マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

このプロトコルは、半数体マウス胚性幹細胞のゲノムインプリンティングの変更を誤って日付付けし、私たちの被験者が偽の精子によるものであり、マウスの自家製胚の生成を可能にしています。配偶子の遺伝子組み換えには、一般的に難しい技術が必要です。この方法論を用いて、親配偶子をハイブリッド胚性幹細胞で操作し、その後の精子置換オプションとしてマウスに導入することができる。

この方法は、胚の父方の配偶子の人工的な特異的な改変を可能にするため、ゲノムインプリンティングと焼灼の研究に特に適用できます。この手順を実演するのは、私の研究室のマウス発生学者であるCharles Etienne Dumeauです。実験用のホールディングピペットとマイクロインジェクションピペットを準備するには、まずマイクロピペットプーラーを使用して、細長い形状と緩やかなテーパーを持つホウケイ酸ガラスキャピラリーを引っ張ります。

保持ピペットを準備するには、外径60〜100マイクロメートルの引っ張られたキャピラリーをマイクロフォージにマイクロフォージで配置し、フィラメントのガラスビーズの上に置きます。フィラメントのスイッチを入れ、キャピラリーがビーズに接触するまでキャピラリーを下げます。キャピラリーがビーズに付着したら、フィラメントのスイッチを切り、キャピラリーを引っ込めると、キャピラリーがまっすぐな端で壊れます。

次に、壊れたキャピラリーチップをフィラメントのガラスビーズの隣に水平に配置し、キャピラリーチップの内径が直径10〜20マイクロメートルに達するまでフィラメントを加熱して端を溶かします。次に、キャピラリーを先端から約1mmのガラスビーズの上に置き、フィラメントを加熱してキャピラリーを20度の角度に曲げます。マイクロインジェクションピペットを調製するには、加熱されたフィラメント上のガラスビーズの外径約6マイクロメートルの引き上げられたキャピラリーを配置し、ビーズに接触するまでキャピラリーを下げます。

キャピラリーが付着したら、フィラメントのスイッチを切り、キャピラリーを引っ込めます。キャピラリーはまっすぐな端で壊れます。次に、キャピラリーをキャピラリーの先端から約1mm離れたガラスビーズの上に移動し、フィラメントを加熱してキャピラリーを20度の角度に曲げます。

細胞質内注射を行うには、5マイクロリットル滴のPVP溶液と20マイクロリットル滴のM2培地を10センチメートル皿の逆さまの蓋に置き、滴を鉱物油で覆います。ディッシュをステージに置き、マイクロマニピュレーターに保持ピペットを取り付けます。マイクロローダーチップを使用してマイクロインジェクションピペットにフルオロカーボンオイルを充填し、ピペットをピエゾアクチュエーターに取り付けます。

顕微鏡で観察しながら、マイクロインジェクションピペットをPVP溶液の滴に下げます。ピペットを浸したら、ピペットを数回上下させて、ガラスをPVPでコーティングします。少量のPVP溶液をマイクロインジェクションピペットにロードします。

マイクロインジェクションピペットとホールディングピペットをM2培地に浸し、液滴の底にあるピペットに焦点を合わせます。約2マイクロリットルのダブルノックアウトパルソージェニックES細胞懸濁液をM2培地ドロップに移し、マウスピペットを使用して10個のM2卵子を同じドロップに移します。1つの卵子を回転させ、保持ピペットを介して負圧を加えて卵子を保持し、中期2プレートがマイクロインジェクションピペットの経路に配置されないように注意しながら、周辺スペースがマイクロインジェクションピペットに面するようにします。

マイクロインジェクションピペットの先端に1つのダブルノックアウトパルトジェニックES細胞を引き出し、細胞膜の破裂を確認します。マイクロインジェクションピペットに軽い負圧を加え、マイクロインジェクションピペットの先端をペリビテリン空間に向かって押しながら4つのピエゾインパルスを送達して、透明帯を突破します。マイクロインジェクションピペットで卵子を貫通して、オレマが反対側に伸びるようにし、1つのピエゾパルスを適用してオレマを貫通し、オレマがマイクロインジェクションピペットのシャフトに沿って弛緩することを確認します。

ダブルノックアウトパルトジェニックES細胞を最小限の培地で卵形質に注入し、マイクロインジェクションピペットを卵子からスムーズに引き抜きます。注入した卵子を保持ピペットから放出し、後で収集するためにマイクロドロップの側面に移動します。すべての卵子を注入したら、KSOM培地を含む予熱したセンターウェルディッシュに卵子を移し、ディッシュを摂氏37度、二酸化炭素5%で1時間インキュベートしてから活性化します。

この代表的なダブルノックアウトパルソージェニックES細胞株のDNA含量解析は、フローサイトメトリーによりCAG/EGFP導入遺伝子を担い、G0、G1、S、およびG2 M期における一倍体細胞および二倍体細胞の分布を示しています。ジェノタイピングは、H19および遺伝子間差次的メチル化領域に野生型対立遺伝子が存在しないことを確認するために実施できます。CAG/EGFP導入遺伝子をダブルノックアウト病原性ES細胞に導入し、顕微鏡下で緑色蛍光を可視化することにより、セミクローニング胚への寄与を研究することができます。

フローサイトメトリー解析では、デムカルセン処理後のG2 M期停止一倍体細胞および二倍体細胞に対応する2つの集団が示されています。1Nの半数体ピークがないことは、細胞の休息サイクルがほぼ完全であったことを示しています。注入後、構築されたセミクローニング胚でEGFP発現が検出されることはめった

ダブルノックアウトパルトジェニックES細胞の細胞質が卵母細胞の大きな細胞質に分散します。活性化後6時間で、最大3つの極性体を顕微鏡で観察できます。卵子の第1極性体と第2極性体、および一倍体ESCからの1つの疑似極性体。

その発生能力を実証するために、セミクローン胚を胚盤細胞の段階まで培養することができます。さらに、レシピエント雌の卵管に移植されたセミクローニングされた2細胞期の胚から、満期の雌マウスを得ることができる。マイクロインジェクションでは、卵子が活性化されたときの染色体分離を防ぐために、一倍体胚性幹細胞の原形質膜を破裂させることが重要です。

単為生殖一倍体ES細胞の代わりに、アンドロゲン一倍体ES細胞も使用できます。これにより、研究目的に応じて、母方または父方の配偶子を精子の代替として選択することができます。