Name: 単細胞アレイの生細胞イメージング(LISCA) - 細胞動態を定量化する多目的な技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ単細胞アレイの生細胞イメージング（LISCA）による細胞動態定量化法。マイクロパターンアレイと走査タイムラプス顕微鏡を用いて、同一微小環境下の多数の個別細胞から蛍光時間変化を自動追跡し、統計的に有意な細胞応答解析を実現する。

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この研究は、ドイツ科学財団(DFG)から共同研究センター(SFB)1032への助成金によって支援されました。ドイツ連邦教育研究技術省(BMBF)による協力プロジェクト05K2018-2017-06716メディソフトの支援とバイエリッシェ・フォルシュングスシュティフトゥンからの助成金は感謝しています。アニタ・ライナーは、ミュンヘン(QBM)の定量バイオサイエンス大学院を通じてDFGフェローシップによって支援されました。

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</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

ここでは、単細胞レベルで細胞内蛍光標識の細胞動態に従う多目的技術としてLISCAを説明した。LISCA実験を成功させるためには、プロトコルセクションの各ステップを個別に確立し、すべてのステップを組み合わせる必要があります。LISCAの3つの主要な側面のそれぞれは、重要なステップを備えています。
単一細胞マイクロアレイ製造 マイクロアレイの細胞の位置合わせは、さらなる実験ステップだけでなく、データ品質にも影響を与えるため、マイクロアレイの品質は非常に重要です。このため、パターンの幾何学および製造方法は、使用される細胞に対して適合されなければならない。本稿で説明した代表的な結果は、肝臓癌細胞株HuH7が(30μm)2の正方形のパターンに整列して生成された。このパターンジオメトリは、A549 や HEK293 などの他のセルラインにも適しています。BEAS-2B のような大きなセルでは、35 μm のエッジ長と 80 μm の 2 乗距離を持つ大きな正方形パターンを使用できます。記載された播種手順はHuH7細胞に対して最適化されるが、他の多く...

近年、単細胞実験の重要性が明らかになってきた。単一細胞からのデータは、細胞間変動、細胞内パラメータ相関の分解能、およびアンサンブル測定1、2、3に隠されたままの細胞動態の検出の調査を可能にする。数千個の単一細胞の細胞動態を並行して調べるには、数時間から数日間の期間にわたって標準化された条件下で細胞を監視し、定量的なデータ分析4を行う新しいアプローチが必要である。ここでは、マイクロ構造化アレイとタイムラプス顕微鏡と自動画像解析を組み合わせた単一細胞アレイ(LISCA)のライブセルイメージングを紹介します。
マイクロ構造化単一細胞アレイを生成するためのいくつかの方法が確立され、文献5,6に掲載されています。ここでは、マイクロスケールのプラズマ開始タンパク質パターニング(μPIPP)について簡単に説明します。μPIPPを用いた単一セルアレイ製作の詳細なプロトコルは、リファレンス7にも記載されています。単一細胞配列を用いると、各細胞に対して定義された微小環境を提示する標準化された接着スポットに数千個の細胞を整列させ、実験変動の原因を減少させる(図 1A)。単一細胞アレイは、さまざまな細胞プロセスを示すために目的とする蛍光マーカーの時間コースを監視するために使用されます。スキャンタイムラプスモードにおける長期顕微鏡検査により、単一細胞アレイの広い領域を監視し、数時間または数日の観察時間にわたってハイスループットで単一細胞データをサンプリングすることができます。これにより、配列の各位置から画像の時系列スタックが生成されます(図1B)。大量の画像データを削減し、望ましい単一細胞蛍光時間コースを効率的に抽出するためには、細胞の位置決めを利用した自動画像処理が必要である(図1C)。
LISCAの課題は、実験プロトコルと計算ツールを適応させて、細胞動態の定量的で再現可能なデータを生成するハイスループットアッセイを形成することです。本稿では、個々の方法と、それらをLISCAアッセイでどのように組み合わせるかについて、ステップバイステップで説明します。一例として、人工mRNA送達後の強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)発現の経時経過について考察する。mRNA送達後のeGFP発現は、mRNAの翻訳および分解をモデル化した反応速度式によって説明される。eGFP濃度の時間経過に対するモデル関数を、時間の経過とともに個々の細胞ごとに蛍光強度のLISCA読み出しに適合させることで、mRNA分解率などのモデルパラメータの最良の推定値が得られます。代表的な結果として、2種類の異なる脂質系トランスフェクション剤のmRNA送達効率と、そのパラメータ分布の違いについて考察する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62025/62025fig01.jpg"> 図1:(A)マイクロパターン単細胞アレイ(B)走査時間経過顕微鏡と(C)記録画像系列の自動画像解析を組み合わせたLISCAワークフローの表現単細胞アレイは、マイクロパターン上の細胞の配置につながる細胞忌避的な空間を有する細胞接着性の二次元パターンからなるが、相コントラスト画像ならびにeGFP発現細胞の蛍光像(A)に見られるように。マイクロ構造領域全体が、一連の位置(B)で繰り返し画像を撮影するスキャンタイムラプスモードで画像化されます。記録された画像シリーズは、時間の経過に関する細胞あたりの蛍光強度を読み出すために処理される(C)。スケールバー:500 μm(A)、200μm(C)<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62025/62025fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>アドテックポリマーエンジニアリングPTFEマイクロチューブ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10178071</td><td></td></tr><tr><td>ベーキングオーブン</td><td>バイン</td><td>ダー9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>CFIプランフローDL 10x</td><td>ニコン</td><td>MRH20100</td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>ロス</td><td>NX07.1</td><td></td></tr>エ<tr><td>クリプスTi-E</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>eGFP mRNA</td><td>トライリンク</td><td>L-7601</td><td></td></tr><tr><td>メスルアーチューブコネクタ</td><td>MEDNET</td><td>FTL210-6005</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>Yo タンパク質</td><td>663</td><td></td></tr><tr><td>フィルターセット eGFP</td><td>AHF</td><td>F46-002</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;半透明のプラチナ硬化シリコーンチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11768088</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 m)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーションボックス</td><td>Okolab</td><td>OKO-H201</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>バインダー</td><td>9040-0012</td><td></td></tr><tr><td>L-15 フェノールレッドなし</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>テフロン製</td><td></td>オス ルアー <td></td><td></td></tr><tr><td>チューブ コネクタ</td><td>MEDNET</td><td>MTLS210-6005</td><td>代替品 社内製造オス ルアー</td></tr><tr><td>NaCl (5 M)</td> <td>サーモ フィッシャー</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>ニードルレス バルブ - オス ルアー コネクタ</td><td>MEDNET</td><td>NVFMLLPC</td><td></td></tr><tr><td>NIS エレメント</td><td>ニコン</td><td></td><td>イメージングソフトウェア バージョン 5.02.00</td></tr><tr><td>NOA81</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>チューブシステムアセンブリ用高速硬化光学接着剤</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PCO エッジ 4.2 M-USB-HQ-PCO</td><td>pco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td></td><td></td><td>社内で調製された</td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ディーナー フェムト</td><td>Pico-BRS</td><td></td></tr><tr><td>PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)</td><td>SuSoS AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ mit mircorstructures</td><td></td><td></td><td>社内で製造された</td></tr><tr><td>Sola Light Engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スティッキースライド VI 0.4&nbsp;</td><td>同上</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコーン エラストマー キット</td><td>ダウ コーニング</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>タンゴ 2</td><td>M&auml;rzh&auml;ユーザー</td><td>00-24-626-0000</td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td></td><td></td><td>社内調製</td></tr><tr><td>コーティングされていないカバースリップ</td><td>同上</td><td>10813</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F Solo, 1 mL</td><td>Omilab</td><td>9166017V</td><td>(交換用スポーン付き</td></tr></tbody></table>)

単細胞アレイの生細胞イメージング(lisca) - 細胞動態を定量化する多目的な技術

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

単一細胞アレイ(LISCA)のライブセルイメージングは、高スループットで個々の細胞からの蛍光信号の時間コースを収集するための汎用性の高い方法です。一般に、培養細胞からの単細胞時間コースの獲得は、細胞の運動性および細胞形状の多様性によって妨げられる。接着剤マイクロアレイは、単一細胞条件を標準化し、画像解析を容易にします。LISCAは、単一細胞マイクロアレイと、走査時間経過顕微鏡と自動画像処理を組み合わせたものです。ここでは、単細胞蛍光時間コースをLISCA形式で取る実験ステップについて説明する。また、強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)用のmRNAコードを用いて微小パターン配列に付着した細胞をトランスフェクトし、走査時間経過顕微鏡を介して数百個の細胞のeGFP発現動態を並行して監視します。画像データスタックは、選択した細胞の輪郭に蛍光強度を統合して単一細胞蛍光時間コースを生成する新開発のソフトウェアによって自動的に処理されます。mRNAトランスフェクション後のeGFP発現時間コースは、mRNAの発現および分解率を明らかにする単純な運動翻訳モデルによって十分に記述されていることを実証する。アポトーシスのシグナル伝達の文脈における複数マーカーのイベント時間相関に対するLISCAのさらなる応用が議論される。

LISCAアプローチは、単一細胞から効率的に蛍光時間コースを収集することができます。代表的な例として、トランスフェクション後の単細胞eGFP発現を測定するためにLISCA法がどのように適用されるかの概要を示す。LISCA実験のデータは、効率的なmRNA薬の開発に重要であるmRNA送達キネティックスを評価するために使用されます。
特に、翻訳の時点の発症と発現速度に関する2つの脂質ベースのmRNA送達系の影響を単細胞レベルで示す。細胞を培養し、そのバッチを2つの集団に分けた。プロトコルセクションに記載されているように、1つの亜集団がリポプレックスでトランスフェクトされた。他の亜集団は、同じ最終mRNA濃度を有する同じmRNAを用いてトランスフェクトしたが、送達系として脂質ナノ粒子(LNP)を用いて、マイクロ流体混合12を用いて製造した。異なる脂質組成とリポプレックスとLnPsのmRNA送達系の異なる製造のために、我々は取り込み動力学が影響を受けるべきであるように翻訳キネティクスに影響を与えることを期待する。LISCA法を用いて、トランスフ...

マイクロパターン配列を用いた単一細胞からの蛍光レポータータイムコースの取得方法を紹介する。このプロトコルは、単一細胞アレイの調製、ライブセルスキャンタイムラプス顕微鏡のセットアップと動作、および接着部位あたりの細胞統合蛍光時間コースの自動事前選択、視覚制御および追跡のためのオープンソース画像分析ツールを記述する。

単細胞アレイの生細胞イメージング(LISCA) - 細胞動態を定量化する多目的な技術

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high ...

LISCAと呼ばれる単一細胞アレイのライブセルイメージングは、何百もの個々の細胞の蛍光時間コースの自動読み出しでもあります。このアプローチの利点は、個々の細胞応答が同一のマイクロ環境で空間的に単離された細胞から記録され、優れた統計を用いた効率的な発光分析が可能になる点である。単一セル配列を製造するには、メスを使用して、6つのマイクロパウダーストライプを含む単一のPDM傑作をPDM層から切り取り、マイクロパターンを上に向けてラボベンチに置きます。カミソリの刃を使用して、6つのマイクロパターンストライプをそれぞれPDMスタンプに切り取り、パターン化された領域の一部を切り取り、スタンプの端が開くようにします。次に、6つのチャンバースライドのカバースリップの保護箔を注意深く傷つけてスライドのチャネル位置をマークし、保護ホイルを下に向けてベンチにカバースリップを置きます。ピンセットを使用して、マークされたチャンネル位置のカバースリップにスタンプを置き、マイクロパターンを下に向けて、顕微鏡下でスタンプの取り付けを確認します。スライドに接する正方形は、スペースよりも暗く表示されます。パターンの品質は、スライドに正しくアタッチされていない四角形によって低下します。スタンプがしっかりと取り付けられている場合は、カバースリップと酸素プラズマを持つスタンプを0.2ミリバールで、約40ワットで3分間処理して、PDMスタンプとカバースリップ親水性の間の表面を作ります。プラズマクリーニングの最後に、カバースリップをバイオセーフティキャビネットに入れ、各スタンプに15マイクロリットルのペグ化ポリリジン溶液を加え、溶液がスタンプの親水性パターンに吸収されるようにします。20分後、1ミリリットルの超純水で切手をすすきます。ピンセットを使用してスライドから切手を取り除き、2ミリリットルの超純水でカバースリップを2回目にすすります。カバースリップが完全に乾燥したら、マイクロパターン化された領域がチャネルの下部に合うように注意して、カバースリップに6チャンネル粘着スライドを取り付けます。そして、各チャネルにPBSの40マイクロリットルとフィブロネクチン溶液の40マイクロリットルを追加します。2つの溶液を混合するには、1つのリザーバから40マイクロリットルを取り出し、同じチャネルの反対側の貯水池に3回加え、均質な溶液を生成します。すべてのチャネルが混合されたら、各チャネルを洗浄ごとに120マイクロリットルのPBSで3回洗浄する前に、室温でスライドを45分間インキュベートします。PBSを摂氏37度に交換し、120マイクロリットルの培地を1つの貯水池に加えてチャネル中の細胞増殖培地を完全に補い、反対側の貯水池から取り除きます。400,000細胞の40マイクロリットルを対象の懸濁液及び40マイクロリットルの細胞増殖培地を各チャネルに加え、示したように培地と細胞溶液を混合する。混合後、各チャンネルから40マイクロリットルの懸濁液を取り除き、チャネルのみを細胞懸濁液で満たして、スライドを細胞培養インキュベーターに入れる。1時間後、位相差顕微鏡で細胞接着を確認し、各チャネルに摂氏37度の120マイクロリットルを加え、さらに3時間スライドを細胞培養インキュベーターに戻す。灌流システムをセットアップするには、摂氏37度の細胞成長培地で満たされた1ミリリットルのシリンジをシステムの入口チューブに接続し、バルブを使用してチューブを媒体で満たします。入口管を1つのチャネルの貯留槽に接続し、気泡が閉じ込められなくて注意し、現在のチャネルの入口管と反対のリザーバにシリアルコネクタを接続します。必要な数のチャンネルが連続して接続されるまで、示されているように残りのチャンネルを接続します。そして、出口管を最終的なチャネルの自由な貯蔵所に直接接続する。次に、接続されたチューブを媒体で満たし、灌流システムが漏れないことを確認します。細胞のタイムラプスイメージングのために、位相コントラスト画像と蛍光画像を記録するためのタイムラプスプロトコルを設定し、位相コントラストイメージングおよび蛍光イメージング用の光学構成を設定する。10倍の目標、適切な蛍光フィルター、自動フォーカス補正システムを使用して、長期的な測定のためのより良い画質を保証します。位相コントラスト画像の10ミリ秒の露光時間と、EGFP蛍光強度を記録するための750ミリ秒の露光時間を選択します。位置リストを通る連続したループと30時間の観測時間の間の10分の時間間隔で、時間スケジュールを設定します。次に、マイクロスコープの37°Cの加熱室のサンプルホルダーに、単一のセラー上げに6つのチャネルスライドを置き、ステージに灌流システムチューブをテープします。出口管の自由端を15ミリリットルの円錐形チューブに挿入して、液体廃棄物を収集します。スキャン時間経過測定の位置リストを設定し、ポジションリストを通して連続ループ間の定義された時間間隔内で、位置数をスキャンすることができるように注意する。次に、タイムラプス測定を開始します。蛍光マーカーを用いた細胞のトランスフェクションでは、注射器を使用して、37°C PBSの1ミリリットルでチューブシステムを洗い流し、顕微鏡ステージが動かないように注意してください。フラッシュ後、対象のmRNAを補充した血清還元培地300マイクロリットルを、マイクロリットル当たり0.5ナノグラムのmRNAの最終濃度に満たし、リポプレックスが1時間インキュベートできるようにします。インキュベーションの終了時に、摂氏37度の完全な細胞増殖培地の1ミリリットルでシステムを洗い流し、任意の非結合mRNAを除去する。分析の最後に、チャンネルメニューにリストされているチャンネルを表示し、時間枠をスクロールして、事前に選択された細胞とその統合蛍光信号を検査します。目的のセルをクリックして蛍光時間の経過時間をハイライト表示するか、タイムコースをクリックして対応するセルを見つけます。Shift キーを押しながらセルをクリックすると、選択または選択解除できます。生存できない、または接着点に限定されていない、または別のセルに結合されている細胞を選択解除して、さらなる分析から除外します。すべての細胞が適切に選択または選択解除されたら、細胞領域の単一の細胞時間コースと統合蛍光を適切なディレクトリに保存します。トランスフェクション後の翻訳導入時間、および細胞EGFP発現の強度を定量化するために、3段階の翻訳モデルを採用することができる。EGFPのモデルソリューションは、図のように単一セルタイムコースに適合させることができます。ここで、翻訳導入時間のヒストグラムとリポプレックストランスフェクト細胞の発現率が観察できる。両方のパラメータが各細胞について推定されるように、これらのパラメータの相関は、散布図で示されるように分析することができ、脂質ナノ粒子をトランスフェクトした細胞と比較することができます。図示したように、脂質ナノ粒子を導入した細胞は、リポプレックスをトランスフェクトした細胞と比較して細胞間変動性が低い。そして、母平均は、翻訳の発症が速く、より高い発現率を示しています。当社のアプローチは、代替のマイクロパターニング方法にも適応することができます。LISCAにとって最も重要なのは、良好な細胞閉じ込めと、便利なユーザーの監督を伴う自動画像分析の組み合わせです。あなたが見てきたように、細胞の挙動は異質です。そして、単一細胞のタイムラプス映画は、固有の生化学的ネットワークの公平なダイナミクスへのアクセスを提供します。例えば、緑色発現では、アポトーシスまたは細胞殺死アッセイが挙がる。

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生物学

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概日時計は、個々の細胞内で機能する、すなわち、それらは細胞自律的である。ここでは、非侵襲的、ルシフェラーゼベースのリアルタイム生物発光技術を用いた細胞自律的なクロックモデルを生成するための方法を説明します。レポーター細胞は、概日生物学を研究するのに扱いやすい、機能的なモデル系を提供する。...

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

このビデオでは、生きたT細胞と抗原提示細胞との間の相互作用を可視化するための格子ライトシート顕微鏡法について説明します。この方法では、相互作用する細胞ペアに極薄の格子ライトシートを集束させて一連の2次元画像を取得し、それらを組み合わせて高解像度の4次元画像を取得し、細胞間相互作用の時空間ダイナミクスを明らかにします。...

生細胞における受容体-リガンド相互作用を可視化するための格子ライトシート顕微鏡法

細胞間の通信は、細胞内外の様々な生理活性を制御するために重要です。本稿では、単一細胞分泌物の時空間的な性質を測定するためのプロトコルについて説明します。これを達成するためには、学際的なアプローチは、生細胞イメージングとラベルフリーnanoplasmonic検知を統合が使用されます。...

単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術

ソフトウェア ベースの後処理に続いてタイムラプス ビデオ顕微鏡による神経の人口を監視するための堅牢なプロトコルを説明します。このメソッドは、ライブ...

ライブ イメージング モニター細胞生物学および複数の神経集団の血統で、進行を追跡 1 つのセルに続いて

レンズ無料ビデオ顕微鏡は、インキュベーターの中に直接培養細胞を監視することが出来ます。ここで集録し、解析を培養 HeLa 細胞の 2.7 日間の長い取得するために使用完全なプロトコルについて述べる、2.2 x 10 のデータセットにつながる個々 の細胞の形態や 10584...

レンズ無料のビデオ顕微鏡、付着性細胞培養の定量的解析

休止状態とアクティブな癌細胞の表現型は、定量的な位相画像を用いた特徴付けられました。細胞の増殖、移行、および形態の試金を統合し、1...

時間経過、ラベル無料、定量的相休眠とアクティブなひと癌細胞のイメージング研究

住セルイメージ投射は、固定細胞イメージングだけで達成可能ではない単一セルまたは全体人口の豊富な情報を提供します。ここでは、下記の抗有糸分裂薬パクリタ キセルで治療細胞運命決定を評価する生細胞イメージング...

長期的な住セルイメージ投射細胞の運命をパクリタ キセルに応答を評価するために

このプロトコルの目的は、ラティス光シート顕微鏡を使用して、生細胞の表面受容体ダイナミクスを4次元的に可視化する方法を示すことを目的としています。ここで、CD4+一次T細胞上のT細胞受容体が示されている。...

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

ここでは、フォローアップのマルチパラメーター生細胞顕微鏡検査を実施するためのさまざまな多細胞スフェロイド形成方法について説明します。蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)、細胞自家蛍光、染色色素、およびナノ粒子を使用して、生きた三次元(3D)がんおよび幹細胞由来スフェロイドにおける細胞代謝、低酸素症、および細胞死の解析のためのアプローチを実証します。...

多細胞スフェロイドの作製およびマルチパラメーター生細胞蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)

学ぶ単細胞アレイの生細胞イメージング（LISCA）による細胞動態定量化法。マイクロパターンアレイと走査タイムラプス顕微鏡を用いて、同一微小環境下の多数の個別細胞から蛍光時間変化を自動追跡し、統計的に有意な細胞応答解析を実現する。

単細胞アレイの生細胞イメージング(LISCA) - 細胞動態を定量化する多目的な技術

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