Name: マウスの後肢におけるレーザードップラー灌流イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: 学ぶレーザードップラー灌流イメージング法を用いてマウス後肢の皮膚微小循環を評価する手法。末梢動脈疾患や糖尿病における血流回復と創傷治癒メカニズムの解明に貢献し、切断リスク低減に役立つ。

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VAピューゲ・サウンド・ヘルスケア・センターでは、施設・資源を活用して行った作業です。この作品は著者のものであり、退役軍人省または米国政府の立場や方針を必ずしも反映しているわけではありません。唐博士は現在、VA(Merit 5 I01 BX004975-02)を通じて資金提供を受けています。

動物実験は、ワシントン大学の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。
1. スキャナーの準備
<ol><li>スキャン対象までの距離が約 30 cm になるように、スキャナーの高さを調整します。</li>
	<li>イメージャーの電源を入れ、関連するソフトウェアを起動します。</li>
	<li>測定プログラムを開きます。ソフトウェアがスキャナと正しく通信している場合は、赤外線レーザーの電源がオンの警告が表示されます。</li>
	<li>メーカーが提供する標準で機械を較正します(ビデオには表示されず、使用されているマシンの特定のモデルに依存します)。</li>
	<li>室内の背景素材と照明設定に適したスキャナー設定を調整します。<ol>
<li>製造元の指示に従ってゲインレベル DC FLUX と CONCを設定します(ビデオには表示されません)。</li>
		<li>黒の背景素材にレーザー光を向けて背景のしきい値を設定し 、Auto BK Setを押します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. マウスの事前スキャン準備
<ol><li>廃棄物ガスの適切な清掃でイソフルラン誘導室を設置します。 注:誘導室を加温パッドに置くと、麻酔誘導時のマウス温度低下を防ぐことができます。</li>
	<li>非反射面の下のスキャン領域に置かれたホーム温気ブランケット(この場合は黒いネオプレン生地)をオンにします。37 °Cの体温を維持するために、家庭の吸熱毛布をセットします。</li>
	<li>家庭用の毛布と潤滑剤の温度プローブを、挿入の準備ができているように置きます。</li>
	<li>麻酔マスクと清掃システムをスキャンエリアに設置します。</li>
	<li>イオブルラン気化器でマウスを麻酔します。酸素率を1 L/minの流量に設定し、麻酔誘導のためにイオブルランを4%に調整します。麻酔誘導室への流れをオンにすると、マウスの呼吸速度が遅くなります。マウスが右反射を失うと、適切な麻酔が得られます。</li>
	<li>マウスを取り付けた廃ガススカベンジャーを使用して麻酔マスク/ノーズコーンに移し、イソフルランを1.5%に調整します。 注:この麻酔レベルは、一般的にスキャン中にマウスを比較的静かに保つために十分ですが、麻酔の外科的レベルを提供することを意図していませんので、麻酔の深さはチェックされません。イソフルランレベルを変更すると、心拍、呼吸、真皮灌流の変化が生じ、時間経過実験全体およびすべての実験対象に対して一貫した割合を使用する必要があります。ケタミンキシラジンのIP注入などの代替麻酔技術も使用できますが、異なる麻酔薬が異なる皮膚灌流に影響を与えるのと同じ麻酔技術をコース研究を通して使用する必要があります。</li>
	<li>(スキャンエリアによりオプション)スキャン対象とする計画領域が毛皮で覆われている場合は、小さな電気トリマーまたは脱毛クリームを使用して、対象領域から髪を取り除きます。 注:脱毛クリームは完全に除去し、マウスの皮膚はスキャン前に乾燥する必要があります。</li>
	<li>ホーム温帯ブランケットを覆う黒色の非反射面にマウスを適切なスキャン位置に置き、両方の後肢が平衡およびスキャンを通じて熱源に残っていることを確認する(図1)。 注:温度の地域的な変動を防ぐために、家庭の吸熱毛布の上に両足を維持することが重要です。</li>
	<li>ホームソアミックブランケットに関連付けられた潤滑直腸温度プローブを挿入します。</li>
	<li>マウス温度を所望の走査温度(37°C)に平衡化します。約5〜10分。</li>
	<li>上部メニューまたは スキャナ設定アイコンからアクセスできる [スキャナのセットアップ] を選択します。対象領域に合わせて X-Y 座標を変更して、スキャン領域を調整します。スキャン速度は、スキャンの解像度に依存します。解像度が高いほど、スキャン時間が長くなります。解剖灌流に焦点を当てた高解像度とは対照的に、グローバル灌流に焦点を当てた反復スキャンでは、4 ms/pixelのスキャン速度が十分です。 注:研究者が開発中の副循環(皮膚に近い腹側の大腿とふくらはぎで最もよく画像化されている)を直接研究しようとしている場合は、より高い解像度と単一スキャンを考慮する必要があります。マウスフットパッドのエンドオルガンへのグローバルな灌流を評価する場合、低解像度/速度(例えば4 ms/pixel)での反復スキャンは十分です。ビデオに示されているソフトウェアは、再起動時にスキャン領域、速度、解像度のために以前に使用したテンプレートを自動的にロードするか、さまざまな対象領域がさまざまな実験に使用されている場合は保存されたファイルから取得することができます。</li>
	<li>繰り返しスキャンを実行する場合は、[ 繰り返しおよびライン スキャン ] タブを選択します。スキャンの数は、繰り返し間隔と同様に変更することができます(この場合は3スキャン)。繰り返し間隔の最小時間は、スキャン領域とスキャン解像度によって決定されるボックスの右側のグレー表示領域に表示される、推定スキャン時間になります。数秒を追加すると、ユーザーはスキャンの間に必要に応じてマウスを一時停止し、マウスの位置を変更できます。</li>
</ol>3. スキャン
<ol><li>[イメージ スキャン] タブを選択し、[マーク] ボタンを選択します。レーザーはスキャン領域の輪郭に移動します。スキャン対象のターゲットがマークされた領域内になるように、マウスの位置を調整します。 注: フットパッドまたはフットパッドおよびふくらはぎのスキャンでは、後肢を拡張して位置を決めやすい場合は、supine の位置よりも一貫した関心領域を提供します。大腿動脈と伏在動脈および副巻は、大腿部とふくらはぎの腹側表面に非常に近いので、これらの対象領域を使用する場合は、スピーヌ位置が好ましい。</li>
	<li>繰り返しスキャンアイコンを選択して測定を繰り返し開始し、再生ボタンを押してスキャンを開始します。</li>
	<li>ポップアップ ウィンドウでスキャン距離を確認し、[OK] をクリックしてスキャンを開始します。</li>
	<li>マウスの動きのスキャン中にマウスを監視します。スキャンの途中で、マウスが十分に移動して、スキャン領域にヒンドポーが存在しない場合は、スキャンを再開します。マウスのヒンドポー位置の小さな変化は、解析ソフトウェアに対応することができます。</li>
	<li>ホーム温気ブランケットを使用しても変動する可能性があるため、スキャンプロセス中にマウス温度を監視します。マウス温度にばらつきが多すぎる場合、スキャンの間に大きな変動が生じる可能性があります。一般的に、36.8~37.2 °Cの温度範囲は許容可能なデータとなります。</li>
	<li>キャプチャしたスキャンを [名前を付けて保存] ウィンドウの下に、マウス ID とタイムポイントを含むファイル名を付けて保存し、データ分析を容易にします。必要に応じて、マウスとタイムポイントの詳細を[件名の詳細]ウィンドウに入力します。</li>
	<li>イオフイオフ、直腸温度プローブを取り外します。</li>
	<li>直腸温度プローブを70%エタノールで消毒して、次のマウスで使用できます。</li>
	<li>マウスが麻酔から右反射を表示する時点まで回復できるように、ケージに戻す前に、直面する位置に、直面する可能性のある位置に反転させます。 注:回復は非常に迅速であるか、ケタミン/キシラジンのための暖かい回復ケージで、イゾフルランのための温暖化毛布のいずれかで行うことができます。</li>
</ol>4. LDPI データのキャプチャ (図 3)
<ol><li>イメージングレビューソフトウェアプログラムを開きます。</li>
	<li>ファイル メニューに移動し、開いて保存したファイルを見つけます。</li>
	<li>ツールバーから ROI アイコンを選択します。</li>
	<li>[ ポリゴンの追加] ボタンを選択します。</li>
	<li>マウスを使用して、コントロールの後肢の対象領域 (ROI) をトレースします。ポリゴン トレースは、計算された平均に灰色の背景が含まれないため、正確である必要はありません。</li>
	<li>手術後肢についてステップ4.3~4.5を繰り返します。</li>
	<li>[統計情報] アイコンを選択して、[イメージ ROI 統計結果 (PU)]ウィンドウを開きます。</li>
	<li>ポリゴン 1 (後肢コントロール) とポリゴン 2 (外科的後肢) の結果をコピー/貼り付けを使用してデータ収集ワークシートにエクスポートします。</li>
</ol>5. 分析
<ol><li>各スキャンの外科/制御比率としてデータをキャプチャします。</li>
	<li>その時点での特定のマウスのデータポイントの 3 つのスキャンすべてに平均された外科/制御を使用します。後肢虚血に対する応答の生物学的変動のために、一般に8〜10匹のマウスが〜10%標準誤差で再現可能な結果を達成するために、時間的に必要とされる。 注:マウスが麻酔から回復できるようにする前に、繰り返しスキャンの迅速な分析を実行して、データが可変すぎるかどうかを確認する価値があります(例えば、スキャン1-3の間で100〜150以上の灌流ユニットが異なります)。繰り返しスキャンの間に大きな変動は、マウスがスキャン中に完全に平衡化されないことを示唆しています (図 2)、データポイントを失うことなく繰り返しスキャンを実行できます。表示されるフラックス値のダイナミックレンジを最適化するためにカラーパレットを変更する方が、表示スキャンのバリエーションを改善するために必要な場合があります(図2)。</li>
</ol>

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</ol>

唐博士は開示する利益相反はありません。

LDPI を使用して信頼できる結果を得るには、一貫した手法が不可欠です。同じ麻酔薬、温度設定、マウス位置、関心領域は、全期間を通して使用する必要があります。異なる麻酔薬は、より高いまたは低い灌流値9をもたらす。イオブルラン麻酔は、その急速な発症と出現だけでなく、全体的な安全性のために便利です。イソフルランの一貫した割合は、この血管拡張剤が皮膚灌流を変える可能性のある麻酔の深さとして使用されるべきである。対象領域に毛皮が含まれる場合、化学的に脱毛したマウスは、ファーを電気バリカン7で除去したマウスよりも高い灌流値を有するので、毎回同じ脱毛方法を使用すべきである。マウスの温度は、36°Cのマウスが38°C7、12でマウスよりも有意に低い灌流値を有する、灌流イメージングに大きな影響を及ぼす。虚血性後肢はまた、コントロール後肢とは異なる地域温度変化に対して異なる反応をする可能性がある(図2)。...

不十分な創傷治癒を伴う皮膚潰瘍は、ヒト患者1における切断の主な原因である。十分な創傷治癒は、末梢動脈疾患2、3、4の患者において損なわれる無傷の皮膚を維持するために必要とされるより高いレベルの動脈灌流を必要とする。他のいくつかのリウマチの状態と糖尿病はまた、傷5、6を癒すために皮膚の微小循環を妨げ、不十分に導く可能性がある。多くの糖尿病患者は、付随する末梢動脈疾患を有し、切断のリスクが特に高い。レーザードップラー灌流イメージング(LDPI)は、臨床的な状況で皮膚の微小循環を評価するために用いられ、また、実験的後肢虚血、虚血再灌流、及び微小外科的フラップ7後の血流および血流回復を評価する研究状況において用いられる。
LDPIシステムは、関心のある領域の上を移動するためにスキャンミラーによって偏向される低電力レーザービームを投影します。これは、レーザドップラーフローメトリーとは異なり、フローメトリープローブ8と直接接触する組織の小領域に対する灌流測定を提供する。レーザービームがマイクロバスキュアチュア内の移動血液と相互作用すると、ドップラー周波数シフトが発生し、スキャナによって光検出され、任意の灌流ユニットに変換されます。LDPIは光ベースの技術であるため、浸透深度の点で0.3〜1mmに制限され、大部分の真皮灌流は7と評価される。皮膚の温度や交感神経系によって皮膚の血流が変化し、これは様々な麻酔薬9によって影響を受ける可能性がある。光学レーザーからの測定はまた、周囲の照明条件、皮膚色素沈着の影響を受け、毛皮または毛髪7を上に横にすることによってブロックすることができる。
LDPIは、非侵襲的であり、コントラスト投与を必要とせず、複数の動物のデータ収集を可能にする迅速なスキャン時間を有するため、虚血後の灌流回復を監視するための最も一般的に使用される研究技術である。これは、治療の動脈新生や血管新生を目的とした治療法が小さな動物モデルに有効であるかどうかを判断するのに理想的です。LDPIによって測定された後の後肢虚血後の血流回復は、マイクロフィル鋳造またはマイクロCT10、11などの他の手段によって評価された場合の副動脈の発達とよく相関する。このプロトコルの目的は、LDPIを用いた後肢灌流の評価を実証することです。

<table><tbody><tr><td>黒の無反射素材</td><td></td><td></td><td>生地店、会社推奨の黒のネオプレン</td></tr><tr><td>F/エアキャニスター</td><td>A.M. Bickford Inc</td><td>80120</td><td></td></tr><tr><td>ホメオサーミックブランケット、硬質金属プローブ付き</td><td>ハーバード装置</td><td></td><td>フレキシブルプローブも付属していますが、これは耐久性が低い</td></tr><tr><td>です イソフルラン麻酔器</td><td>Dranger</td><td></td><td>社 複数のメーカー</td></tr><tr><td>イソフルラン誘導チャンバー</td><td>VetEquip</td><td>941444</td><td>2 Lチャンバー</td></tr><tr><td>ムーアレーザードップラー灌流イメージャー</td><td>ムーアインスツルメンツ</td><td>MoorLDI2-IR</td><td>高解像度イメージャー (MoorLDI2-HIR)</td></tr><tr><td>マウス麻酔 ノーズコーン</td><td></td><td></td><td>複数のメーカー</td></tr><tr><td>Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸素タンク</td><td></td><td></td><td>複数のメーカー</td></tr><tr><td>Surgilube</td><td>複数のディストリビューター</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの後肢におけるレーザードップラー灌流イメージング

Laser Doppler Perfusion Imaging in the Mouse Hindlimb

血流回復は、実験的な後肢虚血または虚血再灌流後の重要な結果測定である。レーザードップラー灌流イメージング(LDPI)は、血流回復を評価するための一般的な、非侵襲的で反復可能な方法です。この技術は、レーザーが赤血球を動かすときに引き起こされる周波数のドップラーシフトからサンプリングされた組織の全体的な血流を計算する。測定は任意の灌流単位で表現されるため、脚に対して非介入された対側は、通常、測定を制御するために使用されます。測定深さは0.3-1 mmの範囲にある。後肢虚血に対して、これは真皮灌流が評価されることを意味する。皮膚灌流は、いくつかの要因に依存します - 最も重要な皮膚温度と麻酔薬は、信頼性の高い測定値を得るために慎重に制御する必要があります。さらに、毛髪や皮膚の色素沈着は、真皮に到達するか浸透するレーザーの能力を変更することができます。この資料では、マウスの後肢における LDPI の手法について説明します。

成功したLDPIは、3つのスキャン間で100〜150個以下の灌流ユニット変動(マウスフットパッドの通常の平均灌流の約10%に相当する)を持つ、一貫した反復測定スキャンをもたらすはずです(図2)。図2に示すように、反復スキャンは、マウスが適切に平衡化されていることを判断し、虚血/制御比が温度変動によって引き起こされる真皮灌流の変動とは対照的に、基礎となる血流を最もよく反映するようにするのに役立ちます。データポイントに対して単一のスキャンを使用すると、より実験的なマウスの必要性につながる変動性が高まります。後肢虚血に使用する場合、外科的後肢は、コントロール後肢と比較して世界的な灌流を減少させたはずである。結果は、外科的後肢灌流/制御後肢灌流の比率として表される。マウスが最初に血管化し、時間の経過とともに彼らの本質的な担保ネットワークを開発するにつれて、LDPIによる血流回復は術後の時間経過にわたって見られるべきです(図4)。回復の程度は、マウス株および後肢虚血モデ...

ここでは、マウス後肢の血流を測定するためのレーザードップラー灌流イメージングの技術と必要な制御を実証するプロトコルを提示する。

Blood flow recovery is a critical outcome measure after experimental hindlimb ischemia or ischemia-reperfusion. Laser Doppler perfusion imaging (LDPI) is ...

不十分な創傷治癒による皮膚潰瘍は、ヒト患者における切断の主な原因である。十分な創傷治癒は、末梢動脈疾患の患者で損なわれる無傷の皮膚を維持するために必要な動脈拡散のより高いレベルを必要とする。他のいくつかのリウマチ状態や糖尿病はまた、傷を癒すために皮膚の微小循環を妨げ、不十分に引き起こす可能性があります。多くの糖尿病患者は、付随する末梢動脈疾患を有し、切断のリスクが特に高い。レーザードップラー灌流画像またはLDPIは、臨床的な状況で皮膚の微小循環を評価するだけでなく、実験的な後肢虚血、虚血再灌流および微小外科的フラップ後の血流および血流回復を評価する研究状況で使用される。LDPIシステムは、対象領域の上を移動するためにスキャンミラーによって偏向される低出力レーザービームを投影します。これは、フローメトリープローブと直接接触する組織の小さな領域に対する灌流測定を提供するレーザードップラーフローメトリーとは異なります。レーザービームがマイクロバスキュアチャーの移動血液と相互作用すると、ドップラー周波数シフトが行われ、スキャナによって光検出され、任意の灌流ユニットに変換されます。LDPIは光ベースの技術であるため、浸透深度の点では0.3〜1ミリメートルに制限され、大部分の真皮灌流が評価されることを意味します。皮膚の温度と交感神経系によって皮膚の流れが変化し、様々な麻酔薬によって影響を受ける可能性があります。光学レーザーからの測定はまた周囲の照明条件、皮膚の色素沈着によって影響され、毛皮または毛の上に寝ることによってブロックすることができる。LDPIは、非侵襲的であり、コントラスト投与を必要とせず、複数の動物のデータ収集を可能にする迅速なスキャン時間を有するため、虚血後の拡散回復を監視するための最も一般的に使用される研究技術である。これは、治療の動脈新生や血管新生を目的とした治療法が小さな動物モデルに有効であるかどうかを判断するのに理想的です。LDPIによって測定された後の後肢虚血後の血流回復は、マイクロフィル鋳造またはマイクロCTなどの他の手段によって評価された場合の副動脈の発達とよく相関する。このプロトコルの目的は、LDPIを用いた後肢灌流の評価を実証することです。スキャン対象までの距離が約 30 センチメートルになるようにスキャナーの高さを調整します。イメージャーの電源を入れ、関連するソフトウェアを起動します。測定プログラムを開きます。ソフトウェアがスキャナと正しく通信している場合は、赤外線レーザー電源がオンの警告が表示されます。室内の背景素材と照明設定に適したスキャナー設定を調整します。黒い背景素材にレーザー光を向けて、背景のしきい値を設定し、Auto BK Set を押します。廃棄物ガスの適切な清掃でイソフルラン誘導室を設置します。誘導室を加温パッドに置くと、麻酔誘導時のマウス温度低下を防ぐことができます。非反射面の下のスキャン領域に置かれたホーム吸気毛布をオンにします。この場合、黒いネオプレン生地。家庭の吸熱毛布は摂氏37度の体温を維持するように設定されています。温度プローブと潤滑剤を挿入できるように配置します。麻酔用フェイスマスクと清掃システムをスキャンエリアにも設置します。イオブルラン気化器でマウスを麻酔します。酸素の速度は流れの分毎に1リットルに設定される。そして、イオブルランは麻酔誘導のために4%に調整される。麻酔誘導室への流れはオンになり、マウスの呼吸速度は遅くなります。マウスが右反射を失うと、適切な麻酔が得られます。マウスを取り付けられた廃ガススカベンジャーを使用して麻酔マスクノーズコーンに移し、イソフルランを1.5%に調整します。したがって、麻酔の深さはチェックされません。イオブルランレベルを変更すると、心拍数、呼吸、および真皮拡散の変化が生じてしまう。したがって、常時コースの実験とすべての実験科目に対して、一貫した割合を使用する必要があります。ケタミンキシラジンのIP注入などの代替麻酔技術も使用できますが、異なる麻酔薬が異なる皮膚拡散に影響を与えるのと同じ麻酔技術をコース研究を通して使用する必要があります。スキャン対象のプラン領域が毛皮で覆われている場合は、小さな電気トリマーや脱毛クリームを使用して、対象領域からヘアを除去します。脱毛クリームは完全に除去し、濡れた皮膚がレーザーからの反射を引き起こす可能性があるとしてマウスの皮膚を乾燥させる必要があります ホーム熱ブランケットに関連付けられている潤滑直腸温度プローブをマウス直腸に挿入します。マウス温度を平衡化して、温度を37°Cに設定します。これには最大 5 ~ 10 分かかります。上部メニューまたはスキャナ設定アイコンからアクセスできる[スキャナ設定]を選択します。スキャン領域は、対象領域に合わせて X、Y 座標を変更して調整する必要があります。スキャン速度は、スキャンの解像度に依存します。解像度が高いほど、スキャン時間が長くなります。反復スキャンでは、全球の拡散に焦点を当て、解剖灌流に焦点を当てた高分解能とは対照的に、ピクセル当たり4ミリ秒の最高スキャン速度で十分である。繰り返しスキャンを実行する場合は、[繰り返しおよびライン スキャン] タブを選択します。スキャンの数は変更できます。この場合、3回のスキャンと繰り返し間隔。繰り返し間隔の最小時間は、スキャン領域とスキャン解像度によって決定される、ボックスの右側のグレー表示領域に表示される推定スキャン時間です。数秒を追加すると、ユーザーはスキャンの間に必要に応じてマウスを一時停止し、マウスの位置を変更できます。この場合のスキャン時間の合計は 3 分 21 秒です。[イメージ スキャン] タブを選択し、[マーク] ボタンを選択します。これにより、レーザーがスキャン領域の輪郭を描きます。スキャン対象のターゲットがマークされた領域内になるように、マウスの位置を調整します。繰り返しスキャンアイコンを選択し、再生ボタンを押してスキャンを開始することで、測定を繰り返し開始します。スキャン距離を確認するポップアップウィンドウが表示されます。[OK] をクリックしてスキャンを開始します。後肢虚血の誘導前のマウスの最初のスキャンは、リアルタイムで示されている。2回目と3回目の繰り返しスキャンは、16倍の速度に加速されます。メインウィンドウには、ソフトウェアによって生成されたスキャンの結果が表示されます。右下の差し込みは、マウスのフットパッドをスキャンするレーザーを示しています。フットパッドまたはフットパッドおよび後頭のふくらはぎのスキャンのために、後肢を尾部に向かって伸ばした状態で位置を決めやすく、より一貫した位置合わせが得られます。大腿動脈、伏在動脈および副次表は、大腿部およびふくらはぎの腹側表面に非常に近い。したがって、これらの対象領域を使用する場合は、スピーニンポジショニングが好ましい。マウスの動きをスキャン中にマウスを監視します。マウスがスキャン中にスキャン領域に足パッドが表示されなくなるほど動く場合は、スキャンを再開します。マウスフットパッド位置の小さなバリエーションは、解析ソフトウェアに対応できます。また、ホームソアミックブランケットを使用しても変動する可能性があるため、スキャンプロセス中にマウス温度を監視します。マウス温度に過度な変動がある場合、スキャンの間に大きな変動が生じる可能性があります。一般に、36.8 ~ 37.2 の温度範囲は許容可能なデータになります。キャプチャしたスキャンを [名前を付けて保存] ウィンドウの下に、マウス識別子とタイム ポイントを含むファイル名を付けて保存し、データ分析を容易にします。必要に応じて、マウスとタイムポイントの詳細を[件名の詳細]ウィンドウに入力します。マウスを上肢の位置でスキャンした腹側後肢は、スキャン領域を調整した後にここに示される。マウスの上向きの提案は、足の側面の可変部分がスキャンされることになる点に注意してください。直腸温度プローブを取り外し、70%エタノールで消毒して、次のマウスの準備が整います。イソフルランを0%に減らす マウスは酸素を受け取り続けると速く回復しますが、酸素を補給せずに回復することもできます。マウスが麻酔から右反射を表示する時点まで回復できるように、ケージに戻す前に、直面する位置に、直面する可能性のある位置に反転させます。回復は非常に迅速であるかケタミンキシラジンの温かい回復ケージにあるので、イゾフルランのための暖かい毛布の上で行うことができます。イメージングレビューソフトウェアプログラムを開きます。スキャンを確認する新しいウィンドウが開きます。[ファイル] メニューの [開く] に移動し、保存したファイルを探します。ツールバーから ROI アイコンを選択します。[ポリゴンの追加] アイコンを選択します。マウスを使用して、対象領域の周囲をトレースします。完了したら、ツールバーに戻り、[統計] アイコンを選択します。これにより、対象地域の統計情報を表示するウィンドウが表示されます。データレビューでは、平均拡散単位(PU)では、各フットパッドの繰り返しスキャンで値が100~150個を超えるPUは変化しません。これは許容可能なスキャンであり、スキャン中にマウスが十分に平衡化されたことを示します。100 から 150 PU を超える変動を持つ平均 PU 値は、繰り返しスキャンを行う場合に、操作されていないマウス フットパッドの平均灌流の 10% を超える値に相当すると、マウスが十分に平衡化されておらず、繰り返しスキャンが強く推奨されることを示します。スキャンが完了した直後にクイック分析を実行すると、マウスの麻酔中に繰り返しスキャンを実行でき、スキャンが後日分析され、スキャンが繰り返しスキャンの間に有意な変動が生じた場合に発生する可能性のあるデータポイントを失うことを防ぐことができます。結果は、マウスが最初に血管化し、その次に固有の副次的な組み合せを開発するとして、制御後肢灌流に対する外科的後肢拡散の比率として表され、LDPIによる血流回復は術後の時間経過を通じて見るべきである。回復の程度は、マウス株および後肢虚血モデルの重症度に依存する。この図は、LDPIが大腿動脈結紮およびP27ノックアウトおよび野生型C57Bl/6マウスの後の時間の経過に関するフットパッド血流回復を測定するために使用された28日間にわたる完成したタイムコース実験を示している。野生型マウスのP27ノックアウトはいずれも、一般化マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である経口ドキシサイクリンで治療した場合の血流回復を損なっていたため、MMP活性が動脈新生を促進することを示唆した。ゲイン設定とバックグラウンドしきい値は、時間コースの実験全体で一定に保つ必要があります。背景のしきい値が低すぎると、バックグラウンド マテリアルをスキャンすると、拡散値が小さくなります。これにより、ポリゴン選択時に背景の拡散値が対象領域に平均化されます。この問題を解決するには、[全般] タブの [スキャナのセットアップ] ウィンドウで、バックグラウンドのしきい値を調整します。この場合、背景のしきい値を 118 の拡散単位に増やすと、どの解析にも含まれない灰色の背景になります。フラックス画像のパレットまたはカラースケールは、測定ソフトウェアと画像レビューソフトウェアの両方で調整できます。スケールの最大値を超えるすべての拡散値は、最大の拡散色として表示されます。この場合は、赤。たとえば、ダイナミック レンジを 0 から 1500 に変更すると、1000 ~ 1500 のプロフュージョン単位の間の領域が赤で表示されるのではなく、色のグラデーションを使用して表示されるようになったので、繰り返しスキャンのバリエーションが目にわかりやすくなります。ここで示すスキャンは、繰り返しスキャンの開始時にコア体温が最初に36.8を下回ったマウスで得られ、繰り返しスキャンを繰り返すと増加した。なお、対照フットパッド平均拡散は虚血性フットパッドよりも寒いコア体温によってより影響を受けた。より涼しい体温を1回スキャンすると、このデータポイントに対して高い拡散比が記録される。C57Bl/6マウスで見られるようなマウス皮膚色素沈着の変動は、スキャン領域が背景閾値を下回ることになり、色素領域を含む対象領域の分析が困難になる可能性がある。マウスのフットパッドは、一般的には色素沈着が多く、このマウス株をスキャンするのに最も便利な領域です。研究者が腹側後肢を研究したい場合は、白いマウス株を選択する必要があります。LDPIは、全体的な動脈灌流の反射として後肢真皮拡散を測定するための効果的で、容易に行われ、反復可能な方法である。LDPI を使用して信頼性の高いデータを取得する場合は、一貫した手法が必要です。

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マウスの後肢におけるレーザードップラー灌流イメージング

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