スプライス(RCAS)レトロウイルスを用いた干渉RNA(RNAi)の送達試行は47に失敗した。これは確かに血清の不在や低密度の培養において、レトロウイルスの伝播に必要なレチナル前駆細胞は複製されないという事実によるものです。
我々は、発現クローニング19を用いてコーン生存を促進する栄養因子を同定するために、コーンを豊かにした培養システムを開発した。それを実現するために、100クローンのプールからコンディションされた培地を用いた高含有スクリーニングの第一歩を行った。ライブラリーからのcDNAがCOS-1細胞のトランスフェクション後に強力なCMVプロモーターの制御下で発現したとしても、個々のcDNAによってコードされるすべてのタンパク質が生存アッセイによって陽性にスコア付けされるのに十分な濃度に達するという保証を提供しない。これは大きな制限事項です。その意味で、スクリーニングは本当に網羅的ではありません。また、膜タンパク質をコンディション培地から除去しなくても、非拡散因子の同定にはアッセイの構成が好ましくない。別の方法は、同じ候補タンパク質を何度もアッセイする重複を避けるためにcDNAの配列を得た後に個々のクローンをスクリーニングすることです。これは、43を使用した retinal cDNA ライブラリのシーケンスによって開始されました。合理的ですが、このアプローチには限界もあります。cDNA配列のバイオインフォマティクス解析は、冗長性の減少に加えて、知識に基づいて特定のクローンをスクリーニングすることの優先順位付けを、たまらなく課す。最終的に、ライブラリ全体が大幅に長くなっても、ライブラリ全体がスクリーニングされる場合、これは有害ではありません。しかし、常に、シーケンスのアイデンティティは、結果を見る私たちの方法に影響を与えます。シーケンスの解釈は自然に実験データと競合するため、これは中立ではありません。
EdCVFの同定は、高いコンテンツスクリーニングには技術的な制限が伴うことも示している。スクリーニングの最初のラウンドから、我々は高い活性を有する2つのプールを同定した(補足図1)。プール0073はEdCVFの識別に成功しましたが、プール0080はそのような発見には行わなかった。サブプールの準備中にアクティブクローンが失われた場合に発生する可能性のある問題は解決していません。あるいは、統計的に良好でなくても、プール0080のcDNAの中で、2つのタンパク質が相乗的に作用しており、その活性を個々のクローンとして観察することができなかったことを排除しない。
小分子をスクリーニングしてコーンを保護する分子の同定は、コーン濃縮培養系の将来の応用である。このような分子は、遺伝子治療が加齢黄斑変性症として最も適切なアプローチではない眼科病変の治療に非常に貴重である。

脊椎動物種のレチナは二重で、薄暗い光ビジョン用のロッド感光体と、日光、色、視力ビジョンのためのコーン感光体を備えています。霊長類の視力は、錐体で濃縮された窩と呼ばれるレチナの中心にある領域に依存するが、全体的に、コーンはすべての感光体の5%しか表さない。その結果、霊長類のレチナにおけるコーンの分析、特にコーンの培養は技術的に困難である。他のすべての哺乳類種はfoveaを持たないし、肛門の研究で最も一般的に使用されるげっ歯類のコーンの割合は低い。これは、これらのよく見る鳥の種のレティナを支配する鳥類種には当てはまりません。進化の際に哺乳類が最初に出現したときに生態系を支配してきた恐竜は、鳥1の系統的起源にある。恐竜と初期哺乳類の間のこのような競争の結果として、哺乳類は主に棒によって支配されるレチナを有する夜行性である。進化の後になって初めて、霊長類が属するいくつかの哺乳類種の日次ビジョンが進化的な利点となった。それにもかかわらず、祖先期は哺乳類ビジョン2、3の進化における夜行性ボトルネックのアタビズムとして残っている。
副腎細胞分化を研究している間、アドラーとハトリーは、感光体が胚の日(ED)6またはステージ294で鶏由来の培養において、約70%のレチナル分化細胞を表していることを示した。鶏のレチナにおける円錐の有病率のために、ED6鶏胚からのレチナル細胞の培養は円錐を豊富に含む培養物として開発された5。
人間にとってコーンを介した視力の重要性は、トラウマである。コーン機能を変化させる遺伝性疾患や老化性疾患の影響を受ける人は、大きな障害を持っています。これは、これらの盲検疾患の治療法を見つけることを目的として遺伝性の遺伝性退化(IRD)に関する研究の非常に大規模な体を促進しました6,7.最初の成功は、IRDレーバー先天性アマウロシス(LCA)の重篤な形態の治療のために組換えアデノ関連ベクター(AAV)を用いて得られた、遺伝子治療8の概念実証である。変異がIRDを引き起こす遺伝子の同定は、遺伝子治療を使用してこれらの疾患を治癒する可能性を開きます。それにもかかわらず、これらの疾患は、200以上の異なる遺伝子9の突然変異から生じる。IRDの常染色体劣性形態の場合でも、病的遺伝子の正常なコピーの再導入が視覚機能を回復することができるとき、個々の開発の経済的コストは、あまり一般的なものではなく、遺伝的起源が不明のままであるものに対して最も一般的なものを支持する。この事実は、研究者がより一般的な治療法について考えるきっかけになった。アポトーシス細胞死は、一般的な経路として現れ、常染色体優勢形態10,11を含む感光体の変性によって進行するこれらの疾患の治療対象である。しかし、そのようなアプローチの成功は欠けています。IRDの最も一般的な形態については、網膜色素変性症(RP)は、共通経路が最終的にコーン12、13の変性に続く機能の二次的損失である。コーン機能の喪失を防ぐことは、原因変異14とは無関係に窩の中心視力を維持する。
RPの初期段階では、ロッドの喪失は、棒とコーン15の間の代謝および酸化還元シグナル伝達を遮断するヌクレドキシン様1(NXNL1)遺伝子によってコードされるロッド由来コーン生存率因子(RdCVF)の発現の減少を引き起こす。NXNL1遺伝子の2つの産物をコードする組換えAAVの投与により、栄養因子RdCVFとチオレドキシン酵素RdCVFLは、RP16の全遺伝形態におけるコーン視力喪失を理論的に防止できる。我々は、NXNL1遺伝子産物RdCVFLがチキンコーン濃縮培養17で発現され、保護的な役割を果たす場所18であることを示した。RdCVFおよびNXNL1遺伝子は、読出し19としてコーン濃縮培養物からの細胞の生存を用いたretinal cDNAライブラリーの高含有スクリーニングによって同定された。各クローンに対して8つの並列テストを使用して、ライブラリのクローン210,000個相当をスクリーニングしました。これは、生物学的材料、鶏の胚のレティナへの容易なアクセスを必要とする非常に多くのテストを表しています。産卵鶏や肉を産む鶏の農業産業向けに広く生産されているため、週単位で胚化鶏卵を得るのは比較的簡単であることがわかりました。コーンエンリッチ培養の慎重な標準化の後、システムはコーンの生存率を維持する能力のために何千もの分子をテストする簡単で堅牢で再現可能な方法を提供します。これらの細胞はまた、シグナル伝達の研究と生化学的分析21、22、23に利益をもたらす遺伝子操作20に適している。
研究家は、コーン細胞株661W24,25,26の使用として代替方法を開発した。それにもかかわらず、この細胞株のアイデンティティは議論の余地がある27、28.661W細胞を、ヒト光受容体間レチノール結合タンパク質プロモーターの制御下でSV40大T抗原を発現するトランスジェニックマウスラインのレチナル腫瘍からクローン化した。SV40大T抗原は細胞の形質転換と不死化を媒介する。その結果、661W細胞を用いて同定されたシグナル伝達経路は、その中のコーンとは多くの点で明確である形質転換および不死化細胞株の文脈に報告されなければならない。その点、コーンエンリッチ培養系は、一次ニューロン、より生理学的に関連するコーンで構成される。
マウスのレチナのビブラート断面を用いて感光体の純粋な培養を得ることは可能であるが、げっ歯類の外性のレチナにおけるコーンの非常に低い割合は、このアプローチをコーン濃縮培養29を作り出すためには不適当である。豚のretinaは、foveaを含んでいませんが、コーン30で非常に豊かにされたエリア中央と呼ばれる領域を持っています。アルビカンティス・アンソルゲイとプサンモミース・オブセッサス31、32のように、レナ・ディナル・げっ歯類のコーンの高い割合は、可能な解決策を提供するが、そのようなエキゾチックな種の繁殖を必要とする。地元の食肉処理場から採取された成虫の豚の目は、感光体生存33を研究するために使用されてきたロッドとコーンの混合培養物を作り出すために使用することができる。エレガントな解決策は、ピナツナグルチニン(PNA)レクチンをパンニングを使用してブタのレチナからコーンを予精製し、コーン34に選択的に結合する。しかし、このメソッドは複雑であるため、大規模に実装することは困難です。
ヒト誘導多能性幹細胞(iPS)は、腎移植に使用できるが、コーンエンリッチ培養35,36にも適応できるコーン感光体細胞集団を得るための最も有望なアプローチを提供する。転写因子NRLはロッド感光体37に必要であるため、Nrl-/-マウスは短波コーン(Sコーン)によって支配されるレチナを有する。不活性化は、iPS38,39からのヒトの分化によってS-コーン濃縮製剤を生成するために使用することができる。もう一つの可能なアプローチは、甲状腺ホルモンシグナル伝達40を使用して円錐分化を促進することです。ヒトiPSからコーンを豊富に含む培養を作製する新しい方法が出現しているが、鶏の胚は現在実証済みの方法19を提供する。
コーンリッチ培養は、発現クローニング19によるRdCVFの同定に役立った。このシステムは、RdCVFが好気性解糖分解22によってグルコース取り込みおよびその代謝を刺激することを実証するためにもうまく使用された。さらに、コーンエンリッチ培養は 、NXNL1 遺伝子23の第2の産物であるRdCVFLの保護役割を検証するために使用された。さらに最近では、OTX241を導入した網膜色素上皮細胞によって分泌される保護分子の存在を実証するためにこのシステムが用いられた。

<table><tbody><tr><td>96枚のブラックプレート(蓋付きクリアボタン、組織培養処理済み)</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>C1430</td><td></td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap&nbsp;FX HQ</td><td></td></tr><tr><td>CDPC (Cytidine 5&prime;-ジホスホコリンナトリウム塩二水和物)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C0256</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Independant</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>湾曲鉗子</td><td>Dutscher</td><td>005093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>Eggs incubator</td><td>FarmLine</td><td>M08 01 3100</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Homodimer</td><td>Thermo-Fisher scientific</td><td>E1169</td><td></td></tr><tr><td>F&oelig;タルウシ血清</td><td>サーモフィッシャー scientific</td><td>10270-098</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>サーモフィッシャー scientific</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0880</td><td></td></tr><tr><td>ITS (インスリン トランスフェリン セレン)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>大型ストレートプライヤー</td><td>ダッチャー</td><td>005074</td><td></td></tr><tr><td>リノール酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8384</td><td></td></tr><tr><td>M199 中</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>メタモルフソフトウェア</td><td>メタモル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フ顕微鏡</td><td>NIKON</td><td>Eclipse TE2000</td><td></td></tr><tr><td>電動ステージ</td><td>Martzauzer</td><td>Mutlicontrol 2000</td><td></td></tr><tr><td>光学フィルタースイッチ</td><td>シャッター楽器会社</td><td>ラムダ10-2</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>14190-086</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556</td><td></td></tr><tr><td>Pursept A エクスプレス</td><td>フィッシャー 科学</td><td>11814110</td><td></td></tr><tr><td>Putriscine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>ストレート鉗子</td><td>ダッチャー</td><td>005092</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T8691</td><td></td></tr>トリ<tr><td>ヨードチロニン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T6397</td><td></td></tr>トリ<tr><td>パンブルー</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン0.25%</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

鶏胚のレチナから、ロッドからコーン細胞相互作用を研究するコーンエンリッチ培養

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

人間の昼間の視力は、レチナ、窩の中心にあるコーン感光体の機能に依存しています。最も一般的な形態の遺伝性網膜変性、網膜色素変性症に罹患している患者は、ロッド感光体の突然変異駆動喪失のために夜間視力を失い、その後、機能の進行性喪失および失明につながるコーンの死を引き起こした。遺伝学者は、この疾患を引き起こす突然変異を有する多くの遺伝子を同定したが、最初に同定された突然変異は、二次コーン変性のメカニズムと、ロッドで排他的に発現する視覚色素をコードするロドプシン遺伝子の支配的な突然変異がコーン変性を引き起こす方法を疑問視した。
この疾患の遺伝的モデルにおける移植の結果は、棒と錐体の間の細胞相互作用の概念と、網膜色素変性症のすべての遺伝的形態における錐体の非細胞自律変性の概念につながった。
コーンはヒトのすべての感光体の5%、マウスの3%しか含まないので、これらの種では研究は難しいが、コーンは鳥類の棒を上回る。我々は、その発達の段階29で鶏胚のレティナから培養レチン前駆体に96ウェルプレートを適応させました。これらの一次培養において、円錐はインビトロ分化後の細胞の80%を表す。細胞は、血清がない場合に1週間の期間にわたって退化する。ここでは、メソッドとその標準化について説明します。
このコーン濃縮培養系は、ラット網膜色素上皮正規化cDNAライブラリーの高含有スクリーニングにより上皮由来コーン生存率因子(EdCVF)を同定するために使用された。組換えEdCVFは、コーンの変性を防ぎます。

ここでは、コーン濃縮培養システムを使用して、新規のコーン保護タンパク質を同定する方法を説明します。このプロトコルを使用して、8週齢のLong-Evansラット43の400眼から脈絡膜および網膜色素上皮で作られた正規化されたcDNAライブラリをスクリーニングしました。
このライブラリには、6.0 x 106 個の独立したコロニー形成ユニット (CFUs) が含まれ、平均クローン挿入サイズは 2.1 キロベース (kb) で、組み換えクローンの 99% を超えています。そのライブラリーから100クローンのプールを一過性にトランスフェクトし(0.1μgのプラスミドDNA)をCOS-1細胞に、COS-1のコンディション培地(CM)を、血清なしでDMEMで48時間培養した後に収穫した。膜またはエキソソームは、超遠心分離によって除去されなかった。各CMの50マイクロリットルは、2つの96ウェルプレートの4つのウェルに加えられました:1つは2 x 105 細胞/cm2で播種し、もう1つは4 x 105 細胞/cm2で播種した。ライブラリを構築するために使用される空のベクターpcDNA3.1にトランスフェクトされたCOS-1細胞からのCMを、陰性制御として用いた(表1)。211,200個のクローンに対応する100クローンの合計2,112セットを4つの培養ウェルおよびコーン濃縮培養の2つの播種条件について評価した。2つの条件は、2つのわずかに異なる接種密度に対応し、合計1,689,600の培養井戸に対して、保護活性をより正確に評価することを可能にする。
2より大きい比率を有するクローンの42プールのうち、プール0080および0073は、負の対照よりも培養の7日後に生存率比が16および14倍高い、pcDNA3.1(補足図1)。この分析は、関心のあるプールを特定するために不可欠です。100クローンの各選択されたプールは、グリセロールストックから10クローンの16セットに細分化された。これらのサブプールは、スクリーニングの第2ラウンド(すなわち、合計3,200の培養井戸)で同じ方法に従って調製し、試験した。サブプール0073-09は最も強い生存率を与え(補足図2A)、コーンエンリッチ培養物のスクリーニングの第3ラウンドで試験した16個のクローンを作製するために細分化された。クローン0073-09-37クローンは明らかに2.5に等しい生存率を持つ他のクローンから際立っています (補足図2B)。なお、y軸は、補助図2Aとはシード密度が同じであった場合でも、スケールが異なる。私たちは、アッセイが何ヶ月も毎週繰り返されるとき、これを一般的に見てきました。分析後、これらの結果はクローン0073-09-37が円錐生存に強く、再現性のある効果を有することを確認した。テストは独立して繰り返され(図3A)、挿入された1.8kbはシーケンス化された(図3B)。
バイオインフォマティクス分析の結果、上皮由来コーン生存率因子(EdCVF)と名付けられたクローン0073-09-37には、ラットタンパク質亜鉛フィンガープロテイン-180(ZFP180、NP_653358 470)のC末端部分の84残基に対して最も上流(ORF1)がコードする3つのオープンリーディングフレーム(ORF)が含まれていることが明らかになった。他の2つのORF(ORF2およびORF3)は、マウスではあまり保存されず、他の哺乳類には存在しない。独立して試験した場合、ORF1だけがコーンに対して保護効果を発揮する(補助図3)。ORF1はグルタチオンSトランスファーゼ(GST)融合タンパク質として産生した(図4A)。このEdCVFタンパク質を精製し、GSTタグを除去した(図4B)。EdCVFは、コーンエンリッチ培養システムにおけるコーン変性を防ぐことができる(図4C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig01.jpg"> 図1:鶏の胚を発生期28、29日、30日に矢印W:翼、C:襟とB:法案。スケールバー1cm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig02.jpg"> 図2: 鶏胚の残性の解剖この<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig02large.jpg" target="_blank">図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig03.jpg"> 図3:上皮由来コーン生存率因子(EdCVF)、クローン0073-09-37。A. コーンエンリッチ培養の実行可能性の向上。 B. cDNAクローン0073-09-37の配列。下線付きの列GAATTCは、ライブラリを構築するために使用されるEcoRI制限サイトです。太字の2つのコドンGTGは、ベクトルに由来するEdCVFの珍しい翻訳開始部位です。学生のテストによる統計分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61998/61998fig04.jpg"> 図4:組換えEdCVF活性. A.グルタチオンS-トランストランスナーゼ(GST)との融合におけるEdCVFの配列。B.精製組換えEdCVFタンパク質。C.培養におけるコーン上のGST-EdCVFの栄養活性Tukeyの検定を用いた統計分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/61998fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:cDNAプールと陰性対照の平均細胞数の比率は、第1回スクリーニング中に空のベクターpcDNA3.1にトランスフェクトされたCOS-1細胞のコンディション培地である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplemntary_File_1_12_11_2020.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:生きている細胞の数。A. 0073プールのサブプールによるスクリーニングの第2ラウンド。B.分離クローンによるスクリーニングの第3ラウンド。CN:空のベクターにトランスフェクトしたCOS-1細胞のコンディション培地であるpcDNA3.1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_Figure_2_12_11_2020.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a> 
補助図3:単離クローン0073-09-37の3つの開いた読み取りフレームの栄養活性。 ダネットの検定を用いた統計解析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61998/Supplementary_figure_3.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>NC</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>NC</td>
		</tr>
<tr>
<td>ロ</td>
			<td>NC</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>NC</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>6</td>
			<td>NC</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>NC</td>
			<td>7</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>ニ</td>
			<td>8</td>
			<td>8</td>
			<td>NC</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>NC</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>11</td>
			<td>NC</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>12</td>
			<td>NC</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘ</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>NC</td>
			<td>14</td>
			<td>14</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>15</td>
			<td>NC</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>16</td>
			<td>17</td>
			<td>NC</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>NC</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>18</td>
			<td>18</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>19</td>
			<td>NC</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
			<td>NC</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="13">NC ネガティブコントロール</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="13">4倍にテストされたプールの1-20の位置</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:高内容スクリーニングのための96ウェルプレートの計画

鶏胚のレチナからコーン感光体の一次培養物を得るための方法と、高含有スクリーニングの使用について述べた。

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

この方法は、昼間の視力に不可欠なコーン受容体を研究するために使用されます。.方法の利点は、それが簡単にアクセス可能である受精鶏卵を使用していることです, そして、主要なコーン培養の唯一のソースの一つ.このプロトコルは、遺伝性の残性変性に対する将来の有望な治療法であるロッド由来コーン生存率因子を同定するために使用された。さらに、このプロトコルは、錐体の感光体代謝を研究するために使用された。記載されたプロトコルに注意深く従うことによって、一次細胞培養における専門知識を持つ個人は、数回の試みだけでコーン濃縮培養を得ることができるべきである。工業用孵化場から毎週受精卵を採取することから始めます。受精卵を17°Cで実験室で維持する。各培養ごとに、7個の受精卵を摂氏20度で24時間、加湿室で摂氏37度で136時間、傾斜が断続的に反転します。鶏の胚を回収するには、卵の表面を消毒剤で洗い、大きなまっすぐなペンチで殻の上部に穴を開けて卵殻を割り、殻を切って卵から帽子を取り除きます。卵殻から各胚を湾曲した鉗子でそっと抽出し、以前に摂氏37度に加熱した滅菌PBSを含むペトリ皿に移します。胚を取り囲む封筒を慎重に取り除きます。ハンブルガーとハミルトンとの視覚的な比較によって各胚の発達段階を確認し、開発の第29段階で2つの胚を選択し、これらの選択された胚の目を核とし、二酸化炭素非依存媒体に移す。二酸化炭素非依存媒体で働き、角膜を下に向け、視神経を実験者に向けた4つの目を配置する。2つのストレート鉗子を使用して視神経に穴を開けます。網膜と色素上皮の間に各鉗子の枝を挿入し、眼を引いて回転させて網膜から上皮を取り外す。角膜を取り除き、続いてレンズとガラス膜を取り除きます。4つのレチナをpH 7.2でリンガーの媒体を含むペトリ皿に移します。2つのまっすぐなペンチを使用して非常に小さな部分に4つのレチナをカットし、リンガーの媒体で2回洗浄します。2回目の洗浄後、レティナの破片をチューブの底に落とし、培地を取り除きます。トリプシンの溶液で37°Cで20分間、レチナルピースを扱います。20分後、10%不活性化胎児の子牛血清を添加した培養培地を添加して反応を停止する。DNase 1の0.05mgで細胞懸濁液をインキュベートし、ピペットで上下にピペット処理を行い、細胞クラスターとDNAをすぐに解約する。レチン細胞懸濁液を化学的に定義された培養培地またはCDMで2回洗浄します。ポリリシンを含む透明な底を持つ2つの黒い96ウェル培養プレートを摂氏37度で2時間扱います。終了したら、M199培地でプレートを2回リンスします。細胞懸濁液の10マイクロリットルのアリコートにトリパンブルーを加えて、生きている細胞を染色する。その後、細胞懸濁液の標本をヘモサイトメーターに加えます。細胞を計数した後、CDMを用いて細胞懸濁液を適切な濃度に持ち込む。あらかじめ定義されたパターンを使用してスクリーニングされる分子のライブラリーの50マイクロリットルを加える。2つの細胞懸濁液の50マイクロリットルを2つの前処理された黒い96ウェル培養プレートに種付けします。プレートの右側から左側にマルチチャンネルピペットを使用してプレート内のセルを分配し、各カラム間で均質化します。その後、培地を変えずに5%の二酸化炭素の下で、摂氏37度で7日間プレートをインキュベートします。生存細胞を数えるために、プレートの各ウェルに2.7ミクロモルカルセインAMと0.3ミリモルエチジウムホモジマーを加えます。光がなさらなくて室温でプレートを1時間インキュベートする。485および520ナノメートルの2つの励起フィルター、520および635ナノメートルの2つの放出フィルターおよび電荷結合された装置のカメラが付いている水銀ランプが装備されている逆の顕微鏡で構成される自動版の読者の蛍光を読む。このプロトコルは、生後8週間の400眼から脈絡膜および網膜色素上皮で作られた正規化されたcDNAライブラリをスクリーニングするために使用されたロングエバンスラット。211に対応する100クローンの合計2,112セットを、200個の個別クローンを評価した。2つを超える比率を有するクローンの42プールのうち、プール0080および0073は、培養7日後の負の対照よりも生存率比が16および14倍高い。100クローンの各選択は、それらのグリセロールストックから10クローンの16セットに細分化された。サブプール0073-09は最も強い生存率を与え、コーン濃縮培養物のスクリーニングの第3ラウンドで試験された16個のクローンを作製するために細分化された。クローン0073-09-37は2.5の生存率の比率で際立っていた。さらなる分析は、このクローンがコーン生存に対して堅牢で再現性のある効果を有することを確認した。テストは独立して繰り返され、1.8キロベースの挿入を配列した。バイオインフォマティクス分析の結果、上皮由来円錐生存率因子と名付けられたクローン0073-09-37、またはEdCVFには3つのオープンリーディングフレームが含まれていることが明らかになった。独立して試験した場合、ORF1だけがコーンに対して保護効果を発揮した。ORF1はグルタチオンSトランスファーゼタンパク質として製造した。上皮由来のコーン生存率因子を精製し、GSTタグを除去した。栄養活性の分析は、EdCVFがコーンエンリッチ培養系におけるコーン変性を防ぐことができることを実証した。この手順を試みる場合、胚の発達段階は、コーン濃縮培養を得るために慎重にチェックする必要があります。このプロトコルに従って、細胞をプラスミドDNAで電気ポレートして、RdCVFのような生存因子の分子機構を研究することができる。この技術は、コーン生存の数学的モデルの開発を含む代謝研究の開拓を行う。

cone-enriched-cultures-from-retina-chicken-embryos-to-study-rod-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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ニワトリ胚網膜細胞培養物は、感光体の生物学の研究のための貴重なツールを構成しています。私たちは文化の前に網膜のプラスミドエレクトロポOVOの元に基づいて、効率的な遺伝子導入技術を開発しました。この技術はかなりこのシステムの実現可能な遺伝子操作を行う、現在利用可能なプロトコルを介してトランスフェクション効率を向上させます。...

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我々は、マウス網膜のex vivoでのスライス標本を用いて、錐体光受容体の軸索末端におけるCa 2+動態を監視するためのプロトコルを記述します。このプロトコルは、重要な哺乳動物モデル系におけるコーンのCa 2+シグナル伝達の包括的研究、マウスを許可します。...

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

このプロトコルは、解剖実験的に操作し、ニワトリ胚の培養全体の網膜外植する方法について説明します。高い成功率、有効性と再現性をエレクトロポレーションおよび/ ​​または試薬物質、 すなわち、酵素阻害剤のためのプラスミドの効果をテストするために必要な場合、外植片培養は便利です。...

エレクトロポレーションおよび化学試薬の治療のための鶏胚からの全網膜の外植片

このプロトコールは、光学的透明化と免疫標識を組み合わせて、ホールマウント網膜オルガノイドの全容積共焦点イメージングを実現します。3D構造を保持し、主要なニューロン経路の詳細な視覚化を可能にし、網膜の成熟、空間構成、および疾患モデリングや個別化医療への応用の可能性の研究を改善します。...

細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化

学ぶ鶏胚レチナ由来コーン光受容体培養法。網膜変性治療薬スクリーニングのため、コーン細胞生存因子を同定する手法を確立。神経科学と細胞培養の重要モデルとして応用可能。

鶏胚のレチナから、ロッドからコーン細胞相互作用を研究するコーンエンリッチ培養

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