Name: 相互接続ニューロンのミクロン規模組織のための磁気プラットフォームの作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学ぶ 磁気ナノ粒子を用いたニューロン様細胞のマイクロンパターン配置法。PC12細胞のネットワーク形成を制御し、神経科学とバイオエンジニアリングの研究に応用する非毒性プラットフォーム技術です。

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この研究は、イスラエル科学技術省とイスラエル科学財団(569/16)によって支援されました。

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

代表的な結果は、ミクロンスケールでのニューロンネットワーク形成を制御および組織するための提示された方法論の有効性を示す。MNP搭載PC12細胞は生存可能なままで、FM電極から特定の部位への磁力によって引き付けられた磁気感受性ユニットに変換された。これは、セルが細い線ではなく六角形の大きな頂点に優先的に接着した図5Cで最もよく示されています。また、細胞の分岐も磁気パターンに従って良好に発達した。すべての制御実験は、磁気力が細胞体の局在化と成長を指示したことを明確に示した。地形的な手掛かりが神経突起の伸び40、41を導くために使用できることが実証されたが、これは、MpMpを持たない細胞がパターンの形状に反応を示さなかったので、ここではそうではない。
ボトムアップアプローチを採用して、多くの研究施設で利用可能な標準的なフォトリソグラフィとスパッタリング堆積物を使用して、局所的な磁力を設計し、多くの研究者によるこれ...

ニューロンの微細パターン化は、組織再生1、2、3、4、5および神経電子デバイス6、7、8の開発に大きな可能性を秘めている。しかし、生体組織と同様に、高い空間分解能におけるニューロンのミクロンスケール位置付けは、重大な課題を提起する。このスケールで事前に設計された構造を形成するには、相馬運動性および軸索の成長を局所的に制御することによって神経細胞プロセスの指導が必要である。これまでの研究では、神経細胞の成長を導く化学および物理的手掛かり9、10、11、12の使用が示唆されている。ここでは、磁場勾配13、14、15、16、17による細胞位置制御に焦点を当てた新しいアプローチで、MNPを搭載した細胞を磁気感受性ユニットに変え、遠隔操作することができる。
Kunzeらは、磁気チップおよびMNP負荷細胞を用いて細胞応答を誘導するために必要な力を特徴づけたが、細胞内の機械的緊張によって初期軸索伸長が引き起こされ得ることを証明した。Tay et al. は、高められた磁場勾配を有するマイクロ加工基材が、カルシウム指標染料19を用いてMNPを添加した神経回路の無線刺激を可能にすることを確認した。さらに、Tsengら.は細胞内に合体したナノ粒子を合体し、細胞張張20に近づく局在したナノ粒子媒介力を生じる。これは、機械的な力に対する細胞応答を研究するのに役立つマイクロ磁気基質の定義されたパターンの製造につながった。局在したナノ粒子媒介力の適用から生じる細胞張力は、細胞20内のナノ粒子を合体させることによって達成された。相補的な金属酸化物半導体(CMOS)-マイクロ流体ハイブリッドシステムは、CMOSチップにマイクロ電磁石の配列を埋め込み、磁気ビーズ21でタグ付けされた個々の細胞の動きを制御するLeeらによって開発された。
Alonら. 細胞22を見つけるためにマイクロスケール、事前にプログラムされた磁気パッドを磁気「ホットスポット」として使用した。また、マイクロパターン化された磁気アレイを用いて細胞内で特異的活性を刺激し、特定の細胞内位置23でナノ粒子を局地化することもできる。細胞MNPの取り込みが、リーチ、ラット、およびマウスの一次ニューロン24、25、26で実証された。ここで、これはラットPC12褐色細胞株で実証されており、これは以前にMp27の高い取り込み量を示すことを報告されている。近年、がん治療における薬物送達や熱療法など、28,29,30,31の様々な医療用途が行われている。具体的には、研究は、Mpとニューロンネットワーク32、33、34、35のアプリケーションを扱う。しかし、単一細胞レベルでMPを使用するニューロンの磁気組織は、さらなる調査に値する。
この研究では、ボトムアップアプローチが、神経の配置を制御するための事前に設計されたプラットフォームを介して局所的な磁力を設計するために記述されている。FM多層のミクロンスケールパターンの製作が発表されました。このユニークなFM多層構造は、安定した垂直磁化を生み出し、すべての磁気パターンに対する効果的な吸引力をもたらします。インキュベーションを介して、MPはPC12細胞にロードされ、磁気感受性ユニットに変換された。MNPに装填された細胞は、磁気プラットフォームの上にメッキされ、分化され、磁気パターンに優先的に結合され、神経突起の成長はパターン形状とよく一致し、指向性ネットワークを形成した。FM多層およびMNPsの磁気特性を特徴づけるためのいくつかの方法が説明されており、細胞MNP取り込みおよび細胞生存アッセイの技術も提示されている。さらに、神経成長の形態測定パラメータと結果の統計的分析が詳細に示されます。

<table><tbody><tr><td>16% パラホルムアルデヒド(ホルムアルデヒド)水溶液</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>FALCON 353846</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B溶液</td><td>バイオロジカルインダストリー</td>ズ <td>03-028-1B</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1514H フォトレジスト</td><td>マイクロケミカルズ</td><td></td><td></td>GmbH</tr><tr><td>AZ 351 B developer</td><td>MicroChemicals GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Biological Industries</td><td>03-010-1B</td><td></td></tr><tr><td>細胞および組織培養フラスコ</td><td>Biofil</td><td>TCF002250</td><td>75.0 cm^2 250 mL ベントキャップ、未処理</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627-160</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>Cell Proliferation Kit (XTTベース)</td><td>生物産業</td><td>20-300-1000</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>Biofil</td><td>CFT021500</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Co80Fe20 at% スパッタターゲット</td><td>ACI 合金</td><td></td><td>99.95%</td></tr><tr><td>コラーゲン I 型</td><td>Corning Inc.</td><td>354236</td><td>ラットテール、濃度範囲 3-4 mg/mL</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>TCS SP5</td></tr><tr><td>Cy2標識 AffiniPure Donkey 抗ウサギ二次抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て針</td><td>KDL</td><td></td><td>23 G</td></tr><tr><td>使い捨て&nbsp; シリンジ</td><td>Medispo</td><td>1160227640</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>ドナー 馬血清</td><td>生物産業</td><td>04-124-1A</td><td></td></tr><tr><td>ELISA リーダー</td><td>Merk Millipore</td><td></td><td>BioTek シナジー 4 ハイブリッドマイクロプレートリーダー</td></tr><tr><td>エタノール 70%</td><td>ROMICAL LTD</td><td>19-009102-80</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアブソリュート (脱水)</td><td>バイオラボ化学品</td><td>52505</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>バイオロジカルインダストリーズ</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>新鮮なマウス &beta;-NGF</td><td>Peprotech</td><td>450-34</td><td></td></tr><tr><td>GMW Cフレーム電磁石 .</td><td>Buckley systems LTD</td><td></td><td>3470、45 mm</td></tr><tr><td>塩酸32%</td><td>DAEJUNG CHEMICAL &METALS</td><td>4170-4100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>米国国立衛生研究所、Bethesda</td><td></td><td>NeuronJプラグイン</td></tr><tr><td>誘導結合プラズマ(ICP)</td><td>Ametek Spectro</td><td></td><td>SPECTRO ARCOS ICP-OES、FHX22 MultiViewプラズマ</td></tr><tr><td>ケースレーソース測定</td><td>ケース</td><td>レー2400</td><td></td></tr><tr><td>ケースレースイッチングシステム</td><td>ケース</td><td>レー3700</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>生物産業</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>DMIL LED</td></tr><tr><td>マスクレスフォトリソグラフィー</td><td>ハイデルベルク研究所</td><td></td><td>MLA150</td></tr>顕微鏡<tr><td>スライド</td><td>BAR-NAOR</td><td>BN1042000C</td><td></td></tr><tr><td>硝酸70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>正常ロバ血清(NDS)</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>hylabs</td><td>BP507 / 1LD</td><td></td></tr><tr><td>PC12細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Pdスパッタターゲット</td><td>ACI合金</td><td></td><td>99.95%</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシンナイスタチン溶液</td><td>生物産業</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue細胞生存率試薬</td><td>分子プローブ</td><td>A-13261</td><td>resazurinベースの</td></tr><tr><td>ウサギ抗体 &α;-tubulin</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RFマグネトロンスパッタリング装置</td><td>Orion AJA Int.</td><td></td><td>オリオン8</td></tr><tr><td>RPMI 1640とl-グルタミン</td><td>生物産業</td><td>01-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>超音波浴</td><td>KUDOS</td><td>SK3210HP</td><td>周波数:53kHz。超音波パワー:135 W</td></tr><tr><td>SQUID磁力計</td><td>Quantum Design, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>CHEM-IMPEX INTERNATIONAL</td><td>1279</td><td>non-ionic surfactant</td></tr><tr><td>XTT cell viability reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

相互接続ニューロンのミクロン規模組織のための磁気プラットフォームの作製

Fabrication of Magnetic Platforms for Micron-Scale Organization of Interconnected Neurons

神経細胞を組織化されたニューラルネットワークに導く能力は、再生医療、組織工学、バイオインターフェースに大きな影響を与えます。多くの研究は、化学と地形の手がかりを使用してニューロンを指示することを目的としています。しかし、大規模な地域に対するミクロン規模の組織管理の報告はほとんどありません。ここでは、マイクロパターン化された磁気要素を埋め込んだ磁気プラットフォームを用いて、ニューロンをプリセット部位に配置し、ニューロンの成長をミクロンスケールの解像度で誘導するための効果的な方法が説明されている。磁気ナノ粒子(MpPs)を用いたニューロンの負荷は、磁気勾配の影響を受ける可能性のある敏感な磁気単位に変換することが実証されています。このアプローチに続いて、一般的なニューロンのようなモデルであるPC12細胞がメッキされ、超常磁性ナノ粒子がロードされた独自の磁気プラットフォームが製造されました。磁気パターンに対する有効な吸引力を与えるために、安定した垂直磁化を有する強磁性(FM)多層の薄膜を堆積させた。これらのMNP搭載PC12細胞は、磁気プラットフォームの上にメッキされ、分化され、磁気パターンに優先的に付着し、神経突起伸長はパターン形状とよく一致し、指向性ネットワークを形成した。磁気特性の定量的特性評価方法、細胞MNP取り込み、細胞生存率、および結果の統計的分析が提示される。このアプローチは、ニューラルネットワーク形成の制御を可能にし、磁力の操作を通じてニューロンと電極の界面を改善し、ネットワークのインビトロ研究に有効なツールとなり、新しい治療バイオインターフェーシングの方向性を提供する可能性がある。

異なる幾何学的形状を持つ磁気プラットフォームが製造された(図1A)。磁気パターンはスパッタリングによって堆積した:Co80Fe20およびPdの14の多層、0.2nmおよび1nm、それぞれ。電子顕微鏡は、磁気パターンの全高が〜18nmであることを明らかにした(図1B)。このユニークなFM多層堆積は、MNPにロードされたセルを全体の磁気パターンに対して引き付け、エッジ22、37だけでなく、基板面に対して垂直磁化異方性(PMA)を有する安定したプラットフォームを作成する。FM多層構造のパラメータは、FM多層の架橋装置を製作した磁気輸送測定(図1Cインセット)を特徴とし、基板に垂直な磁化を異常ホール効果(AHE)38を介して測定し、AHE抵抗は...

この研究は、神経組織の制御のための局所的な磁力のエンジニアリングへのボトムアップアプローチを提示する。磁気ナノ粒子(MpPs)を搭載したニューロン様細胞は、垂直磁化を有するマイクロパターンプラットフォームによってプレート化され、制御される。また、磁気特性評価、MNP細胞取り込み、細胞生存率、および統計解析も記載されています。

The ability to direct neurons into organized neural networks has great implications for regenerative medicine, tissue engineering, and bio-interfacing. ...

我々のアプローチは、磁気操作を用いてニューラルネットワーク形成を制御することを可能にする。これは、ネットワークのインビトロ研究のための効果的なツールであり、バイオインターフェーシングデバイスのための新しい治療方向を提供しています。この技術により、ミクロンスケールで細胞の位置と成長の両方を制御することができ、磁気パターンの柔軟な設計、ネットワーク組織を可能にします。効率的で非毒性の磁気ナノ粒子の滅菌は非常に重要です。成功するためには、適切な磁性ナノ粒子が必要です。重要な特徴は、サイズ、コーティング、および状況磁化値です。手順のデモンストレーションは、私の研究室のマスター学生であるロイト・プレンとダフナ・レベンバーグです。まず、スクリバーペンを使用してガラススライドを2センチメートルに切ります。アセトンでガラススライドをクリーニングし、超音波浴でそれぞれ5分間イソプロパノールを清掃します。その後、超高純度窒素でそれらを乾燥させます。6,000 RPMのスピンコーティングを使用してガラスを60秒間コーティングし、厚さ1.5マイクロメートルを達成し、摂氏100度を60秒間焼きます。フォトマスクまたはマスクレスリソグラフィを使用してサンプルを光源に公開し、目的のパターンを実現します。メーカーの指示に従って蒸留水で希釈した現像液でサンプルを40秒間開発します。その後、45秒間水で洗浄し、UHP窒素ガスで乾燥させます。光学顕微鏡でパターンを検査します。蒸着システムのロードロックチャンバーにサンプルを挿入し、ベース圧力を待ちます。サンプルをメインチャンバに移し、堆積のために適切な高さにサンプルをセットします。目的のレートが達成されるまで、各ターゲットの電力を増やします。回転をオンにし、強磁性多層を堆積させ、コバルト、鉄、パラジウムのターゲットを交互に、それぞれターゲットシャッターを開閉します。コバルト鉄パラジウムの14の二重層を堆積させ、追加のパラジウムキャッピング層で仕上げ。堆積が完了したら、堆積システムからサンプルをアンロードします。試料をアセトンに30分間浸し、イソプロパノールですすます。その後、UHP窒素でそれを乾燥させ、顕微鏡の下でそれを調べます。使用するまで清潔で乾燥した環境に保管してください。強磁性多層を堆積させた幅100マイクロメートルの十字形の磁気棒を備えたガラススライドを使用してください。両面テープを使用してサンプルをホルダーに取り付けます。ワイヤーボンダーを使用して、クロス電極の各脚に1本の4本のワイヤをサンプルに接着します。サンプルに対して磁場が垂直になるように、輸送測定システム内のサンプルホルダーとサンプルを磁場で設定します。テキスト原稿に記載されているように、横電圧測定を行います。磁場を掃引し、横電圧を磁場の関数として測定します。横方向抵抗を磁場の関数としてプロットし、フィルム内の垂直磁化に比例する異常なホール信号を求めます。テキスト原稿に記載されているように、PC12細胞培養のための基本的な増殖培地及び分化培地を調製する。10ミリリットルの塩基性増殖培地を用いた非処理培養フラスコで細胞を増殖させ、2~3日ごとに10ミリリットルの培地を添加する。8日後に細胞をサブ培養する。細胞の取り込みのために、細胞懸濁液を200Gと室温で8分間遠心分離し、次に上清を捨てる。新鮮な塩基性増殖培地の3ミリリットルで細胞を再懸濁.再び細胞を5分間遠心分離し、上清を捨て、新鮮な分化培地の3ミリリットルで細胞を再懸濁する。注射器と針を使って細胞を10回吸引し、細胞クラスターを分解し、ヘモサイトータを使用して細胞を数え、通常のコーティングされていない35ミリメートル皿に100万個の細胞を播種する。MNP懸濁液と分化培地の計算量を皿に加えて、所望のMNP濃度を達成する。細胞、MNP、分化培地を混合し、24時間摂氏37度で5%炭酸ガス加湿インキュベーターで皿をインキュベートします。70%エタノールでパターン化された基材を洗浄し、フード内の35ミリメートルの培養皿に入れます。パターン化された基板の下に大きな磁石を1分間置き、皿を上下に動かしてマグネットをフードから取り出して取り外します。紫外線を15分間点灯します。コラーゲン被覆ガラス基材を調製するために、コラーゲンタイプ1を30%エタノール中の1~50比で希釈する。ガラスを溶液で覆います。すべての溶液が蒸発するまで4時間フードに皿を覆い、滅菌PBSで3回洗います。インキュベーターから細胞を取り出し、200Gで5分間細胞懸濁液を遠心分離し、上清を捨てる。新鮮な分化培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁し、ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。シード10を35ミリメートル培養皿の中の基質の上の5つの細胞に、分化培地を2ミリリットル加えた。5%炭酸ガス加湿インキュベーターで37°Cで培養をインキュベートします。24時間後、100個から100個の新鮮なマウスβ-NGFを細胞に加える。分化培地を更新し、2日ごとに新鮮なβ-NGFを追加します。光顕微鏡を用いて2日毎に細胞を画像化し、ネットワーク形成後に細胞上で免疫染色を行う。異なる幾何学的形状を有する磁気プラットフォームを作製し、蛍光酸化鉄MPを核化によって合成した。MNPsの磁気測定では、磁化曲線にヒステリシスがなく、低飽和磁場であり、磁化飽和度が比較的高いということが示されています。PC12細胞を酸化鉄蛍光剤と混合した培地でインキュベートし、磁性ユニットに変換した。MpPsは細胞のソーマに内在したが、核内には内部化されなかった。細胞内の鉄濃度は培地中のMNP濃度の増加に伴って増加した。異なる濃度のMNPsに対するMNP搭載PC12細胞の生存率を、ショール解析を用いてMNP負荷細胞の形態学的パラメータを比較することにより評価し、対照細胞との差を示さなかった。XTTおよびResazurinベースのアッセイは、MNPsの評価された濃度が細胞に対して有意な細胞毒性を示さなかったことを確認した。MNP処理の有無にかかわらずPC12細胞を成長させ、磁気基質上で分化した。磁化された細胞は磁気パターンに付着し、パターンに従って枝を成長させることが判明し、MNP治療を受けていない細胞は磁気デバイスに親和性を持たずに成長した。六角形の幾何学を有する基質上の細胞の位置をここに示す。MNP装填された細胞体の75%が磁気ストライプに接触していたのに対し、磁化されていない細胞の35%だけが縞に位置していた。細胞の位置決め効果に加えて、これらの磁気プラットフォームは成長する神経突起の方向性を制御することを発見した。神経細胞の成長方向に対する磁気効果を評価するために、神経突起と磁気ストライプの間の角度を測定し、磁気ストライプの配向と有意な相関を示した。この手順は、磁性ナノ粒子に結合した後、薬物のような活性化合物を導くために容易に適応される。高スループットの薬物スクリーニングアッセイまたは組織内の局所治療に翻訳することができる。この新しいアプローチは、磁気的な魅力的な構造を追加することにより、他の基質やデバイスを機能化するための新しい可能性を開きます。現在、生体適合性ニューロンチップインターフェースの改良を進めています。

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