Name: 細胞への分子化合物の送達を強化するためのアキュトー流体デバイスの組立と操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 学ぶ アキュトー流体デバイスを用いた細胞への生体分子送達法。超音波ソノポレーションにより細胞生存性を維持しながら迅速に分子を導入し、がん治療などの細胞治療応用に活用できます。

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この研究は、国立科学財団(#1827521、#1827521、#1450370)と国立衛生研究所(U01HL127518)からの資金提供によって部分的に支援されました。フォトリソグラフィーサービスは、ルイビル大学マイクロ/ナノテクノロジーセンターによって提供されました。

全血献金は、ルイビル大学の機関審査委員会によって承認されたプロトコルに従って、健康なドナーから集められました。
1. アヌースト流体デバイスの製造
<ol><li>直径500μmのチャンネルを含む同心渦巻き設計のフォトマスクを入手してください。CAD ファイルは、例として補助ファイルに用意されています。カスタムフォトマスクは、市販のベンダーから注文することも、マスクライターを使用してパターン化することもできます。</li>
	<li>標準的なフォトリソグラフィ技術を使用してフォトレジストコーティングされたシリコンウエハー上に同心円スパイラル設計の金型を準備します。<ol>
<li>100mmシリコンウエハに、SU-8 2100大さじ2(約30mL)を加えます。</li>
		<li>30 sの速度でスピンコートを150 rpmでスピナーにしてフォトレジストを広げ、60 sの速度を1,200 rpmに上げて200μmの厚さを得る。</li>
		<li>115°Cで30分のランプアップと30分の住み込みでポリイミド真空オーブンでフォトレジストコーティングウエハーを硬化させ、30分間ランプダウンします。</li>
		<li>ステップ1.1のフォトマスクとマスクアライナーを使用して130s用のフォトレジストコーティングウエハを露出させる。</li>
		<li>ステップ1.2.3で説明したのと同じプロセスに従って露光後にウェーハを焼く。</li>
		<li>SU-8現像液で約8分間フォトレジストを開発。 注意:風通しの良い化学発煙フードに現像液のみを使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>金型をシルナイズして表面をより疎水性にします。フォトレジストコーティングされたウエハーをデシケータに入れ、クロロシラン(C8 H4Cl3F13Si)を20μL滴加えます。30 sのチャンバーに真空を適用し、その後、チャンバーを密封し、一晩残します。 注意:クロロシランは非常に危険で可燃性です。暴露は重度の火傷および眼の損傷を引き起こす。</li>
	<li>ポリジメシロキサン(PDMS)ベース54gと6gの硬化剤をカップに組み合わせ、ヘラで少なくとも1分間激しく徹底的に混ぜます。</li>
	<li>PDMS溶液を含むカップをデシケータに約30分間、または残気泡が溶液から取り除かれるまで置きます。</li>
	<li>150mmペトリ皿に上向きのパターンを持つフォトレジストコーティングウエハースを置きます。</li>
	<li>150mmペトリ皿の中の型の上にPDMS溶液を注ぎます。</li>
	<li>必要に応じて、デシケータの中に150mmのペトリ皿を置き、残された気泡が消えるまで真空を適用します。</li>
	<li>150mmペトリ皿をラボオーブンに移し、60°Cで2時間焼いてPDMSを治します。</li>
	<li>硬化後、カミソリの刃を使用してウエハーの縁を切り取って、ペトリ皿からPDMSを慎重に取り除きます。</li>
	<li>ナイフやカミソリの刃を使用して、個々のデバイスを切り取ります。</li>
	<li>2.5mmバイオプシーパンチを使用して、各デバイスの入口ポートと出口ポートに穴を開けます。</li>
	<li>各PDMSデバイスを、チャンネルが露出したプラズマアッシャーに配置します(上向き)。酸素プラズマ処理(45 sの100 W、500 mbar O2)を適用し、各PDMSデバイスを、ガラス表面に向けられたチャネルを備えたきれいなソーダライムガラス顕微鏡スライド(75mm x 25 mm x 1 mm)にすぐに置きます。</li>
	<li>デバイスを室温で一晩結合させます。</li>
	<li>直径1cmのピエゾトランスデューサの表面にシリコンを1~2mmの厚さでそっと塗布し、トランスデューサを同心渦巻きに慎重に合わせ、ガラス顕微鏡スライドの底面(PDMSデバイスの反対側)にそっと押し込みます。</li>
</ol>2. アスース流体システムの組立と操作
<ol><li>USB AからBのケーブルを使用して、マイクロコントローラをコンピュータに接続します。緑色の電源 LED インジケータ(PWR と表示)が点灯する必要があります。</li>
	<li>コンピュータ上の関連プログラムを使用して、8 MHz信号を生成するプログラムをアップロードします。プログラムの例は補足Fのイルに用意されています。プログラムをアップロードした後、マイクロプロセッサメモリに保存され、再度アップロードする必要はありません。</li>
	<li>PZTトランスデューサ上の各ワイヤの端に1 "22Gワイヤーをはんだ付けします。</li>
	<li>PZTトランスデューサのマイナス(黒)端子線をはんだ付きワイヤーを介してGNDピンに接続します。</li>
	<li>PZTトランスデューサの正(赤)端子線を、はんだ付きワイヤーを介して出力ピン(提供例プログラムの#9)に接続します。</li>
	<li>オプションで、アクロス流体デバイスとマイクロコントローラを3Dプリントケースに取り付けます。CAD ファイルは、例としてSアッププレメンタル Fイルに用意されています。追加のワイヤを他のマイクロコントローラピンに接続して、必要に応じて外部LEDインジケータとオン/オフプッシュボタンを制御できます。</li>
	<li>タイゴンPVCソフトプラスチックチューブ(1/16"ID、1/8"OD)の3-6"セクションをカットし、入口と出口ポートにチューブを押します。開口部に収まるまで圧力をかけながらチューブを回転させる必要があるかもしれません。必要に応じて、各ポートにチューブを挿入した後、接着は、PDMSとチューブを結合するために接合部に適用することができます。</li>
	<li>メーカーの指示に従ってマイクロ流体貯留層を組み立てます。</li>
	<li>タイゴンPVCソフトプラスチックチューブ(1/16"ID、1/8"OD)の3-6"セクションをカットし、マイクロ流体貯水池の出力チューブから1/32"IDチューブの上にチューブをプッシュします。必要に応じて、漏れを防ぐためにパラフィンフィルムで接合部を包みます。</li>
	<li>60 mL シリンジに周囲の空気を充填し(必要に応じて、0.2 μm フィルターで空気をろ過)、マイクロ流体貯留層の側面にあるタイゴン PVC チューブ (1/16" ID、1/8" OD)に接続します。</li>
	<li>シリンジポンプを200 mL/hの速度に設定して、50 mL/hの体積流量でアクロ流体デバイスを介して細胞/超音波造影剤溶液を押し込み、アユースト流体デバイスの出力から50mL遠心チューブにサンプルを収集します。必要に応じて、70%エタノール溶液の15 mLでア菌流体処理の前にリンスチャネルは、流体チャネルの無菌性を増加させる。さらに、チャネルは、システムを介して細胞をポンピングする前に、デバイス内の残留エタノールを除去するために、15 mLの脱イオン水でリンスすることができます。</li>
</ol>3. 超音波造影剤の調製
注:超音波造影剤は、近くの細胞膜19の一過性の透過性を増加させることによって、分子化合物のアキュスト流体送達を有意に増強する。分子送達は、このシステムで超音波造影剤なしで非常に限られています。
<ol><li>以下の混合物を含む20mLシンチレーションバイアルでリン脂質溶液を調製する:<ol>
<li>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)の25mgを加える。</li>
		<li>11.6 mgの 1,2-ディステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン (DSEPC).</li>
		<li>0.26 mgの 1,2-ディステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール (DSPG) を加えます。</li>
		<li>0.88mgのポリオキシエチレン40ステアリン酸を加えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべてのリン脂質が溶解するまでクロロホルムを加える(例えば、3mLのクロロホルム)。</li>
	<li>乾燥した脂質膜を形成するために48時間乾燥剤でクロロホルムを蒸発させる(アルゴン下またはロータリーエバポレーターによる蒸発は、乾燥プロセスを加速するために使用することができる)。</li>
	<li>10 mLの無菌リン酸緩衝食塩水(PBS)で脂質膜を再水和する。</li>
	<li>40%振幅で3分間の脂質溶液を超音波処理し、カチ素ミセル溶液を形成します。</li>
	<li>超音波処理の後、リン脂質溶液を2〜6°Cで最大1ヶ月間保存します。</li>
	<li>超音波造影剤を調製するには、2mLガラス中隔バイアルに200μLのカチオンミセル溶液と600 μLの無菌PBSを加えます。</li>
	<li>キャップを圧着してバイアルを密封します。</li>
	<li>1.5インチ20Gの針を使用して、バイアルヘッドスペースにデカフルオロブタンガスを30sで充填します。</li>
	<li>4,350 cpmで45秒のバイアルをアマルガメートし、パーフルオロブタンガス充填超音波造影剤を形成する。</li>
	<li>超音波造影剤溶液を1 mL当たり25μLの細胞溶液に加えて、結合された造影剤/細胞混合物をアプス流体装置に送り込みます。細胞溶液は、ユーザーが望むように修飾することができるが、我々の研究では、細胞溶液は、それぞれステップ4.21の原発性T細胞と、ステップ5.7のA549肺癌細胞で構成された。</li>
</ol>4. 原発性T細胞の調製
<ol><li>末梢血単核細胞(PBMC)を全血溶液から分離し、-150°Cで保存する。 基板を含む密度勾配分離は、一般に全血24、25、26からPBMCを分離するために利用される。</li>
	<li>37°Cの水浴で冷凍バイアルを解凍します。</li>
	<li>15mL遠心分離管にPBSで解凍PBMCs 1:10を希釈します。各1mLバイアルには約1,000万PBMCsが含まれています。</li>
	<li>遠心分離機は4°Cで11分間580 x gでPBMCsを希釈した。</li>
	<li>上清を吸引し、細胞を再懸濁させるためにバッファを実行しているMAの13 mLを追加します。</li>
	<li>自動セルカウンターまたはヘモサイトメーターでPBMCをカウントします。</li>
	<li>PBMCsを4°Cで11分間580xgで再び遠心分離し、上清を吸引する。 </li>
	<li>1,000万 PBMCあたり40μLのチルドランニングバッファを追加します。</li>
	<li>T細胞を単離するには、1000万PBCsあたり10μLのパンT細胞ビオチン抗体カクテルを加えます。</li>
	<li>PBMCsを軽く攪拌し、4°Cで1000万個の細胞あたり5分間溶液を保存します。</li>
	<li>1000万PBCsあたり30μLのランニングバッファと20 μLのパンTセルマイクロビードカクテルを追加します。</li>
	<li>PBMCsとビーズを十分に混ぜ、4°Cでさらに15分間インキュベートします。</li>
	<li>実行中のバッファを追加して、合計ボリューム500 μLに達します。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って「分離を枯渇させる」設定を使用して、市販のベンチトップ磁気選別装置を備えた一次T細胞を分離します。このステップは、細胞の並べ替え後に5000万から1000万T細胞の間で得るはずです。</li>
	<li>自動細胞カウンターまたはヘモサイトメーターを使用してT細胞を数える。</li>
	<li>T細胞を10mLの無菌PBSおよび遠心分離機で580 x gで4°Cで10分間希釈し、細胞をペレット化する。</li>
	<li>上清を吸引し、Pbsの1mLでT細胞を再懸濁する。</li>
	<li>T細胞を数える実験のために、自動化された細胞カウンターまたはヘモサイトメーターとアリコート100万/mLを使用します。</li>
	<li>PBSで1mg/mLフルオレセイン溶液を調製します。</li>
	<li>処理直前に、1 mg/mLフルオレセイン溶液をT細胞溶液1 mLあたり1mL(最終フルオレセイン濃度=100μg/mL)添加します。</li>
	<li>ステップ3.11で前述したように超音波造影剤溶液の25 μLを加える。</li>
	<li>アクロス流体系を用いた細胞の1mLアリコートを処理する(ステップ2.10-2.11参照)。このステップは、原発性T細胞へのフルオレセインの送達を増強する。</li>
	<li>処理直後に、580 x gで500 μLのPBSで500 μinの遠心分離を経て細胞を3回洗浄し、細胞外フルオレセインを除去します。フルオレセイン溶液を添加した後、細胞を10分以内に洗浄する必要があります。</li>
	<li>最終洗浄工程の後、250μLのPBSで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターの蛍光を測定します。</li>
</ol>5. A549肺癌細胞の調製
<ol><li>培養A549(腺癌性ヒト肺胞基底上皮)細胞は、完全なDMEM培地(10%ウシ血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)で37°C及び5%CO2を平底組織培養フラスコで。</li>
	<li>A549細胞は70~90%の合流に達すると収穫します。フラスコから吸引媒体を吸引し、細胞をPBSで一度洗浄して血清タンパク質を除去する。</li>
	<li>トリプシン(0.25%)EDTAをフラスコに加え、37°Cで5分間インキュベートします。 トリプシンは、細胞が組織培養フラスコの底面から剥離する消化酵素である。</li>
	<li>トリプシン溶液を15mL遠心管に移し、完全なDMEM培地を1:3比で添加して中和します。</li>
	<li>4°Cで5分間1,500xgで遠心分離を介して細胞をペレット化する。</li>
	<li>上清を吸引し、15 mL円錐バイアルで200 mMトレハロースを含むPBS溶液中の100,000/mLの濃度でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>ステップ3.11で前述したように超音波造影剤溶液の25 μLを加える。</li>
	<li>アクロス流体系を用いた細胞の1mLアリコートを処理する(ステップ2.10-2.11参照)。このステップは、A549肺癌細胞へのトレハロースの送達を増強する。</li>
	<li>処理直後に、500μLのPBSで遠心分離を経て細胞を3回洗浄し、細胞外トレハロースを除去する。細胞はトレハロース溶液を添加した後、10分以内に洗浄する必要があります。</li>
	<li>最終洗浄工程後、100μLのPBSで細胞を再懸濁します。</li>
	<li>1%トリトンX-100溶液の11 μLを溶解細胞に加え、細胞内トレハロースを放出します。</li>
	<li>ボルテックスを15sで、室温で30分間インキュベートする。</li>
	<li>ボルテックスを再び15sに対して、製造者の勧告に従って市販のトレハロースアッセイを用いてトレハロース濃度を測定する。</li>
</ol>

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共著者のMAMとJAKは、この研究に関連する製品から財政的に利益を得る可能性のあるDesiCorpの所有権を保有しています。

このプロトコルは、研究用途のための生体分子の細胞内送達を増強する低コストのアクロス流体系の組み立てと動作を記述する。このシステムを組み立てて操作する際に考慮すべき重要な要素がいくつかあります。このアヌースト流体デバイスはPDMSで製造されており、これは一貫したチャネル寸法27で容易に成形できる生体適合性材料である。装置チャネルは培養細胞との作業の際に無菌性を高めるために、アヌースト流体処理の前に15 mLの70%エタノール溶液でリンスすることができる。エタノール洗浄後、15 mLの脱イオン水を使用して、細胞溶液を添加する前にチャネルから残留エタノールを除去するために装置をすすいでください。小さいアフューソー流体チャネルは、破片や細胞凝集体によって容易にブロックされ、これは装置の頻繁な使用のための制限を作る。各サンプル間のチャネルを十分にすすい取ると、チャネルの閉塞の問題を防ぐことができます。さらに、各バッチで複数のPDMSデバイスを製造できるため、必要に応じて迅速に交換できます。超音波ベースのアプリケーションでは、PDMSの厚さの違いが流体チャネル内の超音波圧力に影響を与える可能性がありま...

ウイルスおよび非ウイルスプラットフォームは、細胞への分子送達を増強するために利用されてきた。ウイルス送達(伝達)は、ゲノム修飾を必要とする細胞ベースの治療法で利用される一般的な技術である。ウイルス送達に関する制限は、潜在的な挿入突然変異誘発、限られたトランスジェニック容量、および感染の望ましくない多重度1、2を含む。そのため、非ウイルス分子送達技術は、幅広い生物医学および研究用途に向けて開発中である。一般的な技術は、機械的、電気的、流体力学、または細胞3への生体分子の取り込みを強化するためのレーザーベースのエネルギーの使用を含む。エレクトロポレーションは、分子化合物4、5、6、7、8、9の細胞内送達のために、細胞膜中の一過性穿孔を誘導する能力を有する一般的に使用される非ウイルス性分子送達プラットフォームである。しかしながら、電気ポレーションを介した確率的プロセスおよび分子取り込みである形質膜の過渡性穿孔は、一般的に、一過性膜細孔4、7、8を横切る受動的拡散に依存する。
別の方法は、超音波造影剤(すなわち、ガス充填マイクロバブル)のキャビテーションを介して細胞内分子送達を増強するための超音波の利用である。マイクロバブルキャビテーションは、周囲の媒体にマイクロストリーミング効果を誘導し、近くの血漿膜の過渡穿圧(「ソノポレーション」)を引き起こす可能性があり、受動または活動的な輸送機構10、11、12を介した生体分子の急速な細胞内取り込みを可能にする。ソノポレーションは細胞への迅速な分子送達に有効な技術であるが、このアプローチは、多くの場合、超音波暴露条件13における低いスループットおよび高い変動性によって制限される高価な機器およびバルク処理方法を必要とする。これらの制限に対処するために、懸濁液中の細胞の一貫したソノポレーションを可能にするアクロプト流体デバイスは、現在開発中です。
アクロウス流体は、超音波とマイクロ流体技術を幅広い用途に統合した拡大分野です。このアプローチは、流体チャネル14、15、16、17内の立ち位置音響波を誘導するために連続的な超音波エネルギーを適用することによって粒子分離のために以前に使用されてきた。パーティクルは、粒子サイズ、密度、および媒体16に対する圧縮性などのさまざまな特性に基づいて、デバイスの異なる部分に向かってソートされる。アキュスト流体技術は、細胞療法18の研究用途および製造のための様々な細胞タイプへの迅速な分子送達を可能にする開発中である。最近、PDMS系アユースト流体装置19を用いて赤血球への分子送達を増強することを実証した。アシュー流体プラットフォームでは、細胞とマイクロバブルのダイナミクスを操作して、生体分子の送達を強化する物理的相互作用を誘導することができます。細胞内の分子送達の効率と一貫性は、細胞とマイクロバブルの距離を最適化することによって、潜在的に増加させることができます。
アクロス流体媒介ソノポローションの重要なアプリケーションの1つは、生体分子を原発ヒトT細胞に輸送することを含む。キメラ抗原受容体T細胞(CAR T)療法などの養子T細胞転移に基づく免疫療法は、HIV20などの癌およびウイルスを含む様々な疾患の治療のために急速に出現している。CAR T療法は小児急性リンパ芽球性白血病(ALL)患者において特に有効であり、完全寛解率は70-90%21である。しかしながら、これらの治療法のT細胞製造は一般に、潜在的な挿入突然変異誘発によって制限されるウイルス伝達に依存し、長い処理時間、およびタンパク質または小分子などの非遺伝的生体分子を送達するという課題1。アキュスト流体媒介性分子送達方法は、これらの制限を克服し、T細胞療法の製造を改善する可能性がある。
アソウス流体媒介ソノポレーションのもう一つの重要なアプリケーションは、凍結および乾燥中に細胞を保護するトレハロースのような防腐剤化合物の細胞内送達を含む。トレハロースは、自然の中でいくつかの生物によって生成され、彼らは彼らの細胞膜22、23を保護することによって凍結と乾燥を許容するのに役立ちます。しかし、トレハロースは哺乳動物細胞によって産生されず、哺乳類細胞膜に対して不浸透性である。したがって、内部細胞膜を保護するために必要な十分な細胞内トレハロースレベルを達成するためには、ソノポレーションなどの効果的な分子送達技術が必要です。このアプローチは、現在、様々な細胞タイプの乾燥保存のために開発中である。
このプロトコルは、マイクロコントローラによって駆動される比較的低コストのアクロス流体システムの組立と動作の詳細な説明を提供します。超音波造影剤は、流体チャネル内のソノポレーションを誘導し、T細胞および癌細胞を含む様々な細胞タイプへの迅速な分子送達を可能にするために利用される。このアインクルード流体システムは、様々な研究用途に使用することができ、また、改善された細胞療法の製造プロセスのためのソノポレーション方法を評価するためのプロトタイプシステムとして有用であり得る。

<table><tbody><tr><td>音響流体デバイスのFabrication of Acoustofluidic Device</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOW SYLGARD 184 シリコーン封止材透明0.5 KG KIT</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862 (SKU)</td><td>https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/</td></tr> <tr><td>Harris Uni-Core (2.5 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>69039-25</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Tube - S (2/4 port)</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KPT-S-2 (SKU)</td><td>https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port</td></tr><tr><td>Microscope Slide</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td>https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium</td></tr><tr><td>trichlorosilane 用</td><td>Gelest</td><td>105732-02-3 (CAS番号)</td><td>クロロシランは非常にハザラドで可燃性です。曝露すると、重度の火傷や目の損傷を引き起こします。&nbsp;</td></tr><tr><td>タイゴンPVC軟質プラスチックチューブ(1/16 "ID、1/8 "OD)</td><td>McMaster-Carr</td><td>5233K51(パート#)</td><td></td></tr><tr><td>https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/Acoustofluidicシステムのアセンブリ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno</td><td>Arduino</td><td>7630049200050(バーコード)</td><td>https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3</td></tr><tr><td>超音波造影剤の調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DSEPC)</td><td>アバンティリピッド</td><td>890703P-25mg(SKU)</td><td>https://avantilipids.com/product/890703</td></tr><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)</td><td>アバンティリピッド</td><td>850365P-25mg(SKU)</td><td>https://avantilipids.com/product/850365</td></tr><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(DSPG)</td><td>Avanti Lipids</td><td>840465P-25mg(SKU)</td><td>https://avantilipids.com/product/840465</td></tr><tr><td>APF-140HP(デカフルオロブテートガス)</td><td>FlouroMed</td><td>355-25-9(CAS番号)</td><td>http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/</td></tr><tr><td>DB-338 アマルガメーター&nbsp;</td><td>COXO</td><td></td><td>https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/</td></tr> <tr><td>ポリオキシエチレン40ステアリン酸&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P3440-250G (SKU)</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB</td></tr><tr><td>Q125 Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110 (参照)</td><td></td></tr><tr><td>Primarty T細胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoMACsランニングバッファー</td>の https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r調製 <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221 (注文番号)</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref</td></tr><tr><td>Pan T細胞単離キット、ヒト(Pan T細胞ビオチン抗体カクテル&パンT細胞マイクロビーズカクテル)&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-535(注文番号)</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535</td></tr><tr><td>磁気セルソーター(autoMACS Pro Separator)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545 (注文番号)</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545</td></tr><tr><td>A549肺がん細胞の調製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トレハロースアッセイキット&nbsp;</td><td>メガザイム</td><td>K-TREH(Cat.いいえ。</td><td>https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit</td></tr><tr><td>トリパンブルー (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile)</td><td>VWR</td><td>97063-702 (Cat.いいえ。</td><td>https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile</td></tr></tbody></table>

細胞への分子化合物の送達を強化するためのアキュトー流体デバイスの組立と操作

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

生体内での効率的な送達は、幅広い生物医学研究や細胞ベースの治療用途に必要です。超音波介在性ソノポレーションは、生体分子の細胞内送達を迅速に行うための新たな技術です。ソノポレーションは、ガスで満たされたマイクロバブルのキャビテーションが近くの細胞膜で一過性の細孔を形成し、周囲の流体からの生体分子の迅速な取り込みが可能になると起こります。懸濁液中の細胞のインビトロ超音波処理のための現在の技術は、遅いスループット、各細胞の超音波暴露条件の変動、および高コストによって制限される。これらの制限に対処するために、超音波造影剤と組み合わせてチャネルを流れる細胞の一貫したソノポレーションを誘導するために、PDMSベースの流体デバイスに超音波トランスデューサを統合する低コストのアクロス流体デバイスが開発されました。この装置は、PDMSベースの流体チップを製造するために標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して製造される。超音波ピエゾディスクトランスデューサは、デバイスに取り付けられ、マイクロコントローラによって駆動されます。アセンブリは3Dプリントされたケースの内部に組み込まれ、保護を強化することができます。細胞およびマイクロバブルは、シリンジポンプまたはPVCチューブに接続された蠕動ポンプを使用してデバイスを介して押し出されます。生体分子のヒトT細胞および肺癌細胞への送達が増強され、このアバイオス流体系で実証される。一括治療アプローチと比較して、このアクロス流体システムは、スループットを増加させ、変動性を低減し、生物医学研究アプリケーションおよび細胞ベースの治療薬の製造のための細胞処理方法を改善することができます。

図 1に、3D プリントされたケースの内部に組み立てられたアクロス流体システムの画像を示します。このプロトコルは、超音波造影剤を使用して複数の細胞株における細胞内分子送達を増強するために使用することができるアキュソース流体システムを生成する。
図 2  は、未治療の対照群(p&lt;0.05,n=3/群)と比較して、アヌースト流体処理を行う原発ヒトT細胞への蛍光化合物フルオレセインの細胞内送達を強化したものである。T細胞は、100μg/mLフルオレセイン溶液と25μL/mL超音波造影剤溶液を用いてPBS中で100万/mLの濃度で懸濁し、混合物を超音波治療用のアキソース流体装置を通過させた。細胞内フルオレセイン送達及び細胞生存率を遠心分離を介して細胞を洗浄した後のフローサイトメトリーで測定し、細胞外フルオレセインを除去した。未治療対照群のT細胞も100μg/mLフルオレセイン溶液でPBSで100万/mLで懸濁された...

このプロトコルは、超音波造影剤によって誘発されるソノポレーションを介して細胞に迅速に分子送達するための低コストのアユースト流体デバイスの組み立ておよび動作を記述する。

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. ...

このプロトコルは、様々な研究および細胞ベースの治療アプリケーションのために生体分子を効率的に送達できるアクロス流体系の組み立てと操作を記述する。このシステムの主な利点は、生体分子を細胞に迅速に送達し、その生存率を維持できることです。がん治療など、さまざまな細胞治療用途に細胞を形質転換できるプラットフォーム技術です。カップにPDMSベースの54グラムと治癒剤の6グラムを組み合わせることから始めます。少なくとも1分間、ヘラと激しく十分に混ぜ合わせ、約30分間、または残気泡が取り除かれるまで、PDMS溶液を付けたカップをデシケータに入れます。150ミリメートルのペトリ皿に上向きのパターンを持つフォトレジストコーティングウエハースを置き、次にPDMS溶液を金型の上に注ぎます。必要に応じて、ペトリ皿をデシケータの中に入れ、残された気泡が消えるまで真空を適用します。ペトリ皿をラボオーブンに移し、60°Cで2時間焼いてPDMSを治します。硬化後、ウエハの端をカミソリの刃で切り取って、ペトリ皿からPDMSを慎重に取り除きます。ナイフまたはカミソリの刃を使用して個々のデバイスを切り取り、2.5ミリメートルの生検パンチを使用して入口と出口ポートに穴を開けます。PDMSデバイスを酸素プラズマで処理した後、すぐに各デバイスをガラス表面に向けたチャネルを備えたきれいなソーダライムガラス顕微鏡スライドに置きます。デバイスが室温で一晩接着できるようにします。直径1~2ミリメートルの直径1センチメートルのピエゾトランスデューサーの表面にシリコーンをそっと塗布し、その後、トランスデューサを同心渦巻きに慎重に合わせ、ガラス顕微鏡スライドの底にそっと押し付けます。USB AからBのケーブルを使用して、マイクロコントローラをコンピュータに接続します。緑色の電源LEDインジケータが点灯するはずです。コンピュータ上の関連ソフトウェアを使用して、8メガヘルツ信号を生成するプログラムをアップロードします。PZT トランスデューサの各ワイヤの端に 1 インチ 22 ゲージ ワイヤをはんだ付けします。次に、それを使用して、PZTトランスデューサのマイナス端子線をGNDピンに接続します。PZTトランスデューサの正の端子線をはんだ付きワイヤーを介して出力ピンに接続します。タイゴンPVCソフトプラスチックチューブの3〜6インチのセクションをカットし、入口と出口ポートにチューブを押します。開口部に収まるまで圧力をかけながらチューブを回転させる必要があるかもしれません。必要に応じて、接着は、PDMS とチューブを結合するために接合部で適用することができます。オプションで、アヌースト流体デバイスとマイクロコントローラを3Dプリントケースに取り付けます。メーカーの指示に従ってマイクロ流体貯留層を組み立てます。1/16インチ内径タイゴンPVCソフトプラスチックチューブの3〜6インチのセクションをカットし、マイクロ流体貯留層の出力から1/32インチ内径チューブの上に押し込みます。必要に応じて、漏れを防ぐためにパラフィンフィルムで接合部を包みます。マイクロ流体貯留層の側面に周囲の空気で60ミリリットルのシリンジを充填します。シリンジポンプを1時間あたり200ミリリットルの速度に設定し、1時間あたり50ミリリットルの体積流量でアクロ流体デバイスを介して造影剤溶液を押し出し、デバイスの出力から50ミリリットルの遠心分離管にサンプルを収集します。25ミリグラムのDSPC、11.6ミリグラムのDSEPC、0.26ミリグラムのDSPG、および0.88ミリグラムのポリオキシエチレン40ステアリン酸を加えることによって、20ミリリットルのシンチレーションバイアルでリン脂質溶液を調製します。すべてのリン脂質が溶解するまでクロロホルムを加えます。乾燥剤でクロロホルムを48時間蒸発させて、乾燥した脂質膜を形成する。10ミリリットルの無菌PBSで泡を水分補給し、40%振幅で3分間脂質溶液を超音波処理してカチオンミセル溶液を形成する。超音波処理後、リン脂質溶液は摂氏2~6度で最大1ヶ月間保存できます。超音波造影剤を調製するには、2ミリリットルガラス中隔バイアルに滅菌PBSの600マイクロリットルにカチオンミセル溶液の200マイクロリットルを追加します。キャップを圧着してバイアルを密封します。1.5インチ20ゲージ針を使用して、バイアルヘッドスペースにデカフルオロブタンガスを30秒間充填します。バイアルをアマルガメートしてパーフルオロブタンガス充填超音波造影剤を形成する。細胞溶液1ミリリットルあたり超音波造影剤溶液の25マイクロリットルを追加します。次に、直ちにアヨス流体装置を介して結合された造影剤と細胞混合物をポンプで送り出す。このプロトコルは、複数の細胞株における細胞内分子送達を高めるために使用できるアキュトー流体系を生成する。蛍光化合物の細胞内送達は、フルオレセイン、一次ヒトT細胞への、未治療対照群と比較してアヌースト流体処理により改善された。T細胞の蛍光強度は治療後5倍に増加し、フルオレセインの送達が増強されたことを示す。細胞生存率は、アソ流体処理後にわずかに減少したが、未治療の対照群の単独および細胞へのフローと比較して、ヒトA549肺癌細胞への防腐化合物トレハロースの細胞内送達を増強した80%アコウスト流体治療を強化した。カチ素マイクロバブルを細胞溶液に追加することが重要です。生体分子の細胞内送達は、カチオンマイクロバブルを溶液に入れずに制限されます。このプラットフォームは、様々な生体分子の細胞内送達を可能にし、研究や治療目的のために細胞機能を変化させる可能性があります。この手順を完了した後、追加の細胞特性評価を行い、様々な生体分子を送達する影響を評価することができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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