Name: マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶマウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞を精子代替として用い、半クローン胚を作製する方法。ゲノムインプリンティングの研究と生殖生物学への応用が可能となる。

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ジュリオ・ディ・ミン博士のphaESCラインの誘導、フローサイトメトリー手術のレモ・フライマン博士に感謝します。また、ミシェル・シャフナー氏とトーマス・M・ヘネク氏が胚移植に関する技術支援を行ったことを認めます。この研究は、スイス国立科学財団(助成金31003A_152814/1)によって支援されました。

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<li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072(2020).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li>
<li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li>
<li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li>
<li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li>
<li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li>
<li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBehringer%2C+R+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2014).</li>
<li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li>
<li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li>
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<li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li>
<li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li>
<li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+the+genome%3A+role+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+Supplement%22%5BJournal%5D)">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li>
<li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

体細胞核移動による哺乳類のクローニング(SCNT)は、1990年代、20年、21年に開拓された。これらの開発は、両生類22で30年前に行われたクローニング研究に続いた。かなりの遅延は、哺乳類における発生学およびゲノム刷り込みの難しさを反映している。哺乳類SCNTの開発は、精子を置換するためのhaESCの適用の基礎であり、このプロトコルで詳述されている。
セル周期同期は、SCNT23の成功の重要な要素です。これは、このプロトコルでのhaESCの注入の場合でもあります。レシピエントにドナーゲノムを導入するには、染色体破損や胚の発達を損なう無数化を避けるために、細胞周期相を一致させる必要があります。セミクローニングは、2つのゲノムと細胞トップラストに互換性を持たねねねなくてはないほど複雑です。以前の報告では、M相逮捕アンドロジェネティックhaESCの注入は、卵母細胞へのG1相haESCの注入よりも半クローン胚のより良い発達率をもたらしたことを実証した7。このレポートは、セミクローニングに適した同期点としてM-phaseを提案します。したがって、ファエスクは、デメコルシンとのメタフェーズでマイトサイト的に逮捕され、MII卵母細胞の卵母斑に注入され、これは自然にマイオシスのメタフェーズIIで逮捕された。重要なことに、M相停止は、ドナーとレシピエント細胞サイクル間の優れた同期を提供し、高効率のマウスESCで達成することができます。
有糸分裂の間、核膜は分解し、複製された染色体が付着する紡錘の形をする。M相DKO-phaESCを注入した後、姉妹クロマチは擬似極体とザイゴテ7 に分離される(図3E)。その結果、DKO-phaESCからの染色体の単一のセットは、半クローン胚に寄与する。DKO-phaESC染色体の姉妹染色体は、注射後に正しく分離できることが重要です。無傷のDKO-phaESCの原形質膜は、疑似極性体への分離を防ぎます。DKO-phaESCの原形質膜が破裂せず、胚が注射後に卵母質に無傷のDKO-phesCを示した稀な症例を実際に観察した(図3D)。したがって、ピペット処理によってDKO-phaESCの原形質膜を除去するために注意する必要があります。注射中に、卵母細胞の大腸スピンドルの破壊を避けることも同様に重要であり、染色体分離欠陥を引き起こし、異数化を誘発する可能性もある。
哺乳類では、ゲノムインプリンティングは、精子置換としてのファセスクの適用を制限する。パルテノジェネティックhaESCはゲノムインプリントの母体構成を有し、精子は父親の構成を有する。したがって、精子置換として野生型ファセスクを注射した後、完全な期間の子犬の生成は起こっていない。この制限を克服するために、IG-およびH19-DDRの欠失はファエックで設計される。母体Igf2-H19およびGtl2-Dlk1 lociにおけるインプリント発現の修飾は、転写された2細胞胚に基づいて、5.1%以上の頻度を有する半クローンマウスの生成を可能にするゲノムインプリントの構成を変更するのに十分である。これらの観察は、2つのインプリントされた遺伝子を標的とすることで、phaESCのゲノムをマウスの精子に置き換えることができる機能的な父方構成に切り替えることを示唆している。それにもかかわらず、この戦略にはphaESCの恒久的な遺伝子組み換えが必要です。代替戦略として、アンドロジェネティックhaESCを検討することができます。アンドロジェネティックなHAESCは、精子ゲノムに由来し、父方のインプリントを所有しています。野生型アンドロジェネティックhaESCが精子置換術として寄与し、移された胚4、7、24の1.3%から1.9%の頻度で全期の子犬を生成したという報告がある。フルタームの子犬はまた、IGの欠失を伴うアンドロジェネティックなhaESCを注入することによって得られた - とH19-DDRは、移された2細胞胚の20.2%の頻度で24。改変アンドロジェネティックhaESCを用いたセミクローニングの効率の向上は、インプリントが培養中に不安定になる可能性があるためである可能性が高い。刻印欠陥は、重要なDDRの遺伝的欠失によって修正される。
卵母細胞や精子のゲノムに遺伝子組み換えを直接導入するのが難しいので、haESCは親のゲノムを別々に操作するための貴重なツールです。精子の代用としてhaESCを使用すると、マウス生殖細胞系列におけるゲノム編集に顕著な利点をもたらします。最近の研究では、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集と、胚発生に不可欠なインプリンティング領域の特性評価のためのhaESCの応用を組み合わせたものであった12。本研究では、母性マウスの開発におけるH19-およびIG-DMRとの組み合わせにおけるRasgrf1-DMRの役割と、卵子子の発達における7つの異なるDMRの機能を分析した。精子に対するhaESCの置換方法は、原始胚芽細胞の発達におけるDND1タンパク質内の主要アミノ酸を同定し、骨発達24、25、26における遺伝子を同定するための遺伝子スクリーニングアプローチの基礎を形成した。胚発生の重要な要因を特定するためのゲノムインプリンティングと遺伝子スクリーニングに関する研究は、haESCをガメティックゲノムとして適用するためのかなりのアプローチです。

哺乳類では、次世代に遺伝情報を伝達する唯一の細胞である。卵母細胞と精子の融合は、成虫動物に発達するジプロイドジゴテを形成する。ガメティックゲノムの変異は、それによって子孫によって継承され、種1の遺伝的変異を駆動する。生殖細胞系列の変異の導入は、遺伝子機能の特徴付けや疾患モデリングを含む多様な生物学的研究のための遺伝子組換え動物を生産するために適用されている。卵母細胞と精子の両方が末端分化され、増殖を停止した高度に特殊化された細胞です。そのため、ディステットの直接改変は技術的に難しく、特殊なアプローチが開発されている。遺伝子組み換えは、遺伝子組み換えESCを胚盤胞に注入することによってマウス生殖細胞系列に導入され、そこで発達中の胚に統合され、生殖細胞系列を植民地化する。また、CRISPR/Cas9システムを含むゲノム編集手法を用いた接合体の遺伝子改変が広く採用されている。
近年、ゲーミティックゲノム3、4、5、6、7、8の代替としてhaESCを適用する顕著なアプローチが報告されている。HaESCsは、パルテノジェネティックまたはアンドロジェネティックハプロイド胚盤胞の内側の細胞塊に由来する幹細胞株であり、染色体4、7、9、10の単一のセットを有する。また、検体ゲノムとアンドロジェネティックhaESCの両方が、卵母細胞への細胞質内注射後に半クローンマウスのゲノムに寄与することが実証されている。他のアプローチとは対照的に、haESCのゲノムは自己再生能力のために培養中に直接改変することができる。精子をhaESCsに置き換えることによって生殖細胞系列に遺伝子組換えを導入することは、生物学的研究にとって重要な方法です。これは、それぞれパルテノジェネティックまたはアンドロジェネティックhaESCに由来する母体または父方のゲノムを分離して培養し、操作する可能性を提供します。その後、HaESCは、ゲノムインプリンティング、アレーレ特異的発現、および親固有のプロセスの研究に特に有利な、ガメティックゲノム置換として使用することができます。
マウスでは、正常胚発生11には母体と父方のゲノム情報の両方が必要である。したがって、精子ゲノム5,8を置換するために野生型パルテノジェネティックhaESC(phaESC)を注入した場合、完全な子犬は得ることができなかった。この発達ブロックを克服するためには、パルテノジェネティックhaESCの母体ゲノムのゲノム刷り込みは、父方の構成に修正する必要があります。これは、微分メチル化領域(DDR)の操作によって達成することができる。現在までに、H19-DMR、Gtl2-Dlk1 IG-DMR、およびRasgrf1-DMRの標的欠失が、phaESC3、5、8、12において母体的に発現した遺伝子を抑制することを研究されてきた。 これらの研究は、H19-DMRとIG-DMRの両方の欠失は、精子染色体の代わりにすることができる父方のインプリント構成に母親を変換するのに十分であることを実証した。卵母細胞に2つのDMR欠失を運ぶphaESCの細胞内皮注入は、移された2細胞胚の5.1%から15.5%の頻度を有する半クローンの子犬を生み出した。
このプロトコルは 、H19-DMR と IG-DMR の両方を削除した phaESC の適用に基づいています。我々は、DKO-phaESCラインを確立するためのファエスクにおけるゲノムインプリンティングの改変、精子ゲノムの代替として卵母細胞へのDKO-phesCの注入、半クローン胚の培養、半クローンマウスの取得に関する詳細な指示を提供する。このプロトコルは、父親のゲノムの正確かつ直接的な操作と半クローン胚およびマウスの生成を必要とする研究者のための参照である。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>12 ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>メルク</td><td>M6250</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>BSA フラクション</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>デメコルシン溶液</td><td>メルク</td><td>D1925</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>DR4 マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>3208</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>メルク</td><td>E5134</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC 培養</td></tr><tr><td>凍結培地</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC培養</td></tr>ゼ<tr><td>ラチン</td><td>メルク</td><td>G1890</td><td>haESC培養</td></tr><tr><td>Hepes溶液</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC培養</td></tr> 照射<tr><td>MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC培養</td></tr><tr><td>LIF(白血病抑制因子)(</td><td>自家製)</td><td>-</td><td>haESC培養</td></tr><tr><td>Lipofection試薬</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC培養</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX330 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX458 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>ジェノタイピング</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>メルク</td><td>100317</td><td>ジェノタイピング</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>メルク</td><td>109634</td><td>ジェノタイピング</td></tr><tr><td>プロテイキング プロテイキング K</td><td>軸索</td><td>A3830</td><td>ジェノタイピング</td></tr><tr><td>SDS</td><td>メルク</td><td>71729</td><td>ジェノタイピング</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>106404</td><td>ジェノタイピング</td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>5 mL チューブ</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>5 mL Tube with cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>1 mLシリンジ</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>超排卵</td></tr><tr><td>30ゲージ 1/2インチ 針</td><td>メルク</td><td>Z192362-100EA</td><td>超排卵</td></tr><tr><td>B6D2F1 マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>100006</td><td>超排卵</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD 動物の健康</td><td>49451</td><td>超排卵</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ギブコ</td><td>10010015</td><td>超排卵</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>超排卵</td></tr><tr><td>10 cm ディッシュ</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>胚操作</td></tr><tr><td>4 ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>胚操作</td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>胚操作</td></tr><tr><td>6 cm ディッシュ</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>150288 胚操作</td></tr><tr><td>センターウェルディッシュ</td><td>コーニング</td><td>3260</td><td>胚マニピュレーション</td></tr><tr><td>デジタルロッカー サー</td><td>モサイエンティフィック</td><td>88880020</td><td>胚マニピュレーション</td></tr><tr><td>EGTA</td>マニピュレーション EGTA<td>アプリケム</td><td>A0878</td><td>胚マニピュレーション</td></tr><tr><td>ヒアルロニダーゼ</td><td>メルク</td><td>H4272</td><td>胚マニピュレーション</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>メルク</td><td>MR-020P-5F</td><td>胚マニピュレーション</td></tr><tr><td>M16中</td><td>メルク</td><td>M7292</td><td>胚操作</td></tr><tr><td>M2 中</td><td>メルク</td><td>M7167</td><td>胚操作</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td>メルク</td><td>M8410</td><td>胚操作</td></tr><tr><td>ガラス毛細血管</td><td>メルク</td><td>P1049-1PAK</td><td>胚操作</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ745</td><td>胚操作</td></tr><tr><td>塩化ストロンチウム</td><td>メルク</td><td>13909</td><td>胚操作</td></tr><tr><td>5mlシリンジ</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスカッピラリー</td><td>科学製品</td><td>GB100T-8P</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>CellTram 4rオイル</td><td>エッペンドルフ</td><td>5196000030</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>フルオロインナートFC-770</td><td>メルク</td><td>F3556</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>ホールディングピペット</td><td>バイオメディカル機器</td><td>-</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス Ti-U</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>マイクロフォージ</td><td>ナリシゲ</td><td>MF-900</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td></td><td>マイクロインジェクション ピペット バイオメディカル機器</td><td>-</td><td>マイクロ</td></tr><tr><td>インジェクション マイクロローダーチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>5252 956.003</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>Micromanipulaorの腕</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>のマイクロインジェクション</td></tr><tr><td>のマイクロピペットの引き手</td><td>Sutterの器械</td><td>P-1000</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>の5194000016</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>PVP(ポリビニルピロリジン)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>マイクロインジェクション</td></tr><tr><td>のシリンジ</td><td>フィルターSARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>マイクロインジェクション</td></tr></tbody></table>

マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

性生殖を伴う生物では、生殖細胞は新しい個体に発達する全能性細胞の源である。マウスでは、精子によって卵母細胞の受精は、トーティポテンスの接合子球を作成します。最近、ハプロイド胚性幹細胞(haESC)がガミスティックゲノムの代用となり、マウスに発達する胚に寄与することが報告されています。ここでは、卵母細胞への細胞質注入によって胚を構築する精子の代替としてパルテノジェネティックhaESCを適用するプロトコルを提示する。このプロトコルは、精子置換としてhaESCを調製するためのステップ、卵母細胞へのhaESC染色体の注入、および半クローン胚の培養のためのステップで構成される。胚は、胚移植後に肥沃な半クローンマウスを生み出すことができる。精子置換にHAESCを用い、生殖細胞のゲノム編集、胚発生の研究、ゲノムインプリンティングの研究が容易になります。

この記事は、半クローン胚の構築のための精子の代わりにパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の使用を実証することを目的としています。

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

このプロトコルは、半数体マウス胚性幹細胞のゲノムインプリンティングの変更を誤って日付付けし、私たちの被験者が偽の精子によるものであり、マウスの自家製胚の生成を可能にしています。配偶子の遺伝子組み換えには、一般的に難しい技術が必要です。この方法論を用いて、親配偶子をハイブリッド胚性幹細胞で操作し、その後の精子置換オプションとしてマウスに導入することができる。この方法は、胚の父方の配偶子の人工的な特異的な改変を可能にするため、ゲノムインプリンティングと焼灼の研究に特に適用できます。この手順を実演するのは、私の研究室のマウス発生学者であるCharles Etienne Dumeauです。実験用のホールディングピペットとマイクロインジェクションピペットを準備するには、まずマイクロピペットプーラーを使用して、細長い形状と緩やかなテーパーを持つホウケイ酸ガラスキャピラリーを引っ張ります。保持ピペットを準備するには、外径60〜100マイクロメートルの引っ張られたキャピラリーをマイクロフォージにマイクロフォージで配置し、フィラメントのガラスビーズの上に置きます。フィラメントのスイッチを入れ、キャピラリーがビーズに接触するまでキャピラリーを下げます。キャピラリーがビーズに付着したら、フィラメントのスイッチを切り、キャピラリーを引っ込めると、キャピラリーがまっすぐな端で壊れます。次に、壊れたキャピラリーチップをフィラメントのガラスビーズの隣に水平に配置し、キャピラリーチップの内径が直径10〜20マイクロメートルに達するまでフィラメントを加熱して端を溶かします。次に、キャピラリーを先端から約1mmのガラスビーズの上に置き、フィラメントを加熱してキャピラリーを20度の角度に曲げます。マイクロインジェクションピペットを調製するには、加熱されたフィラメント上のガラスビーズの外径約6マイクロメートルの引き上げられたキャピラリーを配置し、ビーズに接触するまでキャピラリーを下げます。キャピラリーが付着したら、フィラメントのスイッチを切り、キャピラリーを引っ込めます。キャピラリーはまっすぐな端で壊れます。次に、キャピラリーをキャピラリーの先端から約1mm離れたガラスビーズの上に移動し、フィラメントを加熱してキャピラリーを20度の角度に曲げます。細胞質内注射を行うには、5マイクロリットル滴のPVP溶液と20マイクロリットル滴のM2培地を10センチメートル皿の逆さまの蓋に置き、滴を鉱物油で覆います。ディッシュをステージに置き、マイクロマニピュレーターに保持ピペットを取り付けます。マイクロローダーチップを使用してマイクロインジェクションピペットにフルオロカーボンオイルを充填し、ピペットをピエゾアクチュエーターに取り付けます。顕微鏡で観察しながら、マイクロインジェクションピペットをPVP溶液の滴に下げます。ピペットを浸したら、ピペットを数回上下させて、ガラスをPVPでコーティングします。少量のPVP溶液をマイクロインジェクションピペットにロードします。マイクロインジェクションピペットとホールディングピペットをM2培地に浸し、液滴の底にあるピペットに焦点を合わせます。約2マイクロリットルのダブルノックアウトパルソージェニックES細胞懸濁液をM2培地ドロップに移し、マウスピペットを使用して10個のM2卵子を同じドロップに移します。1つの卵子を回転させ、保持ピペットを介して負圧を加えて卵子を保持し、中期2プレートがマイクロインジェクションピペットの経路に配置されないように注意しながら、周辺スペースがマイクロインジェクションピペットに面するようにします。マイクロインジェクションピペットの先端に1つのダブルノックアウトパルトジェニックES細胞を引き出し、細胞膜の破裂を確認します。マイクロインジェクションピペットに軽い負圧を加え、マイクロインジェクションピペットの先端をペリビテリン空間に向かって押しながら4つのピエゾインパルスを送達して、透明帯を突破します。マイクロインジェクションピペットで卵子を貫通して、オレマが反対側に伸びるようにし、1つのピエゾパルスを適用してオレマを貫通し、オレマがマイクロインジェクションピペットのシャフトに沿って弛緩することを確認します。ダブルノックアウトパルトジェニックES細胞を最小限の培地で卵形質に注入し、マイクロインジェクションピペットを卵子からスムーズに引き抜きます。注入した卵子を保持ピペットから放出し、後で収集するためにマイクロドロップの側面に移動します。すべての卵子を注入したら、KSOM培地を含む予熱したセンターウェルディッシュに卵子を移し、ディッシュを摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートしてから活性化します。この代表的なダブルノックアウトパルソージェニックES細胞株のDNA含量解析は、フローサイトメトリーによりCAG/EGFP導入遺伝子を担い、G0、G1、S、およびG2 M期における一倍体細胞および二倍体細胞の分布を示しています。ジェノタイピングは、H19および遺伝子間差次的メチル化領域に野生型対立遺伝子が存在しないことを確認するために実施できます。CAG/EGFP導入遺伝子をダブルノックアウト病原性ES細胞に導入し、顕微鏡下で緑色蛍光を可視化することにより、セミクローニング胚への寄与を研究することができます。フローサイトメトリー解析では、デムカルセン処理後のG2 M期停止一倍体細胞および二倍体細胞に対応する2つの集団が示されています。1Nの半数体ピークがないことは、細胞の休息サイクルがほぼ完全であったことを示しています。注入後、構築されたセミクローニング胚でEGFP発現が検出されることはめったにありません。ダブルノックアウトパルトジェニックES細胞の細胞質が卵母細胞の大きな細胞質に分散します。活性化後6時間で、最大3つの極性体を顕微鏡で観察できます。卵子の第1極性体と第2極性体、および一倍体ESCからの1つの疑似極性体。その発生能力を実証するために、セミクローン胚を胚盤細胞の段階まで培養することができます。さらに、レシピエント雌の卵管に移植されたセミクローニングされた2細胞期の胚から、満期の雌マウスを得ることができる。マイクロインジェクションでは、卵子が活性化されたときの染色体分離を防ぐために、一倍体胚性幹細胞の原形質膜を破裂させることが重要です。単為生殖一倍体ES細胞の代わりに、アンドロゲン一倍体ES細胞も使用できます。これにより、研究目的に応じて、母方または父方の配偶子を精子の代替として選択することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

開発の初期段階で始原生殖細胞に分化する胚性生殖細胞の能力は、がんと不妊についての我々の仮説に対応するために最適なモデルです。このプロトコルは、10.5から11.5日後に交尾のマウス胚での開発生殖腺から始原生殖細胞を単離する方法を示しています。...

マウスES胚細胞の単離と導出

xenografting生殖細胞移植と精巣組織のためのプロトコルが記述されています。生殖細胞移植レシピエント精巣におけるドナー由来の精子形成の結果、精原幹細胞（SSCS）を同定するための機能の再構成アッセイを表しています。...

マウスでXenografting胚細胞移植と精巣組織

ここでは、マウス精子の凍結保存のための新開発のI•クライオキットを示しています。凍結融解精子を持つ二細胞期胚の開発は、このキットの使用で5マウス系統で一貫して改善された。...

I ·クライオキットを使用してマウスの精子の凍結保存と回復

彼らは多能性のための標準的なテストを通過した時、誘導多能性幹細胞（IPSC）ラインを生成することはあっても発生能の異なる行が生成されます。ここでは、所有している完全な多能性としてIPSC行を定義性IPSC、から完全に由来するマウスを作製するためのプロトコルを記述する...

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

この資料では、効率的に派生し、胚盤胞の段階でマウス胚からの多能性幹細胞株を培養するプロトコルについて説明します。...

マウス着床前胚幹細胞の誘導

ここで新しい機器を使用せずキメラを増産するためのプロトコルを提案する.胚の注入のための簡単な方向の変更は生産、胚の数を増やすし、潜在生殖するタイムラインを削減できます。...

トランス内部細胞のキメリズム率が高いため、胚性幹細胞の大量注入

ここでは、1細胞胚の凍結保存のための改変方法と、遺伝子組換えマウスの効率的な生成のための凍結解凍胚とエレクトロポレーションの使用を組み合わせたプロトコルを提示する。...

遺伝子組み換えマウスの高効率生産のための凍結解凍胚の使用

ここでは、胚性幹細胞を用いた遺伝子改変マウスモデル、特に大型DNAノックイン(KI)の開発のためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、CRISPR/Cas9ゲノム編集を使用して調整されているため、従来の相同組換えを介した直鎖状DNAターゲティング法と比較して、KI効率が大幅に向上します。...

CRISPR/Cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発

提示された子宮頸部操作方法は、精管切除された雄と雌を繁殖させる必要なしに、マウスにおいて偽妊娠を誘発することができる。偽妊娠の誘導は、非外科的胚移植および非外科的人工授精の成功に必要であり、どちらも提示されている。...

非外科的胚移植または人工授精の前に精管切除された雄を必要とせずに雌マウスに偽妊娠を誘導する

ここでは、マウスにラウンド精子細胞注入法(ROSI)を行う方法を紹介します。これは、臨床応用が期待され、胚発生のメカニズムを調べるための有用性を持つ技術です。...

マウスラウンド精子細胞注射

この論文は、原腸陥入マウス胚の単一細胞および核のシーケンシングのための高品質の単一細胞および核懸濁液のパイプラインを確立します。...

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

学ぶマウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞を精子代替として用い、半クローン胚を作製する方法。ゲノムインプリンティングの研究と生殖生物学への応用が可能となる。

マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

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