Name: ラットにおける再現可能な集中治療ユニット指向エンドトキシンモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 学ぶラットにおける再現可能な集中治療ユニット指向エンドトキシンモデル。生理学的・分子パラメータの反復評価が可能で、敗血症研究における動物使用の削減と倫理的アプローチの向上に貢献します。

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著者らは、ベアトリス・ベック=シマー(MD)とエリック・シャッデ(MD)の批判的検討と、この原稿に対する貴重な貢献に感謝したい。

このプロトコールで提示されたすべての実験は、スイスのチューリッヒ州獣医局によって承認されました(承認番号134/2014およびZH088/19)。さらに、この実験で実施されたすべてのステップは、スイスメディアルサイエンスアカデミー(SAMS)による動物実験に関するガイドラインおよび欧州実験動物科学協会連盟(FELASA)のガイドラインに準拠していました。
1. 麻酔誘発と動物モニタリング
<ol><li>250〜300グラム(g)の体重の雄Wistarラットを病原体のない条件下で換気ケージに保管する。周囲温度22 ± 1 °Cで12〜12時間の明暗サイクルを提供し、食べ物と水に無料でアクセスできます。</li>
	<li>麻酔誘導ボックス内のイソフルラン(濃度3〜5%)による揮発性誘導を30秒間(図1A)、または代わりにケタミン/キシラジンの単発注射(体重100gあたり10/1ミリグラム(mg))で麻酔を誘導することによって全身麻酔を誘導する。</li>
	<li>動物を作業場所に移し、実験全体を通して動物を加熱マットの上に置きます。体温を36.5〜37°Cに保ちます。</li>
	<li>酸素を供給するためにノーセコンを使用してください (600 mL/分).揮発性麻酔が麻酔維持のために選択された場合、イソフルラン2〜3%を加える。動物が自発的に呼吸していることを確認してください。</li>
	<li>気管切開および動脈および静脈カテーテルの設置前に、つま先ピンチ反射の不在によって麻酔のレベルを確認する。</li>
	<li>末梢酸素飽和度モニタリング(通常酸素飽和度98~100%)により十分な酸素化を確認。</li>
	<li>目を保護するために軟膏(ビタミンA軟膏)を使用してください。</li>
	<li>図1Bに示すように、サイドテーブルに滅菌手術器具とカテーテルを準備します。</li>
	<li>さらに、 図1Cに示すように、圧力と酸素飽和度の監視を準備します。</li>
</ol>2. 静脈内アクセス
<ol><li>ラットの近位尾部に止血帯を塗布して、静脈アクセスを容易にする(図2A)。</li>
	<li>尾をアルコールで3回消毒する。</li>
	<li>G26静脈内カテーテルを2つの側尾静脈のうちの1つに誘導する。 注:私たちの経験から、ここの静脈は皮膚の近くに位置しているため、ラットの尾の遠位部分に静脈内アクセスを配置する方が簡単です。さらに、カニューレが失敗した場合、近接して移動するのに十分なスペースがあります。</li>
	<li>空気の噴射は厳に避けてください。</li>
	<li>静脈内カテーテルを配置した後、止血帯の結び目を解く。</li>
	<li>静脈内カテーテルを粘着テープで所定の位置に固定します(図2B)。</li>
	<li>シリンジポンプを静脈内アクセスに接続して、連続的な流体および薬物塗布を行います。</li>
	<li>ボーラス液、薬物適用、および静脈血液サンプリングに3ウェイ活栓を使用してください。</li>
</ol>3. 気管切開術
<ol><li>動物の前首部を剃る。</li>
	<li>剃った皮膚をプロビドンヨウ素溶液で3回消毒する。</li>
	<li>メス(刃数10)を用いて縦約2cmの切開を行う。</li>
	<li>2-0のシルク縫合糸で皮膚を引っ込める。</li>
	<li>喉頭と気管を手術用はさみで直立的に準備する(図3A)。</li>
	<li>3〜5番目の 気管留め金で外科用マイクロハサミで気管を開くようにしてください。</li>
	<li>滅菌気管カニューレを気管内に挿入する。一方的な換気を避けるために、カニューレを深く挿入しすぎないように注意してください。</li>
	<li>2-0シルク縫合糸を使用してカニューレを所定の位置に固定します。</li>
	<li>カニューレを人工呼吸器に接続して、圧力または容積制御換気を行います(図3B)。</li>
</ol>4. 動脈アクセス
<ol><li>ラットの尾をポビドン - ヨウ素溶液で3回消毒する。</li>
	<li>腹側で縦1cm程度のメス(刃数10)を用いて皮膚を切断する。</li>
	<li>注意して、尾動脈の損傷を避けるために深く切りすぎないでください。</li>
	<li>手術用顕微鏡を使用して動脈を慎重に露出させます。外科用マイクロハサミで動脈を囲む筋膜を切断する。</li>
	<li>6-0シルク縫合糸を使用して動脈の遠位部分をリゲートする。</li>
	<li>近位6-0のシルク縫合糸を準備するが、シルクを締め付けない(図4A)。</li>
	<li>G-26カテーテルを遠位および近位絹縫合糸の間の動脈に導入する。</li>
	<li>カテーテルが動脈に入ったら、近位シルク縫合糸を締め付け、カテーテルを所定の位置に固定します(図4B)。</li>
	<li>カテーテルを圧力トランスデューサに接続して、連続的な動脈圧測定(通常平均動脈圧:60~100mmHg)を提供します(図4C)。</li>
	<li>さらに、圧力トランスデューサに接続されたカテーテルとG-26カテーテルの間に3方向活栓を配置して動脈採血を行います。</li>
</ol>5. ベースライン測定、敗血症誘発およびフォローアップ測定
<ol><li>動物が定常状態に達した後、LPSを注入する。</li>
	<li>定常状態に達したとき(通常15〜30分後)に血液サンプルを採取する。</li>
	<li>血液サンプルからの体液損失をリンゲルの溶液で1:4の比率で置き換えます。</li>
	<li>敗血症を誘発するには、LPSをボーラスとして、または連続LPSアプリケーションとして注入する。</li>
	<li>ボーラス適用のために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解したLPS/kg体重(kg)を1mg/mLの濃度で注入する。</li>
	<li>連続塗布のために、シリンジポンプ(LPSの原液:PBS中1mg/mL)を用いて、実験全体を通して300μgのLPS/kg/時間を注入する。</li>
	<li>空気塞栓症を防ぐために、常に空気注入を避けてください。</li>
	<li>実験を設定する前に、体液置換プロトコル、血管収縮剤適用プロトコル、および中絶基準(例えば、体液置換にもかかわらず30分間以上50mmHg未満の平均動脈血圧として定義される低血圧)を定義する。 注:リンゲル溶液を10mL/kg/時間の速度で連続注入することをお勧めします。</li>
	<li>注入された量から流体の任意の連続投与(例えば、連続LPS適用の場合)を差し引いて、結果が対照群のそれと同等になるようにする。 注:実験の終了時に、組織学的または生化学的検査などのさらなる分析のために肝臓、腎臓または脾臓などの器官を採取する前に、動物は下カバ静脈の切開によって安楽死させることができる。安楽死の推奨される方法は、特に臓器の炎症マーカーを評価する場合、下大静脈の切開および氷冷生理食塩水を左心臓に注射する前に、動物を麻酔の外科的平面に連れて行くことである。法的要件と地域のガイドラインを確実に遵守してください。敗血症関連の臓器不全を検証するために、カスパーゼ-3のようなアポトーシス促進マーカーとα1ミクログロブリンを分析して腎臓の尿細管損傷を検証することができます。CINC-1、MCP-1およびIL-6のようなマーカーの器官特異的分析はまた、器官特異的炎症反応に関する情報を提供し得る。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、提示された研究に関して利益相反はない。Martin Schläpferは、医療用ガス、特に酸素(O2)および二酸化炭素(CO2)を使用する患者に対する手術および/または麻酔の悪影響を軽減するための特許を提出した。彼はスウェーデンのセダナメディカルとスイスのロシュから無制限の研究助成金を受けていますが、この研究とは無関係です。

ここで説明するプロトコルは、再現性が高く、しかも学習が簡単な敗血症モデルを可能にし、研究の質問に応じて適応させることができます。心拍数、血圧、末梢動脈酸素飽和度などの臓器機能を参照する重要なin vivoデータを連続的に収集してもよく、実験を通して採血を繰り返し行ってもよい。さらに、流体置換プロトコルおよび昇圧器サポートに関する修正をインストールすることができます。動物の血行力学的安定性を考えると、以前に報告されたように、実験を数時間にわたって行うことができる8。
特定の研究課題10,11に答えるために適切な敗血症モデルを選択しなければならないことを指摘しなければならない。すべての敗血症モデルには利点がありますが、欠点もあります。現在の記事では、強いが無菌性の炎症を誘発する内毒素血症モデルが提示されている。敗血症の主要な特徴は、強い炎症反応12の発症、内皮機能障害および損...

敗血症およびそのより重篤な形態である敗血症性ショックは、感染を理由とする症候群であり、サイトカインの放出による過剰炎症反応をもたらし、抑制された免疫防御および致命的な結果を伴う生理学的および生化学的変化をもたらす1,2。この不均衡な炎症反応は、肺、腎臓、肝臓などの様々な重要な器官において器官機能障害および器官不全をもたらす。37%3では、敗血症は患者が集中治療室(ICU)に入院する最も一般的な理由の1つです。敗血症の死亡率は現在、約20〜30%の範囲です4。早期かつ効果的な抗生物質治療が最も重要である5.体液および昇圧剤蘇生は早期に設置する必要があり、それ以外は、治療は純粋に支持的である6。
敗血症は、細菌、真菌、ウイルス、または寄生虫による証明済みまたは疑いのある感染として定義され、臓器機能障害を伴う。敗血症性ショック基準は、流体治療のみに反応しないさらなる心血管虚脱、および2ミリモル/リットルを超える乳酸レベルが存在する場合に満たされる2。敗血症関連の臓器不全はどの臓器でも起こり得るが、心血管系、脳、腎臓、肝臓、および肺において非常に一般的である。敗血症に罹患しているほとんどの患者は、患者の気道を確保し、吸引から保護し、低酸素症を予防または克服するために、高画分の刺激酸素で正の終末呼気換気を適用するために気管内挿管を必要とする。気管チューブおよび機械的換気に耐えるために、患者は通常鎮静を必要とする。
グラム陰性菌の膜の構成成分であるリポ多糖類(LPS)などのエンドトキシンは、toll様受容体(TLR)47を介して強い炎症反応を誘導する。定義された経路の活性化は、安定した炎症反応を保証する。サイトカイン誘導性好中球化学誘引タンパク質1(CINC-1)、単球化学誘引タンパク質1(MCP-1)、およびインターロイキン6(IL-6)のようなサイトカインは、このモデル8における重症度および転帰の予後因子として知られている。静脈内LPS適用は、ラットにおける敗血症の様々な態様を研究するために首尾よく使用されている8、9。
敗血症の治療は、特に予測動物モデルがないため、依然として課題です。全身性炎症の活性化を伴う内毒素血症が薬理学的治療法の開発のための適切なモデルである場合は議論の余地がある。しかしながら、周知のLPS誘導TLR4経路を用いて、重要な知識が得られる。

<table><tbody><tr><td>2-0 シルク縫合糸</td><td>エチコン、ソマービル、ニュージャージー州</td><td>K833</td><td>標準外科</td></tr><tr><td>用 26 静脈内カテーテル</td><td>ベクトン・ディキンソン、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州</td><td>391349</td><td>標準麻酔器具</td></tr><tr><td>6-0 LOOK 黒編組シルク</td><td>サージカル・スペクタリティーズ・コーポレーション、ワイオミッシング、ペンシルバニア</td><td>州 SP114</td><td>標準外科</td></tr><tr><td>用アラリス・シリンジ・ポンプ</td><td>ベンクトン・ディキンソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma, Basel, Switzerland</td><td>7.68034E+12</td><td>GTIN番号</td></tr><tr><td>湾曲した微細先端マイクロ鉗子</td><td>ワールド精密機器(WPI)、サラソタ、フロリダ州</td><td>504513</td><td>血管の準備を容易にします</td></tr><tr><td>微細先端マイクロ鉗子</td><td>ワールド精密機器(WPI)、サラソタ、フロリダ州</td><td>501976</td><td>チップは定期的に磨く必要があります</td></tr><tr><td>インフィニティデルタXL麻酔モニタリング</td><td>ドレーガー、L&uuml;ベック、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン、250 mLボトル</td><td>アタネ、ピラマル、ムンバイ、インド</td><td>LDNI 22098</td><td>標準的な獣医機器</td></tr><tr><td>ケタミン(ケタラール)</td><td>Pfitzer、ニューヨーク、NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖(LPS)から Escherichia coli、血清型055:B5</td><td>Sigma、Buchs、Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-tips small</td><td>Carl Roth GmbH、カールスルーエ、ドイツ</td><td>EH11.1</td><td>Standard surgical</td></tr><tr><td>Ringerfundin</td><td>Bbraun, Melsungen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tec-3 Isofluorane Vaporizer</td><td>Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL</td><td>no longer available</td> 標準<td>獣医用機器</td></tr><tr><td>キシラジン (Xylazin Streuli)</td><td>Streuli AG, Uznach, Switzerland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ラットにおける再現可能な集中治療ユニット指向エンドトキシンモデル

A Reproducible Intensive Care Unit-Oriented Endotoxin Model in Rats

敗血症および敗血症性ショックは、集中治療室における主要な死因のままである。敗血症管理の大幅な改善にもかかわらず、死亡率は依然として20〜30%の範囲である。敗血症関連の多臓器不全および死亡を減少させるための新規治療アプローチが緊急に必要とされている。堅牢な動物モデルは、1つまたは複数の治療アプローチを可能にし、生理学的および分子的パラメータに対するそれらの効果を試験することを可能にする。この記事では、簡単な動物モデルを紹介します。
第1に、全身麻酔は、揮発性の使用または腹腔内麻酔のいずれかによって動物において誘導される。静脈内カテーテル(尾静脈)の配置、気管切開、動脈内カテーテル(尾動脈)の挿入後、機械的換気を開始する。平均動脈血圧、動脈血中酸素飽和度、および心拍数のベースライン値が記録されます。
リン酸緩衝生理食塩水に溶解したリポ多糖類(1ミリグラム/キログラム体重)の注射は、toll様受容体4を介して強力で再現性のある炎症反応を誘導する。体液補正およびノルエピネフリンの適用は、十分に確立されたプロトコルに基づいて行われる。
この記事で紹介する動物モデルは、習得が容易で、鎮静、機械的換気、継続的な血圧モニタリング、および反復採血を備えた集中治療室での臨床的敗血症治療に強く向けられています。また、このモデルは信頼性が高く、動物研究の3R(削減、置換、改良)の原則に従って、限られた数の動物で再現可能なデータを可能にします。敗血症研究における動物実験は簡単に置き換えることはできませんが、反復測定は動物の減少を可能にし、敗血症動物を麻酔をかけておくことは苦しみを軽減します。

提示されたシステムは、以前に報告されたように血行力学的に安定な動物による内毒素血症を可能にする9。LPS処理動物は、LPS刺激を受けた動物において、およびLPS刺激を受けない動物において安定なままであるが、CINC-1(867ng/mL)、MCP-1(5027ng/mL)、およびIL-6(867ng/mL)などの血漿サイトカイン(適用後6時間)によって測定される陰性塩基過剰および強い炎症反応などの敗血症の特徴を発症する8、 図5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62024/62024fig01.jpg"> 図1:機器の準備:麻酔/酸素塗布のための麻酔誘導ボックスと鼻円錐(<str...

ここでは、ラットにおける再現可能な集中治療室指向エンドトキシンモデルを提示する。

Sepsis and septic shock remain the leading cause of death in intensive care units. Despite significant improvements in sepsis management, mortality still ...

このプロトコルは、生理学的および分子的パラメータを繰り返し評価することができる内毒素血症の堅牢で再現可能なモデルである。このアプローチは、敗血症研究における質問に答えるのに役立つかもしれません。私たちのモデルは動物実験に取って代わるものではありませんが、連続鎮静によって敗血症モデルを洗練させ、繰り返しサンプリングすることによって動物の数を減らします。初心者は動脈および静脈カテーテルの挿入に苦労するかもしれませんが、これらの技術を習得するために必要なトレーニングは限られています。実験セットアップ全体を視覚化することで、研究者はICUの状況をより厳密に模倣するためにモデルをセットアップまたは適応させることができます。麻酔をかけられた動物を加熱マットに移すことから始めます。体温を摂氏36.5〜37度に保ちます。動物が鼻円錐で酸素を供給して自発的に呼吸していることを確認してください。気管切開術および動脈および静脈カテーテルの設置前につま先ピンチ反射がないことによって麻酔のレベルを確認する。目を保護するために軟膏を使用してください。十分な酸素化のために、圧力と酸素飽和度のモニタリングとともに滅菌手術器具とカテーテルを準備します。静脈アクセスを容易にするためにラットの近位尾部に止血帯を塗布し、アルコールで尾部を3回消毒する。26ゲージの静脈内カテーテルを2つの側尾静脈の1つに導入し、空気注入を避けます。静脈内カテーテルを配置した後に止血帯を解き、粘着テープで静脈内カテーテルを所定の位置に固定する。3ウェイ活栓を備えたシリンジポンプを静脈内アクセスに接続して、連続的な流体および薬物塗布を行います。動物の前頸部を剃って気管切開を開始し、次にポビドンヨウ素溶液で剃った皮膚を3回消毒する。刃数10のメスを用いて縦2センチの切開を行う。2-0のシルク縫合糸で皮膚を引っ込める。その後、喉頭と気管を外科用ハサミで開くように鈍く準備しました。滅菌気管カニューレを気管に挿入し、一方的な換気を避けるために深く浸透しすぎないように注意してください。2-Oシルク縫合糸を使用してカニューレを所定の位置に固定し、カニューレを人工呼吸器に接続して圧力または容積制御換気を行います。実験を設定する前に、体液置換プロトコル、血管収縮剤適用プロトコル、および中絶基準を定義します。ラットの尾部をポビドンヨウ素溶液で3回消毒した後、尾動脈の損傷を避けるために深く切りすぎないように注意しながら、メスを使って腹側で皮膚円を縦1センチに切断する。手術用顕微鏡を使用して動脈を慎重に露出させます。外科用マイクロハサミで動脈を囲む筋膜を切断する。次に、近位6-0の絹縫合糸を行うことによって動脈の遠位部を結紮するが、絹を締め付けない。遠位と近位絹縫合糸の間の動脈に26ゲージのカテーテルを導入し、近位絹縫合糸を締め付けてカテーテルを所定の位置に固定する。カテーテルを圧力トランスデューサに接続して、連続的な動脈圧測定を提供します。さらに、圧力トランスデューサに接続されたカテーテルと動脈採血用の26ゲージカテーテルの間に三方活栓を置きます。動物が定常状態に達した後、LPSを注射して敗血症を誘発し、血液試料を採取した。血液サンプルからの体液損失を1対4の割合でリンゲル溶液で置き換え、空気塞栓症を防ぐために常に空気注入を避けます。平均動脈圧は、LPS刺激の有無にかかわらず、動物において安定している。LPS処理された動物は、陰性塩基過剰などの敗血症の特徴を発症する。LPS処理動物はまた、化学誘引性タンパク質-1、単球化学誘引性タンパク質-1、およびインターロイキン-6などの血漿サイトカインによって測定された強い炎症反応を発症した。このプロトコルを試みるときは、固体で再現性のある研究データを得るために、流体および昇圧レジメンを事前に定義し、終了基準を定義することを忘れないでください。このプロトコルは、他の敗血症モデルに適合させることができる。したがって、研究の質問は、最も適切なアプローチで、動物福祉の削減、改良、置き換えの原則に従って答えられます。

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Research

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Medicine

医学

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齧歯類の急性肺損傷を誘発するための非侵襲的気管内リポ多糖投与

学ぶラットにおける再現可能な集中治療ユニット指向エンドトキシンモデル。生理学的・分子パラメータの反復評価が可能で、敗血症研究における動物使用の削減と倫理的アプローチの向上に貢献します。

ラットにおける再現可能な集中治療ユニット指向エンドトキシンモデル

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