Name: 全染色体、テロメア、遺伝子座を明らかにするためのDNAハロー調製物での蛍光In situハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶ DNAハロー調製と蛍光in situハイブリダイゼーションを組み合わせた手法で、染色体領域とテロメア分布を可視化し、がんやプロゲリア細胞におけるゲノム構造の違いを解析する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

染色体アームペインティングプローブの親切な贈り物をしてくれたマイケルビットナー教授に感謝します。LGは、EUが資金提供するEURO-Laminopathiesプロジェクトとブルネル早老症研究基金の支援を受けました。

<ol><li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nuclear+protein+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li>
<li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li>
<li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li>
<li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Released+chromatin%3A+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li>
<li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li>
<li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li>
<li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+mapping+by+fiber-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li>
<li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+combing%3A+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li>
<li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li>
<li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface%2C+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475(2017).</li>
<li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li>
<li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+DNA+integrity+testing%3A+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Andrology%22%5BJournal%5D)">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li>
<li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively%2C+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li>
<li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR%3A+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li>
<li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li>
<li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+More+Hidden+behind+a+%27Classic+Proliferation+Marker%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%2C+expressing+a+novel+SUN1+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li>
<li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li>
<li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li>
<li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMPdb%3A+Database+of+nuclear+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li>
<li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li>
<li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li>
<li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+glossary%3A+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li>
<li>Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Human+Interphase+Chromosomes%22">Human Interphase Chromosomes</a>. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).</li>
<li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30(2012).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

DNAハロー法は、核酸骨格とゲノムの間の相互作用を分析する際に選択する優れた方法ですが、遵守しなければならないいくつかの重要なステップもあります。最も重要なパラメータの1つは、細胞播種密度の最適化です。細胞がオーバーコンフルエントになると、DNAハローが隣接する細胞と重なり合い、分析を実行できなくなります。CSKおよび抽出バッファーは、生物学的活性を維持するために、調製プロセスの最後にスペルミン、スペルミジン、およびジギトニンを抽出バッファーに追加して、使用日に常に新鮮にする必要があります。Halo-FISHを行う場合、DNAハローの正しい変性温度を使用して、プローブまたはペイントがその後ハイブリダイズできるようにすることが非常に重要です。
電子顕微鏡法は核マトリックスを視覚化するために使用されており、糸状構造が同定されています20。しかし、クロマチンとのマトリックス会合は容易に推測できないため、電子顕微鏡法は限られている。実際、DNA Halo法は、特定の遺伝子、染色体、細胞の状態をすべて調べることができるため、電子顕微鏡と比較してより用途が広いです。さらに、核マトリックスタンパク質のプロテオーム解析が研究されている21,22。この方法は、特に罹患細胞を比較する場合に核マトリックス成分を比較するのに適していますが、標準的なDNA Halo技術で強調されている空間分布と付着は提供されません。
DNA Haloアッセイには限界があります。まず、マトリックスが抽出されるため、これは固定された細胞に対してのみ実行できるため、ライブイメージングは不可能です。DNA Halo法は比較的迅速かつ簡単に実行できますが、細胞培養、プローブ生成、Halo-FISH、および分析をすべて考慮すると、プロセス全体に時間がかかる場合があります。
超解像顕微鏡を使用したDNA HalosおよびHALO-FISHの画像キャプチャは、DNA特異的プローブおよび抗体の分解能を大幅に向上させることができます。さらに、蛍光色素はより簡単にスペクトル分解できるため、1回の実験で多数のDNAプローブを使用して、さらに多くの情報を提供できる可能性があります。染色体コンフォメーションキャプチャ(3C)などの分子生物学的手法の改良は、遺伝子座の相互作用を決定し、細胞内のクロマチン上の空間構成を分析するために使用されてきました。DNAハローアッセイと3Cを組み合わせることができ、M3C23として知られる用語であり、DNAハロー技術の適応性を再び実証しています。
ここで提示される元のデータは、ゲノム挙動調査の可能性とそれらのデータの提示方法を示すためのものです。これらのデータにより、(1)染色体塗装プローブを使用してゲノム付着の有意差を決定できることが実証され、この研究では、18番染色体が分析されたものの中で最も付着していない染色体であることが明らかになりました(図3)。(2)2つの遺伝子座の間に有意差を有する遺伝子座(図4)(3)テロメアは、増殖細胞および老化細胞(図5)と比較して静止細胞においてあまり強く付着しない。不溶性タンパク質であるKi67抗原の存在により、増殖細胞と非増殖細胞を区別することができ、残留核に残るか、ヌクレオチドの取り込みを使用して特定の期間内にS期を通過した細胞を強調表示します(図2)。この技術により、核骨格が損なわれている細胞、すなわちラミノパシー細胞におけるゲノム挙動を分析することもでき、こことBikkul et al., 2018では、対照細胞と比較してゲノムがあまり緊密に付着せず、古典的なHGPS細胞におけるラミンA変異の影響を改善する特定の薬剤で治療すると回復できることを明らかにしました15.しかし、ここでは、ラミンA変異を欠いているが、13番染色体があまり強固に付着していないLINC複合体タンパク質SUN119 の異常な形態を含む非定型HGPS AGO8466細胞の新しいデータを示します(図6)。
HALO-FISHは、核酸骨格とのゲノム相互作用の研究と間接免疫蛍光法を組み合わせて、抽出手順から除去されないタンパク質を分離できるユニークな方法です。核骨格は、特定の癌タイプ19や、診断バイオマーカーとしてのいくつかの核骨格関連タンパク質の重要性など、さまざまな疾患で修飾されることが実証されています24,25。したがって、この技術は、疾患15、24、25、27におけるクロマチン組織化/解体に対する核骨格の影響を調べる上で重要な役割を果たし、ヒト細胞に限定されず、他の動物からの染色体塗装プローブでは、同じDNA-ハロープロトコルを採用することができます28。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

「核マトリックス」は、1974年にベレズニーとコフィーによって最初に記述されました1。ラットの肝臓核に対して高塩モル濃度の抽出とヌクレアーゼ処理を行った後、彼らはタンパク質性の構造フレームワークを特定しました。DNAハロー手順は、その後この方法から適応され、核マトリックス(NM)およびNM関連タンパク質および染色体のみが存続するように可溶性タンパク質の除去を含む。DNA結合領域はDNAループの基部に位置し、マトリックス結合領域(MAR)または足場付着領域(SAR)と呼ばれ、それぞれ高塩濃度およびイオン性界面活性剤リチウム-3,5-ジヨードサリチル酸リチウム(LIS)による抽出に耐性があります。DNAハローでは、MAR/SARに関連するDNAが残留核内に結合しているのに対し、DNAループはこれらの部位から離れてDNAハローを形成します。現在、ゲノムはラミナ関連ドメイン(LAD)を介して核ラミナに、核小体関連領域(NAD)を介して、そしておそらく特定の核体などの他の核構造を介して固定されていることがわかっています。
DNAハロー法は、クロマチンからヒストンが剥がされ、DNAが引き伸ばされるため、拡張されたDNAとクロマチンがより高い分解能を提供するため、DNA、遺伝子、および染色体領域の物理的マッピングに使用できます2,3,4,5,6。ただし、このアプリケーションにDNAハローを使用する場合は、いくつかの制限があります。例えば、DNAハローの残留核と密接に関連するDNAは、プローブにアクセスできないため、分析や物理的マッピングから除外される可能性があります6。ファイバーフィッシュ2,4,5,7や分子コーミング8などの他の技術も物理マッピングを可能にし、比較的迅速かつ簡単に実行できるという利点があります。どちらも、DNAハローよりも遺伝子のDNAマッピングに優先的に使用されます。これらの方法は、核からの溶媒または塩抽出を使用してクロマチン繊維を抽出しますが、分子コーミングは再現性が高い傾向があります8,9。
核骨格が、DNAの付着部位、クロマチンリモデリング、DNA転写、DNA修復、DNA複製などの重要な核プロセスをサポートする役割を担っているという証拠が増えています11,12。このように、DNAハロー技術は、これらの細胞活動中の核骨格とゲノムの間の相互作用を調べるために開発され、研究で日常的に使用され、報告されてきました。この技術は、疾患の進行に関連するゲノムと核酸骨格の間の相互作用を調査するためにも使用されており、核構造の悪性腫瘍関連の変化が同定されています11。
DNAハロー法は、発生および分化中のゲノムと核酸骨格の関係を調べるためにも使用されています12。多くの研究では、FISH14 と組み合わせた場合、ハロスペルム13またはSpermHalo-FISHとして知られるDNAハロー技術のバリエーションが使用されています。精子クロマチンはプロタミンとして知られるタンパク質にしっかりと結合しており、この技術は精子DNAへのアクセスを改善するために開発されました。ハロスペルマは、精子DNAの完全性を調査し、DNA損傷が存在するかどうかを判断するために使用されています。DNA損傷が少ない精子はDNAハローサイズが大きいと相関しますが、断片化して損傷したDNAのレベルが高い精子は、ハローが小さいか、まったくありませんでした。したがって、ハロスペルマは、胚の質と体外受精13による妊娠の成功の潜在的な予後マーカーとして使用できます。この例は、この技術の潜在的な臨床応用を強調しています。私たちの研究では、HALO-FISHを使用して、早期老化疾患であるハッチンソン-ギルフォード早老症症候群(HGPS)15におけるゲノム挙動の変化と特定の薬物治療の効果を評価しました。
これらおよび他の研究を組み合わせることで、DNAハロー技術が技術の研究と有用性に使用できるプロセス/アプリケーションの幅広さが強調されています。

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>10388739</td><td>DNAハローの作成に使用</td></tr><tr><td>5-ブロモ-2&プライム;-デオキシ-ウリジン&nbsp;&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-100MG</td><td>標識ヌクレオチド</td></tr><tr><td>5-フルオロ-2&プライム;-デオキシウリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>標識ヌクレオチド</td></tr><tr><td>寒天 テクニカル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15562141</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A939-50G</td><td>DOP-PCRとニックトランスレーションの製品サイズを確認</td></tr><tr><td>非定型タイプ2 HGPS線維芽細胞 (AG08466)</td><td>Coriell Institute</td><td>AG08466</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16269751</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr><tr><td>ビオチン-16-dUTP</td><td>ロシュ・ダイアグノスティックス&nbsp;</td><td>11093711103</td><td>標識ヌクレオチド</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr><tr><td>古典的ハッチンソン・ギルフォード早老症症候群(HGPS)線維芽細胞(AG06297)&nbsp;</td><td>Coriell Institute</td><td>AG0297</td><td>Cell line</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12608596</td> スライド5枚<td>またはスライド8枚を連続して保持</td></tr><tr><td>Cot-1 DNA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>15279011</td> HALO FISH DEPC処理水<td>での非特異的ハイブリダイゼーションをブロック</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr><tr><td>デキストラン硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4030</td><td>ハイブリダイゼーション混合物</td></tr><tr><td>Gigatonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>抽出バッファーの成分</td></tr><tr><td>Digoxigenin-11-dUTP&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11093088910</td><td>標識ヌクレオチド</td></tr><tr><td>ロバ 抗マウス Cy3</td><td>ジャクソン研究所</td><td>715-165-150</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>抽出バッファーの成分</td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td> 抽出<td>バッファーの成分</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>443611</td><td>プローブ沈殿物とハローフィッシュ</td></tr><tr><td>ウシ胎児システム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>26140079</td><td>細胞培養血清</td></tr><tr><td>ホルムア</td><td>ミド サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10523525</td><td>DNAハローの2D FISH</td></tr><tr><td>グラスウール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18421</td><td>スピンカラム</td></tr><tr><td>ニシン精子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7290</td><td>プローブ沈殿</td></tr><tr><td>HXP&trade;ランプ(メタルハライド顕微鏡ランプ)</td><td>オスラム</td><td>HXP-R120W45C VIS</td><td>DNAハローの画像キャプチャ</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10313680</td><td>顕微鏡スライドのクリーニング</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCRキット</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2103</td><td>PCRキット</td></tr><tr><td>ライカDM4000蛍光顕微鏡とDFC365 FXカメラとLAS AF(バージョン:4.5.0)画像取得ソフトウェア。</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td></td><td>DNAハローの画像キャプチャ</td></tr><tr><td>Luria-Bertani寒天&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13274843</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>CSKバッファーの成分</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10284580</td><td>顕微鏡スライドの洗浄と滅菌</td></tr><tr><td>マウス抗BrdU抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>B2531-100UL</td><td>BrdUの視覚化</td></tr><tr><td>新生仔牛血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>16010159</td><td>細胞培養 血清およびブロッキング試薬</td></tr><tr><td>Nick トランスレーションキット</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR グレード水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>BAC クローンの PCR および DNA 単離</td></tr><tr><td>PCR プライマー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1851</td><td>CSK および抽出バッファー</td></tr><tr>の成分<td>酢酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr><tr><td>QuadriPERM&reg; 4 X 12</td><td>SARSTEDT</td><td>94.6077.307</td><td>正方形の細胞培養皿、ポリステレン、4つのコンパートメントがあります。&nbsp;これは疎水性の表面を持ち、無菌で、非発熱性/エンドトキシンフィーで、非細胞毒性です。</td></tr><tr><td>ウサギ抗Ki67抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1007-25UL</td><td>増殖マーカー</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr><tr><td>ゴムセメント</td><td>ハルフォード101836</td><td></td><td>DNAハローの2D FISH</td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6022-25G</td><td>スピンカラム</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>プローブの降水量</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>CSK、抽出、SSCバッファーの成分</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td>SSCバッファーの成分</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム&nbsp;</td><td></td><td>L3771-100G</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>抽出バッファーの成分</td></tr><tr><td>スペルミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4264</td><td>抽出バッファーの成分</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-Cy3&nbsp;</td><td>アマシャムライフサイエンス株式会社、科学研究所は</td><td>pa43001</td><td>プローブ抗体</td></tr><tr><td>スクロース</td>シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>S0389CSK</td><td>バッファーのコンポーネント</td></tr><tr>ス<td>クロース</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S0389CSK</td><td>バッファー+ A66:D68</td></tr>スーパー<tr><td>フロスト&トレード;顕微鏡スライドサー</td><td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12372098</td><td>顕微鏡スライド:厚さ1ミリメートル、長さ76ミリメートル、幅26ミリメートル。コーティングされていません。</td></tr><tr><td>豚反ウサギTRITC&nbsp;</td><td>ダコ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TELO-PNAフィッシュキット</td><td>アジレント ダコ</td><td>K532511-8</td><td>テロメアの描写</td></tr><tr><td>トリス-HCl</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>T3253-100G</td><td>カラムバッファー</td></tr><tr><td>トリトン&トレード;X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>CSKバッファートリ</td></tr><tr><td>プトン</td>の成分 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10158962 BAC</td><td>クローンのDNA単離</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416- 100ML</td><td></td></tr><tr><td>DAPIを含む洗剤 Vectashield封入剤</td><td></td><td>H-1200</td><td>DNAハローの2D FISH</td></tr><tr><td>全ヒト染色体プローブ</td><td>Calbiochem</td><td></td><td>DNAハロー酵母</td></tr><tr><td>抽出物</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10108202</td><td>BACクローンのDNA単離</td></tr>の2D FISH</tbody></table>

全染色体、テロメア、遺伝子座を明らかにするためのdnaハロー調製物での蛍光in situハイブリダイゼーション

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

ゲノムは、その活性を調節し、特定の場所に固定するために、細胞核内のいくつかの構造に関連付けられています。これらの構造は総称して核骨格として知られており、核薄層、核小体、および核体が含まれます。ゲノムとその組織を研究するために、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)の多くの変異体が存在しますが、これらは分解能によって制限されることが多く、ゲノムと核構造との関連に関する情報が不十分です。DNAハロー法は、高塩濃度と非イオン性界面活性剤を使用して、ゲノム内の付着領域を介して核内の構造に固定されたままのDNAループを生成します。ここでは、ヒストン、脂質、核マトリックスに強固に結合していないDNAなどの可溶性核タンパク質が抽出されます。これにより、内部核構造と抽出耐性タンパク質に密接に関連するDNAを含む残留核の周りに、結合していないDNAのハローが形成されます。これらの拡張されたDNA鎖は、分解能の向上を可能にし、物理的なマッピングを容易にすることができます。FISHと組み合わせることで、この方法には、ゲノムが固定されているすべての構造とのゲノム相互作用を研究するという追加の利点があります。HALO-FISHと呼ばれるこの技術は非常に用途が広く、DNAハローを核酸プローブと組み合わせて、遺伝子座、全染色体、アルファサテライト、テロメア、さらにはRNAを明らかにすることができます。この技術は、正常細胞および癌などの疾患進行における核組織化および機能に関する洞察を提供する。

このDNAハロー調製法は、若きも若きの細胞内だけでなく、核骨格タンパク質が異常な早期老化疾患に由来する細胞においても、ゲノム挙動の違いを明らかにする試みに役立っています15。 図1 は、残存核の端、残留核内に残っているDNA、および周囲にスプールアウトしてDNAハローを作成している未付着DNAを見ることができるDNAハローの例を示しています。また、残留核の取得方法を示す分析と、NEおよびCTE測定も示しています。細胞がS期にある場合にBrdUなどの標識ヌクレオチドを組み込むか、またはG1細胞において核小体およびヘテロクロマチンの領域を明らかにする診断増殖マーカーanti-pKi67を採用することによって、増殖細胞と非増殖細胞を区別することができる17、18。コンフルエントを達成せずに高血清中で増殖した初代細胞、すなわち増殖マーカーに対して陰性である初代細胞は、老化性であると仮定される。低血清中で増殖した初代細胞、またはコンフルエントになった、すなわち、増殖マーカーに対して陰性である接触阻害細胞は静止しているとみなされ、正しい栄養素および状況が与えられれば増殖性細胞周期に再入することができるであろう。Ki67陽性細胞と陰性細胞を区別することができるようになったことで、増殖、静止、老化のヒト皮膚線維芽細胞の違いを決定することができました。 図2 は、非増殖細胞では起こらないメカニズムであるDNA複製中にBrdUが取り込まれた細胞から作製し、その後抗BrdU抗体で染色した増殖型ヒト皮膚線維芽細胞のDNAハローを示しています。増殖マーカー抗pKi67抗体による染色も 図2に見ることができます。これは堅牢な抗原であり、FISHプロトコルを存続するため、FISH後およびプレマウントのために染色することができます。従って、左側の列にはBrdUおよびanti-pKi67(赤色)に対して増殖細胞が陽性(赤色)であり、右側の列には実際に 図2 の老化細胞が表示されている。緑色の信号は、テロメアPNAフィッシュ/ FITCキットで明らかにされた個々のテロメアです。免疫蛍光法とDNAハローを組み合わせることで、増殖細胞、静止細胞、老化細胞を調査する際に 図2 に示すように、さまざまな細胞状態での分析が可能になります。選択した抗体に応じて、分化、放射線照射によるDNA損傷など、他の条件を調べることができます。
染色体領域は、FISHを使用してDNAハロー内で視覚化することもできます。核からのDNAのスプールを可能にする準備のために、染色体領域の形状は、残留核内のゲノムの固定とその構造に応じて、DNAハローに見られる染色体の量を少量または多くして乱す可能性があります。 図3 は、染色体1、13、17、および18の特定の腕全体の染色体塗装プローブ(赤)で個々の染色体が明らかにされたDNAハローのパネルを明らかにしています。抗pKi67(緑色)は、増殖細胞および同じ培養物内でのその不在を、同じスライド上で、老化細胞を示すために使用されています。CTE / NEとして提示された画像とデータから、小さな遺伝子欠損染色体18は、付着がほとんどなく、残留核から離れたDNAハローにさらにスプールし、他の染色体よりも残留核の中心からかなり離れている染色体であることが非常に明白です。しかし、これは1番染色体にも当てはまります。増殖マーカーanti-pKi67を用いて、老化細胞と、同じ培養物内、同じスライド上で増殖を比較することも可能であり、この分析により、これら2つの非常に異なる細胞状態内の染色体は、残留核構造との付着に関して互いに有意差がないことを明らかにしました。
興味深いことに、遺伝子はまた、残留核内に留まるか、DNA Haloに位置することに関して、増殖細胞と老化細胞の間に統計的に有意な違いを示しています。図4は、赤色の標識BACプローブと緑色の抗Ki67によって描かれた遺伝子座でこれを示しています。DNA Halo調製後、増殖細胞と老化細胞における遺伝子位置の間に有意差はない。しかし、DNAハロー内には、サイクリンD1 CNDD1遺伝子座よりもカテニンα1 CTNNA1遺伝子座が有意に多く存在し、非常に少ない。図5は、テロメアを含むDNAハロー調製物を緑色で示しています。バックグラウンドは、DNAハロー内でテロメア信号を視覚化できるように、意図的に高く残されています。この一連のデータには、静止細胞、すなわち、7日間血清飢餓状態にされた細胞が含まれており、興味深いことに、静止細胞のDNAハロー内には、増殖細胞および老化細胞よりも、付着しておらず、DNAハロー内にあるテロメアが有意に多い。図5aでは、DNAハロー中のテロメアの割合が、特に画像「実験2」について観察することができる。これは、DNAハローにおけるテロメアの平均パーセンテージが静止細胞において約17%である図5bに対応する。老化細胞のすべてのテロメアが、おそらく非常に短いため、見ることができるわけではないといういくつかの証拠があります。
このDNAハローの方法は、罹患細胞の核内のゲノム相互作用の変化を調べることに成功しています15。 図6 は、原発性対照線維芽細胞における染色体結合の違い、および典型的な(ラミンA変異)および非定型のハッチンソン・ギルフォード早老症症候群を有する罹患細胞における、異なるSUN1アイソフォームおよびラミンA変異を発現しないことを示している19。染色体1と13は、対照DNAハローと比較した場合、残留核内の付着に統計的に有意な違いを示しています。 図6b は、染色体領域全体の位置を残留核およびDNA Haloと相関させる。1以下の値は染色体が残留核内にあることを示し、1を超える値は染色体またはDNAハロー内の染色体の一部を示します。
全体として、これは、細胞周期に影響を与えるさまざまな条件(増殖、静止、老化)または早老症や癌細胞株などの疾患細胞内での染色体全体、特定の遺伝子、テロメアのゲノム相互作用を調査する上でのHALO-FISHの有用性を強調しています。実際、これらの状態間の相互作用の違いは、核骨格が核内の重要なプロセスを調節する上で重要な役割を果たしていることを意味します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> 図1: HDF抽出核の残留核とDNAハロー、および分析方法の概要を表示。(a)DNAハローアッセイで調製し、DAPIで対比染色したHDF核。明るく染色された残留核は、核骨格に固定されたDNAを示しており、これはDNAのハローを形成する非付着DNAに囲まれています。倍率= x 100;スケールバー10μm。 (b)青色チャネルは、DAPI染色された核と周囲のDNAをキャプチャします。残留核は、ImageJを使用して選択および除去されます。矢印は、核中心から残留核端(NE)までの距離を表しています。(c)赤チャンネルはプローブ信号を示しています。(d)「結果」と表示されている画像は、青チャンネル画像に赤チャンネルを重ね合わせた結果です。これにより、核中心から最も遠い染色体領域縁(CTE)までの距離が可能になります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> 図2: 増殖および老化したHDFに対するテロメアPNA FISHによるDNAハロー調製。DNAハローアッセイに供されたHDF上のテロメアPNA FISH。テロメアシグナルは緑色(FITC)で可視化され、残留DNAとハローDNAはDAPI(青色)を使用して対比染色され、増殖核は赤色の間接免疫蛍光法(TRITC)を介して抗BrdUまたは抗pKi67抗体のいずれかを使用して検出されました。倍率= x 100;スケールバー10μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> 図3: DNAハローアッセイを用いた核酸骨格-染色体相互作用と解析。(a)染色体1、13、15、17および18に特異的なプローブを有する2D-FISHを、DNAハロー調製に供したHDFに対して行った。染色体全体を赤(Cy3)で塗り、核をpKi67で調べて、増殖しているか老化しているかを判断しました。増殖細胞(pKi67+)は緑色(FITC)で描かれたが、老化細胞は染色されず(pKi67-)、すなわち緑色のシグナルは検出されなかった。倍率= x 100;スケールバー10μm。 (b)HALO-FISHを受けた増殖および老化HDFにおける核骨格による染色体固定。測定は、増殖細胞(pKi67+)および老化細胞(pKi67-)における染色体1、13、15、17および18番染色体のそれぞれの核縁(NE)に対する最も遠い染色体領域縁(CTE)の比率を示す。エラーバーはSEM±を表す。 (c)pKi67+およびpKi67-核における特定の染色体のそれぞれの核縁(NE)に対する染色体領域縁(CTE)の修正箱ひげ図表現。Q1 =下の四分位数。最小値 = 記録された最小値。Med = 中央値;最大値 = 記録された最大値。Q3 =上四分位数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> 図4: HALO-FISHを用いたHDFにおける遺伝子特異的相互作用。(a)DNAハロー抽出核を遺伝子特異的プローブ(CCND1 および CTNNA1)でプローブし、増殖細胞および老化細胞上のNMへの固定を調べた。遺伝子シグナルは赤色(Cy3)で示され、抗pKi67は増殖細胞を表し、シグナルは緑色(FITC)で視覚化されます。増殖するCCND1画像では、残留核は白い円で囲まれ、白と緑の円の間のスペースはDNAハローを表しています。倍率= x 100;スケールバー10μm。 (b) CCND1 と CTNNA1 の遺伝子特異的シグナルを、残留核とDNAハローの間、および増殖細胞と老化細胞の間で比較します。エラーバー±SEMを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> 図5: テロメアPNA-FISHでプローブした静止HDFのDNAハローアッセイ。(a)HDFの休止は、低血清培地での7日間の培養によって誘導されました。DNAハローアッセイを実施し、PNA-FISHはFITCシグナル(緑)によるテロメアの可視化を可能にし、残留核と周囲のDNAハローをDAPI(青)で対比染色しました。細胞はまた、核が非増殖であることを確認するために抗pKi67抗体で染色された。これは2つの別々の機会に繰り返されました。倍率= x 100;スケールバー10μm。 (b)増殖、老化および静止HDF細胞におけるDNAハロー内に局在するテロメアの平均割合の比較。エラーバー±SEMを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> 図6:HALO-FISH26を用いたHGPS細胞の核骨格への染色体全固定の検討。(a)コントロールHDF(2DD)、古典HGPS(AG06297)および非定型2型HGPS(AG08466)核は、DNAハロー調製を受け、次に染色体1、13、15および17の全染色体塗料を使用して2D-FISHを受けた。染色体全体は緑色(FITC)で描かれ、DNAはDAPI(青色)で対比染色されました。倍率= x 100;スケールバー10μm。 (b)抽出された核内の染色体の位置は、平均染色体領域縁(CTE)と核縁(NE)の比率を測定することによって決定されました。1を超える比率は、最も遠いCTEがDNAハロー内の対応するNEの外側にあることを示し、1未満の比率は、最も遠いCTEが残留核内のNE内にあることを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>成分</td>
			<td>容量(μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCRバッファー</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPミックス(なしTTP)(2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>dTTP(2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>ビオチン-16-dUTPまたはジゴキシゲニン-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>ドッププライマー(20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>タクDNオリメラーゼ(1U/μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCRグレード水用</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>テンプレート</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>表1:1x反応のDOP-PCR成分と容量を示す表
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>歩</td>
			<td>サイクル</td>
			<td>温度(摂氏)</td>
			<td>時間</td>
		</tr><tr><td>初期変性</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 ミン</td>
		</tr><tr><td>変性</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20秒</td>
		</tr><tr><td>プライマーアニーリング</td>
			<td>62</td>
			<td>1 ミン</td>
		</tr><tr><td>延長</td>
			<td>72</td>
			<td>30秒</td>
		</tr><tr><td>最終延長</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 ミン</td>
		</tr><tr><td>冷却</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>持つ</td>
		</tr></tbody></table>表2:DOP-PCRサイクル、温度、および時間プロファイルを示す表。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>構成素</td>
			<td>容量(μL)</td>
		</tr><tr><td>10x NT バッファー (0.5M トリス塩酸塩 pH 8,50 mM MgCl2, 0.5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0.1 Mβ-メルカプトエタノール</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>10Xヌクレオチドストック(0.5 mM dATP、0.5 mM dCTP、0.5 mM dGTP、0.5 mM dTTP、0.5 mg/mlビオチン-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>ドナーゼ I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>DNAポリメラーゼ I</td>
			<td>DNA1μgあたり5U</td>
		</tr><tr><td>DNAテンプレート(1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>DEPC処理水</td>
			<td>50 μLまで</td>
		</tr></tbody></table>表3:1つのプローブのニック変換成分と体積を示す表。

DNAハロー調製物と蛍光in situハイブリダイゼーションを組み合わせることで、核酸骨格とのゲノム相互作用の高分解能解析が可能になります。付着したゲノムは、抽出された残留核内に位置するハイブリダイズした蛍光シグナルをもたらしますが、非付着ゲノムは、残留核を取り囲むDNAのハローにあります。

全染色体、テロメア、遺伝子座を明らかにするためのDNAハロー調製物での蛍光In situハイブリダイゼーション

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

このプロトコルは、DamIDシーケンシングを使用するのではなく、核骨格への付着を評価するために使用でき、シングルセルアッセイです。この方法を使用する主な利点は、費用対効果が高く、簡単にアクセスできることです。他の可視化技術では通常は発生しない可能性のある遺伝子と染色体の機能の違いを強調することができます。治療された癌および早老症細胞におけるゲノム内の空間的および機能的組織、ならびに老化細胞におけるゲノム行動の違いは、このプロトコルを使用して評価することができる。この方法は、生涯にわたるあらゆる細胞または組織タイプおよびあらゆる疾患に適用できます。また、プローブが利用可能なモデル生物にも使用できます。はじめに、500ミリリットルの10%塩酸を準備し、それを大きなビーカーに注ぎます。顕微鏡スライドを個別に酸に滴下し、ビーカーから酸を2Gデカントするように設定したシェーカーで室温で1時間インキュベートし、スライドを水道水で10回洗浄します。その後、脱イオン水中でさらに10回行う。スライドをメタノールで2回すすぎ、滅菌するまでメタノールに保ちます。スライドをペーパータオルの上に傾けて乾燥させ、オートクレーブまたはホットオーブンで滅菌するためにホイルで包みます。60〜70%のコンフルエンシーに達するまで、血清を含む適切な培地で、摂氏37度および5%二酸化炭素で少なくとも48時間細胞を増殖させます。各細胞タイプを採取し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。スライドごとに10ミリリットルの培地に5つの細胞に10回播種します。スライドと付着細胞を入れた培養皿をインキュベーターから取り出します。メディアを廃棄し、鉛筆を使用してスライドにラベルを付けます。次に、50ミリリットルの氷冷細胞骨格バッファーを含むコプリンジャーに入れます。氷の上または摂氏4度で15分間瓶をインキュベートします。細胞骨格バッファーを廃棄し、バッファーと一緒にコプリンジャーに浸して、50ミリリットルの1回限りのDNAハローバッファーでスライドを3回すばやくすすぎます。スライドを50ミリリットルの抽出バッファーを含むコプリンジャーに移し、室温で4分間インキュベートします。次に、スライドを50ミリリットルの10回、5回、2回、および1回のDNAハローバッファー中でそれぞれ1分間連続してインキュベートします。終了したら、スライドを10、30、70、および95%エタノールの連続エタノールシリーズに浸します。スライドを70、90、および100%エタノールの連続した50ミリリットルのエタノールシリーズにそれぞれ5分間行います。加温プレートで風乾します。その後、摂氏70度のオーブンで5分間焼きます。スライドを70%ホルムアミドに2回SSC溶液で70°Cで2分間入れて変性させます。変性したスライドを50ミリリットルの氷冷70%エタノールに5分間入れます。次に、90、95、および100%のエタノールシリーズを室温でそれぞれ5分間移動します。終了したら、加温プレートでスライドを風乾します。DNAプローブを摂氏75度でホットブロックまたは水浴中で10分間変性させます。次に、摂氏37度で30分間インキュベートしてから、適切なスライドに10マイクロリットルをピペッティングします。プローブを21 x 21ミリメートルのカバーガラスで覆い、ゴムセメントで密封します。加湿ハイブリダイゼーションチャンバー内で、摂氏37度で最低18時間スライドをインキュベートします。インキュベーション後、鉗子でゴムセメントを慎重に取り除きます。次に、スライドを50ミリリットルの50%ホルムアミド中で、摂氏45度に予め温めたpH7のSSC溶液中で2回インキュベートし、5分間インキュベートします。次に、スライドを摂氏60度に予熱したが摂氏45度の水浴に入れた50ミリリットルの0.1倍SSC溶液に入れる。5分間インキュベートし、5分間インキュベーションするためにバッファーを2回交換します。スライドを室温で50ミリリットルの4回SSC溶液を含むコプリンジャーに入れ、3回のバッファー交換で15分間インキュベートします。非特異的抗体の結合を防ぐために、各スライドに100マイクロリットルの4%BSA4倍SSC溶液を塗布し、パラフィンフィルムを重ねます。室温で10分間インキュベートします。次に、200分の1に希釈した100マイクロリットルのストレプトアビジンCy3でスライドを室温で1時間インキュベートし、標識プローブを検出しました。スライドを室温で50ミリリットルの4回SSC溶液を含むコプリンジャーに入れ、3回のバッファー交換で15分間インキュベートします。DAPIを含む20マイクロリットルの取り付けソリューションにスライドを取り付け、22 x 50ミリメートルのカバーガラスをオーバーレイします。DNAハローと染色体領域を、100倍の油性対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡を使用して可視化します。DNAハロー調製は、残留核の端、残留核内に残っているDNA、および周囲にスプールアウトした未付着DNAを見ることを可能にします。増殖するヒト皮膚線維芽細胞のDNAハローは、BRDUが組み込まれた細胞から作成され、その後、抗BRDU抗体で染色されました。増殖細胞はBRDUおよび抗pKi-67に対して陽性であった。このプロトコルは、DNAハロー内の染色体領域を視覚化するために使用されました。個々の染色体は、染色体1、13、17、および18の特定の全腕染色体塗装プローブで標識されました。抗pKi-67は、増殖細胞および同一培養物内でのその不在をマークするために使用された。緑色のテロメアを含むDNAハロー製剤がここに示されています。DNAハロー中のテロメアの割合、特に実験2枚の画像で観察することができます。テロメアの平均割合は静止細胞で約17%であった。染色体付着の違いは、一次対照線維芽細胞および典型的および非定型ハッチンソン-ギルフォード早老症症候群の罹患細胞で検出され、異なるSun1アイソフォームを発現し、ラミンA変異はなかった。染色体1および13は、制御されたDNAハローと比較した場合、残留核内でのそれらの付着に統計的に有意な違いを示す。染色体領域全体の位置は、残留核およびDNAハローと相関していた。このプロトコルを試みるときは、細胞が正しい密度で播種され、適切なタイミングで抽出されていることを確認してください。この手順に続いて、間接免疫蛍光法およびRNA FISHを行うことができる。

fluorescence-situ-hybridization-on-dna-halo-preparations-to-reveal

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

染色体の複製タイミングの解析のための定量的な方法が記載されている。この方法は、蛍光との組み合わせでBrdUの取り込みを利用...

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫DNA FISH）が続いたDNA...

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。...

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

ここでは、スライドマウント染色体上の反復ヘテロクロマティック配列を可視化するために、蛍光DNAのin situハイブリダイゼーション(DNA...

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

私たちは、反復配列の観察と定量化のために、線虫Caenorhabditis elegansの生殖腺と胚における蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)の簡潔な手順を報告します。...

蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列<em&gt;その場で</emPNAプローブのある&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase...

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

このプロトコルは、クロマチン上に凝縮物を作製する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを示す。...

テロメアの化学的二量体化誘導タンパク質凝縮物

私たちは、遺伝子座コピー数とゲノム内の位置を視覚的に検出するDNA-FISHメタフェーズ拡散プロトコルを報告します。このアプローチにより、特に染色体外DNAを含むがん細胞株や均一な染色領域において、増幅状態の単一細胞分解が可能となります。...

DNA-FISHメタフェーズは、ヒトがん細胞株の染色体外DNAと均一染色領域を区別するために広がります

このビデオでは、in situハイブリダイゼーション2色全体のマウント、2つの異なる遺伝子の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚で可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当​​初、Davidウィルキンソン、ドミンゴスエンリケ、フィルインガムとデビッドイシュ-...

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin...

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

学ぶ DNAハロー調製と蛍光in situハイブリダイゼーションを組み合わせた手法で、染色体領域とテロメア分布を可視化し、がんやプロゲリア細胞におけるゲノム構造の違いを解析する方法です。

全染色体、テロメア、遺伝子座を明らかにするためのDNAハロー調製物での蛍光In situハイブリダイゼーション

さらに動画を探す