マウスの後肢におけるレーザードップラー灌流イメージング

不十分な創傷治癒による皮膚潰瘍は、ヒト患者における切断の主な原因である。十分な創傷治癒は、末梢動脈疾患の患者で損なわれる無傷の皮膚を維持するために必要な動脈拡散のより高いレベルを必要とする。他のいくつかのリウマチ状態や糖尿病はまた、傷を癒すために皮膚の微小循環を妨げ、不十分に引き起こす可能性があります。

多くの糖尿病患者は、付随する末梢動脈疾患を有し、切断のリスクが特に高い。レーザードップラー灌流画像またはLDPIは、臨床的な状況で皮膚の微小循環を評価するだけでなく、実験的な後肢虚血、虚血再灌流および微小外科的フラップ後の血流および血流回復を評価する研究状況で使用される。LDPIシステムは、対象領域の上を移動するためにスキャンミラーによって偏向される低出力レーザービームを投影します。

これは、フローメトリープローブと直接接触する組織の小さな領域に対する灌流測定を提供するレーザードップラーフローメトリーとは異なります。レーザービームがマイクロバスキュアチャーの移動血液と相互作用すると、ドップラー周波数シフトが行われ、スキャナによって光検出され、任意の灌流ユニットに変換されます。LDPIは光ベースの技術であるため、浸透深度の点では0.3〜1ミリメートルに制限され、大部分の真皮灌流が評価されることを意味します。

皮膚の温度と交感神経系によって皮膚の流れが変化し、様々な麻酔薬によって影響を受ける可能性があります。光学レーザーからの測定はまた周囲の照明条件、皮膚の色素沈着によって影響され、毛皮または毛の上に寝ることによってブロックすることができる。LDPIは、非侵襲的であり、コントラスト投与を必要とせず、複数の動物のデータ収集を可能にする迅速なスキャン時間を有するため、虚血後の拡散回復を監視するための最も一般的に使用される研究技術である。

これは、治療の動脈新生や血管新生を目的とした治療法が小さな動物モデルに有効であるかどうかを判断するのに理想的です。LDPIによって測定された後の後肢虚血後の血流回復は、マイクロフィル鋳造またはマイクロCTなどの他の手段によって評価された場合の副動脈の発達とよく相関する。このプロトコルの目的は、LDPIを用いた後肢灌流の評価を実証することです。スキャン対象までの距離が約 30 センチメートルになるようにスキャナーの高さを調整します。

イメージャーの電源を入れ、関連するソフトウェアを起動します。測定プログラムを開きます。ソフトウェアがスキャナと正しく通信している場合は、赤外線レーザー電源がオンの警告が表示されます。

室内の背景素材と照明設定に適したスキャナー設定を調整します。黒い背景素材にレーザー光を向けて、背景のしきい値を設定し、Auto BK Set を押します。廃棄物ガスの適切な清掃でイソフルラン誘導室を設置します。

誘導室を加温パッドに置くと、麻酔誘導時のマウス温度低下を防ぐことができます。非反射面の下のスキャン領域に置かれたホーム吸気毛布をオンにします。この場合、黒いネオプレン生地。

家庭の吸熱毛布は摂氏37度の体温を維持するように設定されています。温度プローブと潤滑剤を挿入できるように配置します。麻酔用フェイスマスクと清掃システムをスキャンエリアにも設置します。

イオブルラン気化器でマウスを麻酔します。酸素の速度は流れの分毎に1リットルに設定される。そして、イオブルランは麻酔誘導のために4%に調整される。

麻酔誘導室への流れはオンになり、マウスの呼吸速度は遅くなります。マウスが右反射を失うと、適切な麻酔が得られます。マウスを取り付けられた廃ガススカベンジャーを使用して麻酔マスクノーズコーンに移し、イソフルランを1.5%に調整します。

したがって、麻酔の深さはチェックされません。イオブルランレベルを変更すると、心拍数、呼吸、および真皮拡散の変化が生じてしまう。したがって、常時コースの実験とすべての実験科目に対して、一貫した割合を使用する必要があります。

ケタミンキシラジンのIP注入などの代替麻酔技術も使用できますが、異なる麻酔薬が異なる皮膚拡散に影響を与えるのと同じ麻酔技術をコース研究を通して使用する必要があります。スキャン対象のプラン領域が毛皮で覆われている場合は、小さな電気トリマーや脱毛クリームを使用して、対象領域からヘアを除去します。脱毛クリームは完全に除去し、濡れた皮膚がレーザーからの反射を引き起こす可能性があるとしてマウスの皮膚を乾燥させる必要があります ホーム熱ブランケットに関連付けられている潤滑直腸温度プローブをマウス直腸に挿入します。

マウス温度を平衡化して、温度を37°Cに設定します。これには最大 5 ~ 10 分かかります。上部メニューまたはスキャナ設定アイコンからアクセスできる[スキャナ設定]を選択します。

スキャン領域は、対象領域に合わせて X、Y 座標を変更して調整する必要があります。スキャン速度は、スキャンの解像度に依存します。解像度が高いほど、スキャン時間が長くなります。

反復スキャンでは、全球の拡散に焦点を当て、解剖灌流に焦点を当てた高分解能とは対照的に、ピクセル当たり4ミリ秒の最高スキャン速度で十分である。繰り返しスキャンを実行する場合は、[繰り返しおよびライン スキャン] タブを選択します。スキャンの数は変更できます。

この場合、3回のスキャンと繰り返し間隔。繰り返し間隔の最小時間は、スキャン領域とスキャン解像度によって決定される、ボックスの右側のグレー表示領域に表示される推定スキャン時間です。数秒を追加すると、ユーザーはスキャンの間に必要に応じてマウスを一時停止し、マウスの位置を変更できます。

この場合のスキャン時間の合計は 3 分 21 秒です。[イメージ スキャン] タブを選択し、[マーク] ボタンを選択します。これにより、レーザーがスキャン領域の輪郭を描きます。

スキャン対象のターゲットがマークされた領域内になるように、マウスの位置を調整します。繰り返しスキャンアイコンを選択し、再生ボタンを押してスキャンを開始することで、測定を繰り返し開始します。スキャン距離を確認するポップアップウィンドウが表示されます。

[OK] をクリックしてスキャンを開始します。後肢虚血の誘導前のマウスの最初のスキャンは、リアルタイムで示されている。2回目と3回目の繰り返しスキャンは、16倍の速度に加速されます。

メインウィンドウには、ソフトウェアによって生成されたスキャンの結果が表示されます。右下の差し込みは、マウスのフットパッドをスキャンするレーザーを示しています。フットパッドまたはフットパッドおよび後頭のふくらはぎのスキャンのために、後肢を尾部に向かって伸ばした状態で位置を決めやすく、より一貫した位置合わせが得られます。

大腿動脈、伏在動脈および副次表は、大腿部およびふくらはぎの腹側表面に非常に近い。したがって、これらの対象領域を使用する場合は、スピーニンポジショニングが好ましい。マウスの動きをスキャン中にマウスを監視します。

マウスがスキャン中にスキャン領域に足パッドが表示されなくなるほど動く場合は、スキャンを再開します。マウスフットパッド位置の小さなバリエーションは、解析ソフトウェアに対応できます。また、ホームソアミックブランケットを使用しても変動する可能性があるため、スキャンプロセス中にマウス温度を監視します。

マウス温度に過度な変動がある場合、スキャンの間に大きな変動が生じる可能性があります。一般に、36.8 ~ 37.2 の温度範囲は許容可能なデータになります。キャプチャしたスキャンを [名前を付けて保存] ウィンドウの下に、マウス識別子とタイム ポイントを含むファイル名を付けて保存し、データ分析を容易にします。

必要に応じて、マウスとタイムポイントの詳細を[件名の詳細]ウィンドウに入力します。マウスを上肢の位置でスキャンした腹側後肢は、スキャン領域を調整した後にここに示される。マウスの上向きの提案は、足の側面の可変部分がスキャンされることになる点に注意してください。

直腸温度プローブを取り外し、70%エタノールで消毒して、次のマウスの準備が整います。イソフルランを0%に減らす マウスは酸素を受け取り続けると速く回復しますが、酸素を補給せずに回復することもできます。マウスが麻酔から右反射を表示する時点まで回復できるように、ケージに戻す前に、直面する位置に、直面する可能性のある位置に反転させます。

回復は非常に迅速であるかケタミンキシラジンの温かい回復ケージにあるので、イゾフルランのための暖かい毛布の上で行うことができます。イメージングレビューソフトウェアプログラムを開きます。スキャンを確認する新しいウィンドウが開きます。

[ファイル] メニューの [開く] に移動し、保存したファイルを探します。ツールバーから ROI アイコンを選択します。[ポリゴンの追加] アイコンを選択します。

マウスを使用して、対象領域の周囲をトレースします。完了したら、ツールバーに戻り、[統計] アイコンを選択します。これにより、対象地域の統計情報を表示するウィンドウが表示されます。

データレビューでは、平均拡散単位(PU)では、各フットパッドの繰り返しスキャンで値が100~150個を超えるPUは変化しません。これは許容可能なスキャンであり、スキャン中にマウスが十分に平衡化されたことを示します。100 から 150 PU を超える変動を持つ平均 PU 値は、繰り返しスキャンを行う場合に、操作されていないマウス フットパッドの平均灌流の 10% を超える値に相当すると、マウスが十分に平衡化されておらず、繰り返しスキャンが強く推奨されることを示します。

スキャンが完了した直後にクイック分析を実行すると、マウスの麻酔中に繰り返しスキャンを実行でき、スキャンが後日分析され、スキャンが繰り返しスキャンの間に有意な変動が生じた場合に発生する可能性のあるデータポイントを失うことを防ぐことができます。結果は、マウスが最初に血管化し、その次に固有の副次的な組み合せを開発するとして、制御後肢灌流に対する外科的後肢拡散の比率として表され、LDPIによる血流回復は術後の時間経過を通じて見るべきである。回復の程度は、マウス株および後肢虚血モデルの重症度に依存する。

この図は、LDPIが大腿動脈結紮およびP27ノックアウトおよび野生型C57Bl/6マウスの後の時間の経過に関するフットパッド血流回復を測定するために使用された28日間にわたる完成したタイムコース実験を示している。野生型マウスのP27ノックアウトはいずれも、一般化マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤である経口ドキシサイクリンで治療した場合の血流回復を損なっていたため、MMP活性が動脈新生を促進することを示唆した。ゲイン設定とバックグラウンドしきい値は、時間コースの実験全体で一定に保つ必要があります。

背景のしきい値が低すぎると、バックグラウンド マテリアルをスキャンすると、拡散値が小さくなります。これにより、ポリゴン選択時に背景の拡散値が対象領域に平均化されます。この問題を解決するには、[全般] タブの [スキャナのセットアップ] ウィンドウで、バックグラウンドのしきい値を調整します。

この場合、背景のしきい値を 118 の拡散単位に増やすと、どの解析にも含まれない灰色の背景になります。フラックス画像のパレットまたはカラースケールは、測定ソフトウェアと画像レビューソフトウェアの両方で調整できます。スケールの最大値を超えるすべての拡散値は、最大の拡散色として表示されます。

この場合は、赤。たとえば、ダイナミック レンジを 0 から 1500 に変更すると、1000 ~ 1500 のプロフュージョン単位の間の領域が赤で表示されるのではなく、色のグラデーションを使用して表示されるようになったので、繰り返しスキャンのバリエーションが目にわかりやすくなります。ここで示すスキャンは、繰り返しスキャンの開始時にコア体温が最初に36.8を下回ったマウスで得られ、繰り返しスキャンを繰り返すと増加した。

なお、対照フットパッド平均拡散は虚血性フットパッドよりも寒いコア体温によってより影響を受けた。より涼しい体温を1回スキャンすると、このデータポイントに対して高い拡散比が記録される。C57Bl/6マウスで見られるようなマウス皮膚色素沈着の変動は、スキャン領域が背景閾値を下回ることになり、色素領域を含む対象領域の分析が困難になる可能性がある。

マウスのフットパッドは、一般的には色素沈着が多く、このマウス株をスキャンするのに最も便利な領域です。研究者が腹側後肢を研究したい場合は、白いマウス株を選択する必要があります。LDPIは、全体的な動脈灌流の反射として後肢真皮拡散を測定するための効果的で、容易に行われ、反復可能な方法である。

LDPI を使用して信頼性の高いデータを取得する場合は、一貫した手法が必要です。