CRISPR/Cas9 dpy-10 Co-CRISPRスクリーニングマーカーと組み立てられたリボヌクレオプロテイン複合体を用いたC.エレガンスrbm-3.2遺伝子の編集。

この技術は、CRISPR/Cas9ゲノム編集により、C.elegansに正確な変異を短期間で導入するのに有益です。この技術は、Co-CRISPRマーカーの使用により、陽性に編集された線虫を特定する確率が大幅に向上するため、C.elegansゲノムを編集するための効率的で合理化された方法を提供します。マイクロインジェクションの実行を練習し、できるだけ多くの寄生虫の生殖腺アームの両方を注入して、目的の編集を取得する可能性を高めてください。

この手順を実演するのは、私の研究室の学部生であるAmy Smith、Mary Bergwell、Danita Mathew、Ellie Smith、Carter Dierlamです。若年成虫の線虫を注射用に調製するには、L2、L3ステージのC.elegansをMYOBプレート上の新鮮な細菌の芝生に選び、プレートを摂氏20度で一晩インキュベートします。翌朝、表に示されているように、滅菌ヌクレアーゼフリーチューブに注射ミックスを調製し、ピペッティングで混合します。

注入液を摂氏37度で15分間インキュベートし、リボ核タンパク質複合体を組み立ててから、遠心分離により混合物をスピンダウンします。次に、解剖顕微鏡を使用して、子宮内の胚が10個未満の約30匹の若年成虫を選び、各線虫の両生殖腺腕に、腕ごとに数ピコリットルの注射混合物を注入します。マイクロインジェクション後、回収装置を使用して、注入パッドから注入したワームをOP50 E.coliを播種した60mmMYOBプレートにピペットで静かに口に入れます。.

注入した線虫を室温で1時間回復させます。回復期間の終わりに、プラチナワイヤーピックを使用して、注入された各線虫を単一の播種した35ミリメートルMYOB寒天プレートに移し、線虫が摂氏20度で卵を産むのを待ちます。24時間後、注入したワームを新しい個々の35ミリメートルプレートに移します。

注射後3〜4日間は、解剖顕微鏡を使用して、動物が円形に動くときに動物の体が長軸を中心に回転することで示されるように、ローラー表現型を示すF1子孫を持つプレートと、同じ発達段階の対照動物と比較して短くて丈夫な生理機能によって証明されるように、ダンプ表現型を持つプレートを特定します。50〜100匹のF1ローラーワームをそれぞれのプレートに移し、ワームが1〜2日間卵を産むのを待ちます。F2ワーム産生の1〜2日後、番号付きプレートから各F1ローラーマザーを、2.5マイクロリットルの溶解バッファーを含む対応する番号付きPCRチューブに移し、1:100希釈/ミリグラム/ミリリットルのプロテイナーゼK.チューブをマイナス30°Cで20分間凍結してから、サーモサイクラーでワームを溶解します。 示されているように。

サイクルの最後に、デオキシヌクレオシド三リン酸、DNAポリメラーゼ、塩化マグネシウム、およびローディング色素を含む12.5マイクロリットルの2X PCRミックス、10マイクロモルのフォワードプライマー1マイクロリットル、10マイクロモルのリバースプライマー1マイクロリットル、および反応混合物を溶解したワームサンプルごとに25マイクロリットルにするのに十分な滅菌水を追加します。次に、示されているようにサーモサイクラーでサンプルを実行します。長さが50塩基対未満の編集をスクリーニングするには、各PCR反応の10マイクロリットルを新しいチューブに移し、各チューブに5マイクロリットルの制限消化マスターミックスを追加します。

消化反応を摂氏37度で2時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、摂氏65度で10〜15分間のインキュベーションで消化物を加熱して活性化します。次に、各チューブからの反応全体を1%から2%アガロースゲルの1つのウェルにロードし、適切なバンド分離が達成されるまでゲルを110ミリアンペアで分析します。

ランの最後に、アガロースゲルをUV光で可視化し、DNAバンドサイズを検出します。陽性に編集された線虫は、修復テンプレートを使用して編集することにより、予想されるサイズでDNAの余分なバンドを表示し、線虫ゲノム内の目的の遺伝子座に制限部位を運びます。それぞれのポジティブに編集されたF1ローラーワームプレートから8〜12匹の野生型に見える非回転F2ワームを選び、ワームが卵を産み、1〜2日間子孫を産むようにします。

次に、ポジティブに編集されたワームで示されているようにホモ接合型ワームラインを同定し、シーケンス解析ソフトウェアを使用してシーケンシング結果を解析し、標準プロトコルに従って編集の存在を確認します。ここでは、ゲノムDNAと設計されたCRISPR RNAおよびC.elegans rbm-3.2遺伝子の修復テンプレートを観察できます。この代表的な解析では、73 個の F1 ワームのうち 7 個が編集に陽性であることがわかりました。

未編集の線虫は、EcoRI消化時に445塩基対の単一のDNA断片を示し、rbm-3.2遺伝子の早期終止コドンを持つ線虫は、EcoRI消化時に265塩基対と166塩基対の2つの断片を示しました。ヘテロ接合体編集線虫は、EcoRI消化時に3つの断片を示しました。同定された陽性のF1ヘテロ接合体由来の12匹のF2線虫のうち6匹が、対象編集に対してホモ接合体であることが判明した。

その後、同定されたホモ接合編集線虫系統のゲノムDNAを使用してDNAシーケンシング反応を調製し、ホモ接合状態での編集の存在を確認できました。編集試薬とスクリーニングプライマーが正しく設計されていること、および注入ミックスが適切に調製されていることに注意してください。また、正確なマイクロインジェクションも重要です。

この手順に続いて、編集の表現型検証(該当する場合)、およびゲノム編集の精度を検証するために遺伝子およびタンパク質発現分析を実施してもよい。