哺乳類精子細胞の原形質膜を横切る電流の記録

パッチクランプ技術を用いた精子細胞の電気活動記録は、さまざまな精子イオンチャネルの同定や分子レベルでの精子電気生理学の理解に非常に重要でした。この方法はイオンチャネルの電気生理学的および薬理学的指紋測定に優れており、イオンチャネル同定において最も信頼性の高いツールです。イオンチャネルや電気生成トランスポーターが男性の生殖能力に生理的に重要であることを考えると、この技術は不妊を引き起こす特定の精子の異常を理解するための強力なツールです。

マイクロピペット製造では、外径1.5ミリメートル、内径0.86ミリメートルのホウケイ酸ガラス毛細管と内部フィラメントから始めます。ファイアポリッシュ前はピペットチップの内径を約2マイクロメートルにし、適切な研磨後は0.5マイクロメートルに縮小してください。基準電極周辺の環境を安定させるために寒天橋を組み立てます。

小さなブンゼンバーナーの火で曲げてL字型のガラス毛細管を作り、冷ます。1%アガロースを塩化カリウム1モルに溶かし、電子レンジで加熱してアガロースが溶けて透明になるまで加熱します。気泡を避けるために、L字型のガラス毛細管にアガロースを慎重に満たし、室温まで冷ます。

あるいは、L字型のガラス毛細管を溶かしたアガロースに浸す方法もあります。容器を何度か回してから電子レンジで加熱し、アガロースが沸騰するまで加熱します。これにより寒天橋から気泡が排出されます。ハサミでマウスの下腹部を開け、両方の上精巣上腺を抜き取ります。

35ミリの細胞培養皿に、室温に予温された高塩水またはHS溶液を入れます。副上体ジミデスをHS溶液を含む新しい細胞培養皿に移し、残留脂肪を完全に除去します。15番のメス刃で、上体をカプット、コーパス、カウダに分けます。

各精巣上体細胞のコーパスをHS溶液を含む新しい細胞培養皿に移します。尖った番号11のメス刃を使って、孤立した精巣上体部分に複数の切開を入れます。複数の切開を経た上体上体ディミドの部位を、1.5ミリリットルのHS溶液を含む1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。

精巣上腺から精巣上腺の精子細胞を、Superfine Dumont Type 5A鉗子を使って溶液に短時間振動させます。その後、エピジジミドを捨て、チューブを室温に10分間置いてください。固体がチューブの底に沈殿するまで待ちます。

その後、上清液を別の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。600倍の倍率で細胞質液滴を持つ適切な精子を見つけてください。細胞質液滴が楕円形で、やや細長い紡錘状の形状であることを確認しましょう。

頭部がカバースリップに取り付けられ、精子細胞が部分的に固定されているが、細胞質の滴と鞭毛の残りの部分は鞭毛の打動とともに動き続ける、運動性のある精子を選びます。精子の頭部がカバースリップにゆるく付着していることを確認してください。適切な形態を持つ精子を視覚的に選択した後、マイクロピペットにピペット溶液を満たし、ピペットホルダーに固定します。

ピペットの先端をゴミから清潔に保つために、Uチューブ型のアセンブリを使ってピペットに正圧をかけます。ピペットを下ろし、先端を浴液に浸します。細胞を明確にイメージするために、ピペットの先端を細胞質液滴の上に位置させ、先端の開口部が液滴に斜めに向かうようにします。

ピペットの先端を素早く液滴に近づけ、同じ焦点面に合わせます。ピペットの先端が液滴に触れたらすぐに負圧をかけ、液滴の一部をチップ内に移動させてギガオームシールを形成します。次に、カバースリップから精子を持ち上げます。

アンプの補償モードを使って迷線容量の過渡性を補償し、その後セルモードに移行します。1ミリ秒を加え、徐々に電圧パルスを増加させ、非常に軽い吸引を組み合わせてブレイクインを行い、セルモードに移行します。各ブレイクイン電圧パルスを適用した後、膜試験ツールを起動して、より大きな静電容量の過渡性が現れるかどうかを確認します。

大きな静電容量の過渡性を適合させて、セル全体の静電容量とアクセス抵抗を決定します。慣らしが成功した後は、異なる化合物を含む様々な浴液を適用したり、電圧ステップや電圧ランププロトコルを用いたチャネル活動の測定など、計画された全セルパッチクランプ実験を進めます。CatSper記録は、パッチピペットと哺乳類精子の細胞質滴との間に高い抵抗性シールを確立することで行われました。

セシウム全細胞CatSper電流の密度は、尾の野生型ニューロン精子細胞およびCatSper欠損尾部ニューロンの精子細胞から記録されました。異なる種の精子細胞は形態や内部調節経路が多様です。霊長類と人間の精子は類似したCatSperチャネル特性と調節を示しました。

興味深いことに、CatSperのプロゲステロン活性化は霊長類精子において特有のようです。イノシシ、雄牛、齧歯類の精子は、CatSper電流にプロゲステロン刺激による変化を示しませんでした。雄牛およびイノシシの精子においても、基底のCatSperチャネル活動も検出可能な限界以下であり、カルシウムの流入とそれに伴う過剰活性化は他のチャネルやトランスポーターによって引き起こされているか、あるいはCatSperチャネルの活性化には別の自然刺激因子が必要であることを示唆しています。

小さく滑らかで均一で過度に腫れていない細胞質液滴はパッチクランプに最適です。片側の小さな膨張した透明な細胞質液滴は、シールが弱ったり全くできなかったりするので避けるべきです。この技術により、特定の空気チャネルを自然な発現系で詳細に研究でき、成功は高品質で変動する精子細胞、純粋な領域、基本的な知的生理学的スキル、忍耐力、そして何よりも粘り強さにかかっています。