Name: 免疫蛍光を使用して、ゼブラフィッシュ胚の心臓におけるPM2.5誘導DNA損傷を検出する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: 学ぶ免疫蛍光法を用いて、ゼブラフィッシュ胚の心臓におけるPM2.5誘導DNA損傷を検出する方法。心臓奇形やタンパク質発現変化を正確に評価し、環境毒性物質の発生生物学への影響を解明する。

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この研究は、中国国立自然科学財団(助成金番号:81870239、81741005、81972999)と江蘇高等教育機関の優先学術プログラム開発によって支援されました。

本研究で使用された野生型ゼブラフィッシュ(AB)は、中国武漢市の国立ゼブラフィッシュ資源センターから入手した。ここで概説されているすべての動物の手順は、スーチョウ大学の倫理委員会の動物ケア機関によって見直され、承認されています.
1. PM2.5 サンプリングと有機化合物抽出
注:PM2.5 は、前に説明したように、2015年8月1-7日、中国蘇州の都市部で収集されました。
<ol><li>500°Cのマフレ炉で47mmの石英膜フィルターを2時間焼き、有機成分を除去します。</li>
	<li>24 時間のサンプリングを行う PM2.5 サンプラーにフィルターを配置します。</li>
	<li>フィルターを取り外し、室温で24時間乾燥します。</li>
	<li>分析バランスでフィルターを定量化します。</li>
	<li>溶媒19としてジクロロメタンを用いたソックスレー抽出によりフィルターから有機成分を抽出する。</li>
	<li>60°Cの水浴と窒素流でロータリーエバポレーションによりEOMを乾燥させます。DMSOでEOMを溶解し、-20 °Cで保存してください。</li>
</ol>2. ゼブラフィッシュ胚の採取と治療
<ol><li>14時間光と10時間の暗い光周期サイクルを持つ再循環養殖システムで28.5±0.5°Cでゼブラフィッシュを維持します。</li>
	<li>健康な成虫ゼブラフィッシュを2:1の雄対雌比でタンクに入れます。</li>
	<li>翌日、胚を採取し、システム水(すなわちゼブラフィッシュ繁殖水)で洗浄する。</li>
	<li>通常の発達(均一な大きさ、全粒、卵凝固なし)を示すゼブラフィッシュ胚を、直径7cm(1皿あたり約50胚)の個々のガラスペトリ皿の4つのグループに無作為に分けます。</li>
	<li>2 hpfから72 hpfまで0.25 μMでNACの存在下または不在のPM 2.5(5 mg/L)で胚を処置する。DMSO を車両制御として、最終濃度を 0.1% (v/v) に設定します。</li>
</ol>3. ゼブラフィッシュ胚の形態観察と心臓解剖
<ol><li>72 hpfで、胚をガラススライドに移し、立体顕微鏡で観察する。心膜浮腫、変化したループ、サイズの減少などの心臓奇形を記録します。</li>
	<li>奇形率(生きている胚全体のうち心臓欠損を有する胚の割合)を計算し、一方行ANOVAを使用してグループ間の差異を分析し、続いてトルコの多重比較試験(p<0.05 =統計的に有意)</li>
	<li>0.6 mg/mL MS-222で胚を麻酔し、ガラススライドに固定化します。</li>
	<li>30 sの心拍数を記録し、ImageJソフトウェア5、20を使用して心拍数を定量化します。</li>
	<li>ゼブラフィッシュ胚の心臓を、使い捨て注射針でステレオ顕微鏡で解剖する。注意: 心臓の形状を破壊しないようにしてください。</li>
</ol>4. 免疫蛍光アッセイ
<ol><li>免疫蛍光アッセイを使用してゼブラフィッシュ胚の心臓部でPM2.5 誘導DNA損傷を検出するには、疎水性バリアペンを使用してクリーンガラス側に円を描きます。</li>
	<li>4%パラホルムアルデヒド50 μLをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の1.25 mLに加え、固定溶液を作ります。</li>
	<li>解剖した心臓を1つの疎水性バリアペンサークルに3個入れ、室温で20分間インキュベートします。</li>
	<li>顕微鏡下で溶液をデカントし、少なくとも5分間室温でサンプルを乾燥させて、心臓がガラススライドに完全に付着するようにします。</li>
	<li>スライドをPBSで3回洗浄し、0.1%のトゥイーン20(PBST)を1回5分間洗浄します。</li>
	<li>50 μLのウシ血清アルブミン(BSA)を1000 μLのPBSTに加えて5%BSA溶液を得て、湿度の高いチャンバーで1時間、非特異的抗体結合を遮断するためにインキュベートします。</li>
	<li>溶液をデカントし、PBSTで3回、洗浄1回5分間洗浄します。</li>
	<li>PBSTの296 μLにおいてγH2AXに対して8-OHdGおよび2μLのウサギポリクローナル抗体に対して2μLのマウスモノクローナル抗体を希釈し、働く一次抗体カクテル溶液を得た。</li>
	<li>加湿チャンバー内の8-OHdGおよびγH2AXに対する一次抗体カクテル溶液の50 μLを用いて心臓サンプルを室温で、または4°Cで一晩インキュベートしてインキュベートします(一晩インキュベーションは信号強度を増加させることができます)。</li>
	<li>溶液をデカントし、PBSTで3回、洗浄1回5分間洗浄します。</li>
	<li>498 μLのPBSTで1μLのFITC標識ヤギ抗マウス二次抗体と1μLのcy3ヤギ抗ウサギ二次抗体を希釈して、働く二次抗体カクテル溶液を得て、二次抗体(PBSTで1:500)の二次抗体でサンプルをインキュベートし、暗い室内温度で1時間培養した。</li>
	<li>溶液をデカントし、PBSで3回、光から保護された洗浄1回5分間洗浄してサンプルを洗浄します。</li>
	<li>DAPI(4',6-ジミジノ-2-フェニリンドール)を20 μLのサンプルに加え、室温で30分間の核染色を行います。</li>
	<li>カバースリップを塗布して、マニキュアでスライドおよびシールし、乾燥や動きを防ぎます。次に、蛍光顕微鏡でサンプルを画像化し、ImageJソフトウェアを使用して心臓領域の蛍光シグナルを定量化します。DMSO 制御サンプルの平均で相対変化を計算します。ステップ 3.2 のデータの統計的有意性を決定します。</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/</a> (2018).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).</li>
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<li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).</li>
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<li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li>
<li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ゼブラフィッシュは、環境化学物質の心臓発達毒性を研究するための優れた脊椎動物モデルであるが、胚心臓の小さいサイズに起因して、ウェスタンブロット分析のための十分なタンパク質を得ることは困難である。そこで、PM2.5に曝露したゼブラフィッシュ胚の心臓におけるDNA損傷バイオマーカーのタンパク質発現レベルを定量化するための高感度免疫蛍光法を提示する。
解剖中、心臓の完全性をそのまま保つことが重要です。我々の経験では、72 hpfで分離を実行することは比較的容易である。さらに、心臓は収集後できるだけ早く固定液に入れる必要があります。もう一つの重要なステップは、解剖された心臓がガラススライドに完全に取り付けられていることを確認するためにサンプルを乾燥させることです。それ以外の場合、サンプルは、標識中にスライドから洗い流され得る。
二重免疫蛍光染色は、分離された心臓における8-OHdGおよびγH2AX信号の両方を検出するために行われる。この方法は、労力を節約し、サンプルサイズを削減するだけでなく、2つの信号の共局在化...

大気汚染は今や世界が直面している深刻な環境問題です。大気質の最も重要な指標の一つである周囲微小粒子状物質(PM2.5)は、多数の有害物質を運び、血液循環系に入り、人間の健康に深刻な害を及ぼす可能性がある。疫学研究は、PM2.5曝露が先天性心不全(CHD)2、3のリスクの増加につながることを実証した。また、動物実験の証拠は、PM2.5がゼブラフィッシュの胚およびマウスの子孫に異常な心臓発達を引き起こす可能性があることを示したが、PM2.5の心臓発達毒性の分子機構は依然としてほとんど知られていない4、5、6である。
DNA損傷は、細胞周期停止を引き起こし、アポトーシスを誘発し、前駆細胞の可能性を広範囲に破壊し、その結果、心臓の発達を損なう可能性がある7)。PM2.5を含む環境汚染物質は、酸化ストレス機構8,9を通じてDNAを攻撃する可能性を有することが十分に文書化されている。ヒトとゼブラフィッシュの心臓の発達は、酸化ストレス10、11、12に敏感です。8-OHdGは酸化的DNA損傷マーカーであり、γH2AXシグナルはDNA二重鎖切断のマーカーである。細胞内システインとグルタチオンの合成前駆体であるN-アセチル-L-システイン(NAC)は、抗酸化化合物として広く使用されています。本研究では、NACを用い、PM2.5-誘導DNA損傷13における酸化ストレスの役割を調べる。
脊椎動物のモデルとしてのゼブラフィッシュは、脊椎動物14,15の間で心臓開発のメカニズムが高度に保存されているため、心臓の発達やヒト心血管疾患の研究に広く用いられている。ゼブラフィッシュをモデルとして使用する利点には、小型、強力な生殖能力、低給餌コストなどがあります。これらの研究に特に興味深いのは、ゼブラフィッシュ胚は初期の発達の間に循環系に依存せず、重度の心臓奇形14を生き残ることができる。さらに、その透明性により、全身を顕微鏡下で直接観察することができます。このように、ゼブラフィッシュ胚は、種々の環境化学物質への曝露の結果として心臓発達毒性の誘導に関与する分子機構を評価する優れた機会を提供する5、16、17。我々は以前にPM2.5誘導酸化ストレスがDNA損傷およびアポトーシスをもたらし、ゼブラフィッシュ18の心臓奇形をもたらすことを報告した。本研究では、ゼブラフィッシュ胚の心臓部におけるPM2.5誘導DNA損傷を調査するための詳細なプロトコルを提供する。

<table><tbody><tr><td>8-OHdG 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, USA</td><td>sc-66036</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>分析バランス</td><td>Sartorius, China</td><td>BSA124S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Solarbio,Beijing,China</td><td>SW3015</td><td>ブロッキング</td></tr><tr><td>用</td><td>DAPI Abcam, USA</td><td>ab104139</td><td>核対比染色用.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio,Beijing,China</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Olympus, Japan</td><td>IX73</td><td>蛍光シグナルのイメージング用/</td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG Cy3</td><td>カールスバッド,アメリカ</td><td>CW0159</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG FITC</td><td>カールスバッド,アメリカ</td><td>RS0003</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン(NAC)</td><td>アダマス-ベータ,上海、中国</td><td>616-91-1</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>QILINBEIER、中国</td><td>TS-1</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ、中国</td><td>P6148</td><td>固定用に 4% パラホルムアルデヒドを作ります。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>HyClone,USA</td><td>SH30256.01</td><td>PBSで0.1%トゥイーンを調製し、洗浄します。</td></tr><tr><td>PM2.5サンプ</td><td>ラーTianHong、武漢、中国</td><td>TH-150C</td><td>24時間中断のないPM2.5サンプリング用。</td></tr><tr><td>再循環養殖システム</td><td>HaiSheng、上海、中国</td><td></td><td>ゼブラフィッシュはその中で維持されました。</td></tr><tr><td>ソックスレー抽出器</td><td>ZhengQiao、上海、中国</td><td>BSXT-02</td><td>有機成分抽出用。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン、カナダ</td><td>SMZ645</td><td>ゼブラフィッシュ胚からの心臓解剖用。</td></tr><tr><td>トリカインメタンスルホン酸(MS222)</td><td>シグマ、中国</td><td>E10521</td><td>ゼブラフィッシュ胚</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>シグマ、中国</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>&γを麻酔する。H2AX 抗体</td><td>Abcam, USA</td><td>ab26350</td><td>一次抗体</td></tr></tbody></table>

免疫蛍光を使用して、ゼブラフィッシュ胚の心臓におけるpm2.5誘導dna損傷を検出する

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

周囲の微小粒子状物質(PM2.5)曝露は心臓発達毒性を引き起こす可能性があるが、基礎となる分子メカニズムはまだ不明である。8-ヒドロキシ-2'デオキシゲナーゼ(8-OHdG)は、酸化的DNA損傷のマーカーであり、γH2AXはDNA二重鎖切断のための感受性マーカーである。本研究では、免疫蛍光アッセイを用いてゼブラフィッシュ胚の心臓部におけるPM2.5誘導8-OHdGおよびγH2AXの変化を検出することを目的とした。ゼブラフィッシュ胚は、受精後2時間(hpf)で抗酸化N-アセチルL-システイン(NAC,0.25 μM)の有無に関して、PM2.5 から5μg/mLで抽出可能な有機物質(EOM)で処理した。DMSOは車両制御として使用されました。72hpfでは、注射針を使用して胚から心臓を解剖し、固定して透過させた。ブロックされた後、サンプルを8-OHdGおよびγH2AXに対する一次抗体でプローブした。次いで、試料を洗浄し、二次抗体でインキュベートした。得られた画像を蛍光顕微鏡観察下で観察し、ImageJを用いて定量した。結果は、PM2.5 からのEOMがゼブラフィッシュ胚の心臓部で8-OHdGおよびγH2AX信号を有意に増強したことを示す。しかしながら、NACは、活性酸素種(ROS)スカベンジャーとして作用し、EOM誘導DNA損傷を部分的に打ち消した。ここでは、ゼブラフィッシュ胚の心臓における環境化学的誘導タンパク質発現変化の検出に適用できるPM2.5-誘発心臓欠陥におけるDNA損傷の役割を調べるための免疫蛍光プロトコルを提示する。

この免疫蛍光アッセイは、環境化学物質にさらされたゼブラフィッシュ胚の心臓におけるタンパク質発現変化を測定するための敏感かつ特異的な方法である。
この代表的な分析では、抗酸化物質NACの存在の有無または存在下でPM2.5にさらされた胚は、心臓奇形の存在について評価した(図1)。観察されたように、PM2.5からのEOMは、DMSO制御治療心臓と比較して、心膜浮腫、変化したループ、およびサイズの減少などの心臓奇形発生の有意な増加を引き起こした。また、EOMに曝露された胚においても心拍速度が有意に低下した(図1B)。NACの添加はEOM誘発性心不全を著しく減衰させた(図1)。
<p class="jove_content" fo:k...

このプロトコルは、免疫蛍光アッセイを使用して、ゼブラフィッシュ胚の解剖された心臓におけるPM2.5誘発DNA損傷を検出する。

免疫蛍光を使用して、ゼブラフィッシュ胚の心臓におけるPM2.5誘導DNA損傷を検出する

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

この方法は、ゼブラフィッシュ心臓における標的タンパク質の発現を正確かつ容易に検出するために使用することができる。標的タンパク質の変化は、免疫蛍光を測定することによって直接検出される。テキスト原稿に記載されているようにゼブラフィッシュ胚の収集と治療を行う。受精後72時間で、胚をガラススライドに移し、ステレオ顕微鏡で観察します。心膜浮腫、ループの変化、サイズの減少などの心臓奇形を記録する。奇形率を計算し、一方の方法ANOVAを使用してグループ間の差異を分析し、続いてトルコの多重比較検定を行います。ミリリットルMS222あたり0.6ミリグラムで胚を麻酔した後、30秒間心拍を記録し、Image Jソフトウェアを使用して心拍数を定量化します。ステレオ顕微鏡の下で使い捨ての注射針でシマウマの魚の胚から心臓を慎重に解剖する。疎水性バリアペンを使用して、きれいなガラススライドに円を描きます。4%パラホルムアルデヒドの50マイクロリットルをPBSの1.25マイクロリットルに加えて固定液溶液を作り、解剖した心臓を1つの疎水性バリアサークルに入れ、室温で20分間インキュベートします。溶液を顕微鏡下でデカントし、サンプルを室温で少なくとも5分間乾燥させます。PBSTで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。50マイクロリットルのBSAを1,000マイクロリットルのPBSTに加えて5%BSA溶液を得て、湿度の高いチャンバーで1時間インキュベートして非特異的抗体結合を遮断します。溶液をデカントし、PBSで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。8-ヒドロキシデオキシグアノシンに対してマウスモノクローナル抗体の2マイクロリットルを希釈し、296マイクロリットルのPBSTでγ-H2AXに対してウサギのポリクローナル抗体を2マイクロリットル希釈し、一次抗体カクテル溶液の働きを得る。加湿チャンバーに50マイクロリットルの一次抗体カクテル溶液を用いて、心臓サンプルを室温で少なくとも1時間、摂氏4度で一晩インキュベートします。溶液をデカントし、PBSTで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。FITC標識ヤギ抗マウス二次抗体の1マイクロリットルと500マイクロリットルのPBSTのpsy-3ヤギ抗ウサギ二次抗体の1マイクロリットルを希釈し、働く二次抗体カクテル溶液を得る。暗い温度で1時間二次抗体でサンプルをインキュベートします。溶液をデカントし、PBSで3回、洗浄ごとに5分間洗浄します。核染色用のサンプルに20マイクロリットルのDAPIを加え、室温で30分間インキュベートします。スライドにカバースリップを適用し、乾燥や動きを防ぐためにマニキュアでそれを密封します。蛍光顕微鏡でサンプルを画像化し、ImageJソフトウェアを使用して心臓領域の蛍光シグナルを定量化します。DMSO制御サンプルの平均を用いて相対変化を計算し、データの統計的有意性を決定します。抗酸化物質の存在または存在下でPM2.5にさらされた胚は、N-アセチル-L-システイン、またはNAC、心臓奇形の存在について評価した。PM 2.5からのEOMは、DMSO対照処置心臓と比較して、心膜浮腫、変化したループおよびサイズの減少などの心臓奇形発生の有意な増加を犠牲にした。また、EOMに曝露された胚においても心拍数が有意に低下した。NACの付加はEOM誘発の心臓欠陥を弱めた。EOM処理組織におけるDNA損傷の程度を評価するために免疫蛍光アッセイを用いた。EOMで処理したゼブラフィッシュ胚の心臓では8-ヒドロキシデオキシグアノシンおよびγ-H2AX発現のレベルが有意に増加し、酸化DNA損傷およびDNA二重鎖の破壊の増加を示した。EOMによるDNA損傷は、NAC補充によって部分的に打ち消された。このプロトコルを試みるとき、ゼブラフィッシュの心臓がスライドから剥がれる可能性があるため、PBSでサンプルを洗浄する際には注意してください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ゼブラフィッシュ胚の心臓の免疫染色を実施する迅速な方法が説明されています。全体のマウント免疫染色の手法に比べ、この方法は劇的に非常に低下処理時間内に心臓の細胞/細胞内構造を明らかに高解像度の画像を得ることができる抗体の浸透を、増加させる。...

ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

このビデオは、ゼブラフィッシュの胚の心臓におけるPM2.5による酸化的損傷を検出するための高感度免疫蛍光法に基づくアッセイを、DNA損傷と二本鎖DNA切断を示す8-OHdGとγH2AXのレベルを測定する方法を示しています。...

魚の胚におけるPM2.5媒介性DNA損傷を検出するための免疫蛍光アッセイ

特定の遺伝的摂動や毒素への曝露は、正常な発生過程を混乱させ、特定の細胞タイプの死につながる可能性があります。ゼブラフィッシュ胚におけるホールマウント免疫蛍光法による活性化カスパーゼ3の解析により、アポトーシスを特異的に受ける細胞の病期および組織特異的な局在が明らかになりました。...

活性化カスパーゼ3を検出するために、ホールマウント免疫蛍光法によりゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスの分析

ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。...

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

ゼブラフィッシュの心臓発生中の心臓遺伝子発現プロファイルを分析するために、総RNAを単離した心臓から抽出されなければならない。ここでは、心臓特異的mRNAを得るために、ゼブラフィッシュの胚からの迅速な手動の切開によって、機能/鼓動心を収集するためのプロトコルを提示する。...

転写分析のための大規模ゼブラフィッシュ胚心臓解剖

細胞および組織中のタンパク質レベルは、多くの場合、緊密にタンパク質産生及びクリアランスのバランスによって調節される。光変換した後、蛍光減衰（FDAP）を使用して、タンパク質のクリアランス速度は、実験的にin vivoで測定することができる。...

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

このプロトコルの目標は、生理学的および病理学的条件の下で胚性ゼブラフィッシュにおけるセグメント性心機能の評価のための新しい方法を詳述することです。...

心筋機械変形(DIAMOND)の変位解析は、胚性ゼブラフィッシュにおける心機能のセグメント的不均一性を明らかにする

光シート蛍光顕微鏡で 生体内...

ゼブラフィッシュ胚における高速心臓ダイナミクスの光シート顕微鏡

シグナル伝達経路の光遺伝学的操作は、発生、再生、恒常性、および疾患においてシグナル伝達がどのように解読されるかを調べるための強力な戦略となり得ます。このプロトコルは早いゼブラフィッシュの胚の光酸素電圧感知の領域基づかせていた節および骨のmorphogenic蛋白質(BMP)のシグナリングの活性剤を使用するための実用的な指針を提供する。...

ゼブラフィッシュ胚における光遺伝学的シグナル伝達の活性化

本研究は、個々のゼブラフィッシュ胚性心臓における全域DNAメチル化を定量化するための高感度免疫蛍光を用いたイメージング法を確立します。この方法は限られた組織材料の課題を克服し、亜硫酸水素変換の必要性を回避します。...

ゼブラフィッシュ幼虫の心臓における全局DNAメチル化の検出

学ぶ免疫蛍光法を用いて、ゼブラフィッシュ胚の心臓におけるPM2.5誘導DNA損傷を検出する方法。心臓奇形やタンパク質発現変化を正確に評価し、環境毒性物質の発生生物学への影響を解明する。

免疫蛍光を使用して、ゼブラフィッシュ胚の心臓におけるPM_2.5誘導DNA損傷を検出する

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