ラットにおける再現可能な集中治療ユニット指向エンドトキシンモデル
2021年2月20日
ここでは、ラットにおける再現可能な集中治療室指向エンドトキシンモデルを提示する。
このプロトコルは、生理学的および分子的パラメータを繰り返し評価することができる内毒素血症の堅牢で再現可能なモデルである。このアプローチは、敗血症研究における質問に答えるのに役立つかもしれません。私たちのモデルは動物実験に取って代わるものではありませんが、連続鎮静によって敗血症モデルを洗練させ、繰り返しサンプリングすることによって動物の数を減らします。
初心者は動脈および静脈カテーテルの挿入に苦労するかもしれませんが、これらの技術を習得するために必要なトレーニングは限られています。実験セットアップ全体を視覚化することで、研究者はICUの状況をより厳密に模倣するためにモデルをセットアップまたは適応させることができます。麻酔をかけられた動物を加熱マットに移すことから始めます。
体温を摂氏36.5〜37度に保ちます。動物が鼻円錐で酸素を供給して自発的に呼吸していることを確認してください。気管切開術および動脈および静脈カテーテルの設置前につま先ピンチ反射がないことによって麻酔のレベルを確認する。
目を保護するために軟膏を使用してください。十分な酸素化のために、圧力と酸素飽和度のモニタリングとともに滅菌手術器具とカテーテルを準備します。静脈アクセスを容易にするためにラットの近位尾部に止血帯を塗布し、アルコールで尾部を3回消毒する。
26ゲージの静脈内カテーテルを2つの側尾静脈の1つに導入し、空気注入を避けます。静脈内カテーテルを配置した後に止血帯を解き、粘着テープで静脈内カテーテルを所定の位置に固定する。3ウェイ活栓を備えたシリンジポンプを静脈内アクセスに接続して、連続的な流体および薬物塗布を行います。
動物の前頸部を剃って気管切開を開始し、次にポビドンヨウ素溶液で剃った皮膚を3回消毒する。刃数10のメスを用いて縦2センチの切開を行う。2-0のシルク縫合糸で皮膚を引っ込める。
その後、喉頭と気管を外科用ハサミで開くように鈍く準備しました。滅菌気管カニューレを気管に挿入し、一方的な換気を避けるために深く浸透しすぎないように注意してください。2-Oシルク縫合糸を使用してカニューレを所定の位置に固定し、カニューレを人工呼吸器に接続して圧力または容積制御換気を行います。
実験を設定する前に、体液置換プロトコル、血管収縮剤適用プロトコル、および中絶基準を定義します。ラットの尾部をポビドンヨウ素溶液で3回消毒した後、尾動脈の損傷を避けるために深く切りすぎないように注意しながら、メスを使って腹側で皮膚円を縦1センチに切断する。手術用顕微鏡を使用して動脈を慎重に露出させます。
外科用マイクロハサミで動脈を囲む筋膜を切断する。次に、近位6-0の絹縫合糸を行うことによって動脈の遠位部を結紮するが、絹を締め付けない。遠位と近位絹縫合糸の間の動脈に26ゲージのカテーテルを導入し、近位絹縫合糸を締め付けてカテーテルを所定の位置に固定する。
カテーテルを圧力トランスデューサに接続して、連続的な動脈圧測定を提供します。さらに、圧力トランスデューサに接続されたカテーテルと動脈採血用の26ゲージカテーテルの間に三方活栓を置きます。動物が定常状態に達した後、LPSを注射して敗血症を誘発し、血液試料を採取した。
血液サンプルからの体液損失を1対4の割合でリンゲル溶液で置き換え、空気塞栓症を防ぐために常に空気注入を避けます。平均動脈圧は、LPS刺激の有無にかかわらず、動物において安定している。LPS処理された動物は、陰性塩基過剰などの敗血症の特徴を発症する。
LPS処理動物はまた、化学誘引性タンパク質-1、単球化学誘引性タンパク質-1、およびインターロイキン-6などの血漿サイトカインによって測定された強い炎症反応を発症した。このプロトコルを試みるときは、固体で再現性のある研究データを得るために、流体および昇圧レジメンを事前に定義し、終了基準を定義することを忘れないでください。このプロトコルは、他の敗血症モデルに適合させることができる。
したがって、研究の質問は、最も適切なアプローチで、動物福祉の削減、改良、置き換えの原則に従って答えられます。
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概要
本記事では、集中治療室（ICU）を対象とした研究向けに設計された、ラットにおける強固で再現性の高いエンドトキシン血症モデルを紹介します。このモデルでは、生理学的および分子的なパラメータの繰り返し評価が可能であり、敗血症研究に寄与します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 敗血症研究
- 動物モデル
背景
- エンドトキセミア（内毒素血症）は、敗血症における極めて重要な病態です。
- 既存のモデルでは、多くの場合、多大な数の動物を使用する必要があります。
- 継続的な鎮静処置を行うことで、実験的手法を改善できます。
- 反復サンプリングにより、より少ない動物数からより多くのデータを取得することが可能です。
研究目的
- ICUの状態を模倣したモデルを開発すること。
- 生理学的反応の繰り返し評価を容易にすること。
- 研究における動物の倫理的利用を向上させること。
使用方法
- 麻酔したラットを保温マットへ移動させる。
- 動脈および静脈カテーテルを挿入する。
- 生理学的パラメータを継続的にモニタリングする。
- 適応を促すため、実験セットアップを確認する。
主な結果
- このモデルは再現性があり、エンドトキシン血症の研究において堅牢である。
- 生理学的および分子生物学的パラメータを繰り返し評価することができる。
- 実験に必要な動物数を削減できる。
- 初心者のカテーテル挿入手技のトレーニングを容易にする。
結論
- このモデルにより、制御された条件下での敗血症の研究が促進されます。
- これは、クリティカルケアにおける今後の研究のための枠組みを提供します。
- 敗血症における動物研究に対して、より倫理的なアプローチを提示します。
よくある質問
産業上の重要性
このICU指向のエンドトキシンモデルは、敗血症研究における生理学的および分子的なパラメータの再現性のある評価を可能にし、繰り返しサンプリングを行うことで動物の使用数を削減しつつ、治療的介入の反復的な検証を実現します。本モデルは3R原則に準拠しており、鎮静、人工呼吸、および血液動態モニタリングという臨床的に関連のある条件下で、敗血症調節化合物の前臨床評価を促進します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 制御されたエンドトキシン血症条件下において、TLR4シグナル伝達やサイトカインカスケード（例：MCP-1、IL-6）などの炎症経路の解析を可能にする。
- 運用の価値： 標的への結合および経路調節研究において、再現性のある血行動態および炎症のリードアウトを提供する。
- 科学的価値： 分子介入を平均動脈圧やベース・エクセスなどの生理学的アウトカムに結びつけることで、メカニズムに基づくリスク低減をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 敗血症の病態生理におけるバイオマーカーアッセイとの関連付けに適した、定量可能な血漿サイトカインおよび生理学的パラメータを算出できる。
- 運用の価値： 標準化された輸液蘇生および昇圧剤プロトコルにより、化合物スクリーニングのための一定のベースライン条件を確保できる。
- 科学的価値： 同一個体から繰り返し採血することが可能であり、被験者あたりのデータ密度を高め、アッセイの再現性を向上させることができる。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：人工呼吸、持続的な動脈圧モニタリング、ノルエピネフリンの使用など、ICUでの臨床管理を反映しており、トランスレーショナルな関連性を高めている。
- 運用的価値：定義された終了基準および輸液補充プロトコルにより、標準化された前臨床研究の実施とラボ間の再現性がサポートされる。
- 科学的価値：多臓器不全マーカーの評価を容易にし、敗血症治療薬開発におけるリスク調整後の進展決定を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
このモデルは、標的バリデーションから前臨床有効性試験に至る敗血症の創薬連続体の中に位置しており、特に過剰炎症や血管機能不全を標的とした化合物に適しています。
- 探索生物学：LPS負荷に対するサイトカインおよび血行動態の測定可能な反応を通じて、免疫調節標的の仮説検証を支援します。
- スクリーニング：化合物ライブラリーの評価に向けて、標準化された敗血症表現型を持つアッセイ準備完了済みの生物学的システムを可能にします。
- 分析：用量反応および標的結合分析のために、MAP、ベースエクセス、血漿サイトカイン（MCP-1、IL-6）を含む定量的出力を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：ICUケアプロトコルを模倣し、探索段階から敗血症治療薬の前臨床検証までの連続性を向上させます。
- エンタープライズでの再利用：確立されたカテーテル挿入、人工呼吸、およびモニタリングのワークフローにより、複数の敗血症メカニズム研究にわたるプラットフォームの再利用が可能になります。
運用および企業への影響
- 科学的価値：再現性のある敗血症フェノタイプと測定可能な炎症カスケードを通じて、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：標準化された手術およびモニタリング手順により、再現性が高まり、実験間のばらつきが低減される。
- 戦略的価値：繰り返しサンプリングにより使用動物数を削減し、リソース負担を軽減させ、倫理的な前臨床パイプラインを支援する。
- ポートフォリオへの影響：敗血症のターゲット仮説のリスクを低減するメカニズムおよび生理学的リードアウトを提供することで、より早い段階でのgo/no-go決定を可能にする。
実施上の考慮事項
- げっ歯類における血管カテーテル挿入および無菌的手術手技に関する専門知識。
- 動脈圧変換、人工呼吸器制御、および血液ガス分析のための装置。
- 輸液蘇生、昇圧剤の投与量、および体温維持（36.5–37°C）に関する標準化されたプロトコル。
- 敗血症モデルにおける、異なるラット系統や併存疾患に対する適応上の検討事項。
- 制限事項として、動脈カテーテル挿入の技術的な複雑さと、交絡となる感染を防ぐための無菌操作の必要性が挙げられる。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:06
Anesthesia Induction, Animal Monitoring, Intravenous Access and Tracheostomy
3:06
Arterial Access, Baseline Measurement, Sepsis Induction and Follow-Up Measurements
4:37
Results: The Analysis of the Arterial Pressure, Sepsis and the Inflammatory Reaction in LPS-Treated and Non-Treated Animals
5:11
Conclusion
