Name: チオグリコール酸(TGA)を用いた植物バイオマスリグニン含量の推定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぼう、チオグリコール酸法を用いた植物バイオマスのリグニン含量推定プロトコル。5段階の工程で少量サンプルから正確に測定可能な信頼性の高い手法を解説します。

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私たちは、この研究の部分的なサポートのために植物土壌科学とコットン社の部門に感謝します。

1. 植物サンプルの調製
<ol><li>温室から生後2ヶ月の綿花を集める(図1A)。</li>
	<li>植物の周りの土を緩めることによって無傷の外側根で土と根を分離するために植物の鉢を穏やかに反転させる(図1B)。</li>
	<li>収集した植物を水で満たされたトレイで十分に洗い、すべての汚れを取り除きます(図1C)。</li>
	<li>ペーパータオルを使用して、分離した根、茎、葉組織を乾燥させ、ラベルを付けます(図1D)。真菌汚染を防ぐために、室温で2日間空気乾燥します(図1E)。</li>
	<li>サンプル組織をラベル付き容器/アルミホイルに移し、温度制御インキュベーターで49°Cで7~10日間インキュベートする(図1F)。 注:温度が高いとリグニン構造が変になることがあります。あるいは、凍結乾燥機を使用して、植物バイオマスに化学変化を起こすことなく1〜2日間サンプルを乾燥させることができます。</li>
	<li>インキュベーター乾燥組織を5mmサイズに切断するか、あるいはバイオマスグラインダーを用いて植物組織を粉砕するために刃を使用する(図1G、図1H)。 注:各サンプルを切断/粉砕した後、バイオマスグラインダー/ブレードを洗浄する必要があります。</li>
	<li>切断された組織/バイオマス接地された植物材料を粉砕バイアルに移し、液体N2を備えた冷凍工場または極低温粉砕機を使用して1mmサイズの細かい粉末に粉砕する。</li>
	<li>10 CPS(各サイクルスパン2分)の割合で3サイクルのサンプルを均一な粉末に粉砕する(図1I、1J、1K)。 注: この時点で実験を一時停止することができ、サンプルは長期保存のために気密容器内の室温で保存することができます。</li>
</ol>2. 水、PSB、メタノールでサンプルを洗浄
<ol><li>リグニン含有量推定に使用されるすべての空の2 mLマイクロフュージチューブの重量を測定し、ラボノートブックに記録します。</li>
	<li>20mgの粉砕サンプル粉末を予め計量したチューブに移します。組織およびティッシュの粉と管を量り、実験室のノートでこれらの重量を記録する。</li>
	<li>ヒートブロックまたはオーブンで20mgの組織粉末を1時間、20mgの組織粉末で2mLマイクロフュージチューブ(開いた蓋付き)をすべてインキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、室温(RT)で10分間サンプルを冷却します。</li>
	<li>各マイクロフュージチューブに1.8mLの水を加え、渦を混ぜて混ぜます。次いで、25,200xg(15,000 rpm)でRTで10分間遠心分離機を10分間、上清を捨て、(図2)。。</li>
	<li>各保持ペレットにタンパク質可溶化バッファー (PSB) (表 1)の 1.8 mL を加え、ボルテックスで混合します。遠心分離機を25,200 x g(15,000 rpm)でRTで10分間、上清を捨てます。</li>
	<li>各サンプルについて、ステップ 2.6 をもう一度繰り返します。</li>
	<li>各ペレットに1.8mLの水を加え、渦を混ぜて、遠心分離機を25,200 x g(15,000 rpm)で10分間混ぜます。遠心後、ペレットを保存し、上清を捨てます。</li>
	<li>保持されたペレットに、1.8 mLのメタノールを加え、60°Cのヒートブロックに20分間インキュベートします。次いで、25,200xg(15,000rpm)で遠心分離機を10分間RTで10分間行う。遠心分離後、上清を捨ててペレットを保持する(図2)。</li>
	<li>各サンプルについて、ステップ 2.9 を再度繰り返します。</li>
	<li>空気はRTでペレットを乾燥させるか、真空乾燥によって直ちに進行する。真空乾燥乾燥器を使用して30°Cで2〜3時間、またはペレットが完全に乾燥するまで乾燥した。 注:実験は、この時点で夜間の空気乾燥によって一時停止するか、真空乾燥によって継続することができます。</li>
	<li>乾燥後、乾燥したペレットでサンプルチューブの重量を量り、ラボノートブックのそれぞれの空のチューブ重量の横に重量を記録します。2つの値を減算してペレットの重量を推定します。これらの重みは、リグニン抽出プロセスの終了時にリグニン推定に使用されます。</li>
	<li>リグニン抽出のこの時点で、リグニン標準曲線の生成のための市販の竹リグニンが含まれる。0.5 mg 単位で 0.5 mg から 5 mg までの範囲の別々のチューブに市販の竹リグニンを測定 (0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg, 5.0 mg).3回の技術的複製のために各濃度を3回測定します。 注:ここから、上記のステップで測定された標準は、乾燥したサンプルと同じ方法で処理されました。</li>
</ol>3. TGAと酸を用いてリグニンを沈殿させるペレットの処理
<ol><li>上記のステップから処理されたサンプルを、測定された標準と共に、TGA(チオグリコール酸)処理に供する。</li>
	<li>各ペレットに3 N HCl(表1)と100μLのTGAを1mL加えます。</li>
	<li>80°Cの予熱熱ブロック内で80°Cの加熱ブロックで3時間、発煙器での渦とインキュベート(図2)。 注:80°Cの加熱工程は監視する必要があります。高圧の蓄積は、蓋を開ける可能性があり、化学物質の流出につながる可能性があります。スクリューキャップチューブは推奨されていますが、このような流出を防ぐための代替として、このステップ中に2 mLチューブを緩くキャップすることができます。</li>
	<li>インキュベーション後、RTで10〜15分間冷却し、遠心分離機を25,200 x g(15,000 rpm)でRTで10分間冷却します。 注:酸と有機溶剤から発生する廃棄物は、換気キャップ付きのガラス容器に分離して保管する必要があります。TGA酸廃棄物と酸廃棄物の収集には、別々のガラス容器を使用してください。</li>
	<li>遠心後、上清を捨ててペレットを保持します。水1mLを加え、渦を巻いて混ぜ、遠心分離機を25,200 x g(15,000 rpm)でRTで10分間混ぜます。</li>
	<li>遠心分離後、上清を捨て、ペレットを37°Cシェーカー/サーマルミキサーで24時間24時間、ペレットを24時間混ぜます(図2)。 注:このインキュベーション時間は1時間7に短縮することができます。</li>
	<li>インキュベーション後、2mLマイクロフュージチューブを25,200 x g(15,000 rpm)でRTで10分間遠心します。 注:手順は、強い酸や自然界で腐食性である他の化学物質の使用を含みます。したがって、適切なPPEを着用することは、リグニン推定のプロセス全体を通じて推奨されます。TGAは、強い不快な臭いを持っており、自然の中で腐食性です。したがって、ヒュームフードでのみ使用することをお勧めします。</li>
</ol>4. リグニンの沈殿
<ol><li>上清を新しい2 mLマイクロフュージチューブに移し、濃縮HClの200 μLを加え、4°Cで4時間または一晩インキュベートする(図2)。 注: この時点で、冷凍工程を夜間まで延長することで、抽出プロセスを一時停止できます。</li>
	<li>遠心分離機を25,200 x g(15,000 rpm)でRTで10分間、1 mLの1 N NaOHに溶解させた。</li>
	<li>10分間RTでシェーカーにインキュベートし、NaOHでペレットを完全に懸濁させる。</li>
	<li>最後に、分光光度計を用いて280nmのサンプルの吸光度を測定し、標準リグニン曲線と比較します。</li>
	<li>キャリブレーション曲線回帰直線値、および抽出したサンプルの吸光度を280nmで使用して、リグニンの未知の濃度を測定します。</li>
</ol>5. サンプル中の標準曲線の調製とリグニン推定
<ol><li>TGA処理の実験サンプルと同じ方法でリグニン標準を処理します。</li>
	<li>0.5 mg、1mg、1.5 mg、2mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mgおよび5mgから始まる0.5mg単位の商業竹リグニン標準を測定する。次いで、TGA、HCl、1 N NaOHに溶解し、続いて280nmで吸光度を測定して処理する(図3A)。</li>
	<li>リグニン濃度と吸光度の測定値を使用して、標準リグニン曲線の散乱プロットを生成する(図3B)。</li>
	<li>散布図で生成された回帰直線y =mx+cを使用して、リグニン標準曲線回帰直線から280nmおよび「m」および「c」値で抽出されたサンプルの平均吸光度から「x」値を使用して調製したサンプルの未知のリグニン含有量の推定に使用する。</li>
	<li>mg(約15mg)でメタノール抽出後の真空/空気乾燥植物バイオマス試料の総重量で得られたy値のリグニン含有量を割り、mg当たりのリグニン濃度を得た。次に、この値に 100 を掛けて、mg 当たりのリグニンパーセントを計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Freudenberg, K., Neish, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreudenberg%2C+K+%22Constitutionand+Biosynthesis+of+Lignin%22">Constitutionand Biosynthesis of Lignin</a>. , Springer-Verlag Inc. New York, NY. 129(1968).</li>
<li>Chio, C., Sain, M., Qin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+utilization%3A+A+review+of+lignin+depolymerization+from+various+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Renewable+and+Sustainable+Energy+Reviews%22%5BJournal%5D)">Lignin utilization: A review of lignin depolymerization from various aspects.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 107, 232-249 (2019).</li>
<li>Sun, Z., Fridrich, B., de Santi, A., Elangovan, S., Barta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+Side+of+Lignin+Depolymerization%3A+Toward+New+Platform+Chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bright Side of Lignin Depolymerization: Toward New Platform Chemicals.</a> Chemical Reviews. 118, 614-678 (2018).</li>
<li>Xu, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXu%2C+F+%22Cereal+Straw+as+a+Resource+for+Sustainable+Biomaterials+and+Biofuels%22">Cereal Straw as a Resource for Sustainable Biomaterials and Biofuels</a>. Sun, R. C. , Elsevier. 9-47 (2010).</li>
<li>Liu, Q., Luo, L., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignins%3A+Biosynthesis+and+Biological+Functions+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lignins: Biosynthesis and Biological Functions in Plants.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19, 335(2018).</li>
<li>Ithal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+transcript+profiling+of+cyst+nematode+feeding+cells+in+soybean+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Developmental transcript profiling of cyst nematode feeding cells in soybean roots.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 20, 510-525 (2007).</li>
<li>Moura, J. C. M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abiotic+and+Biotic+Stresses+and+Changes+in+the+Lignin+Content+and+Composition+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52, 360-376 (2010).</li>
<li>Vanholme, R., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+In+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Lignin engineering.</a> Current Opinion In Plant Biology. 11, 278-285 (2008).</li>
<li>Lupoi, J. S., Singh, S., Parthasarathi, R., Simmons, B. A., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+innovations+in+analytical+methods+for+the+qualitative+and+quantitative+assessment+of+lignin%5BTitle%5D)+AND+%22Renewable+and+Sustainable+Energy+Reviews%22%5BJournal%5D)">Recent innovations in analytical methods for the qualitative and quantitative assessment of lignin.</a> Renewable and Sustainable Energy Reviews. 49, 871-906 (2015).</li>
<li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+thermochemical+analysis+of+high-lignin+feedstocks+for+biofuel+and+biochemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+for+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Identification and thermochemical analysis of high-lignin feedstocks for biofuel and biochemical production.</a> Biotechnology for Biofuels. 4, 43(2011).</li>
<li>Shrotri, A., Kobayashi, H., Fukuoka, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShrotri%2C+A+%22Advances+in+Catalysis%22">Advances in Catalysis</a>. Song, C. 60, Academic Press. 59-123 (2017).</li>
<li>Brunow, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrunow%2C+G+%22Biorefineries-Industrial+Processes+and+Products%3A+Status+Quo+and+Future+Directions%22">Biorefineries-Industrial Processes and Products: Status Quo and Future Directions</a>. 2, 151-163 (2008).</li>
<li>Constant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+structure+and+composition+of+technical+lignins%3A+a+comparative+characterisation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New insights into the structure and composition of technical lignins: a comparative characterisation study.</a> Green Chemistry. , (2016).</li>
<li>Shimada, N., Tsuyama, T., Kamei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Determination+of+Thioglycolic+Acid+Lignin+for+Various+Biomass+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mokuzai+Gakkaishi%22%5BJournal%5D)">Rapid Determination of Thioglycolic Acid Lignin for Various Biomass Samples.</a> Mokuzai Gakkaishi. 65, 25-32 (2019).</li>
<li>Li, X., Weng, J. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+biomass+through+lignin+modification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%3A+For+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Improvement of biomass through lignin modification.</a> The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 54, 569-581 (2008).</li>
<li>Ponnusamy, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+lignin+structure%2C+pretreatments%2C+fermentation+reactions+and+biorefinery+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">A review on lignin structure, pretreatments, fermentation reactions and biorefinery potential.</a> Bioresource Technology. 271, 462-472 (2019).</li>
<li>Hatfield, R., Fukushima, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+Lignin+Be+Accurately+Measured%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Science%22%5BJournal%5D)">Can Lignin Be Accurately Measured.</a> Crop Science. 45, 832-839 (2005).</li>
<li>Bolker, H., Somerville, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+spectroscopicstudies+of+lignin+in+solid+state.+I.+Isolated+lignin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Tappi+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet spectroscopicstudies of lignin in solid state. I. Isolated lignin preparations.</a> Tappi Journal. 72, 826-829 (1962).</li>
<li>Fergus, B. J., Goring, D. A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+lignin+in+birchwood+as+determined+by+ultraviolet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Holzforschung%22%5BJournal%5D)">The distribution of lignin in birchwood as determined by ultraviolet microscopy.</a> Holzforschung. 24, 118-124 (1970).</li>
<li>Schultz, T. P., Templeton, M. C., McGinnis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+lignocellulose+by+diffuse+reflectance+Fourier+transform+infrared+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of lignocellulose by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 57, 2867-2869 (1985).</li>
<li>Dence, C. W. The Determination of Lignin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDence%2C+CW+%22Methods+in+Lignin+Chemistry%22">Methods in Lignin Chemistry</a>. Lin, S. Y., Dence, C. W. , (1992).</li>
<li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+chemistry-past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Lignin chemistry-past, present and future.</a> Wood Science and Technology. 11, 169-218 (1977).</li>
<li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+methods+for+lignin+determination+as+a+basis+for+calibration+of+near-infrared+reflectance+spectroscopy+and+implications+of+lignoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different methods for lignin determination as a basis for calibration of near-infrared reflectance spectroscopy and implications of lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li>
<li>Pandey, M. P., Kim, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin+Depolymerization+and+Conversion%3A+A+Review+of+Thermochemical+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Engineering+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Lignin Depolymerization and Conversion: A Review of Thermochemical Methods.</a> Chemical Engineering & Technology. 34, 29-41 (2011).</li>
<li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acetyl+bromide+method+is+faster%2C+simpler+and+presents+best+recovery+of+lignin+in+different+herbaceous+tissues+than+Klason+and+thioglycolic+acid+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The acetyl bromide method is faster, simpler and presents best recovery of lignin in different herbaceous tissues than Klason and thioglycolic acid methods.</a> PLoS One. 9, 110000(2014).</li>
<li>Hatfield, R. D., Grabber, J., Ralph, J., Brei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acetyl+Bromide+Assay+To+Determine+Lignin+Concentrations+in+Herbaceous+Plants%3A+Some+Cautionary+Notes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using the Acetyl Bromide Assay To Determine Lignin Concentrations in Herbaceous Plants: Some Cautionary Notes.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 628-632 (1999).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+determination+of+thioglycolic+acid+lignin+from+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput determination of thioglycolic acid lignin from rice.</a> Plant Biotechnology. 26, 337-340 (2009).</li>
<li>Nakatsubo, F., Tanahashi, M., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidolysis+of+Bamboo+Lignin+II+%3A+Isolation+and+Identification+of+Acidolysis+Products%5BTitle%5D)+AND+%22Wood+research%22%5BJournal%5D)">Acidolysis of Bamboo Lignin II : Isolation and Identification of Acidolysis Products.</a> Wood research. 53, 9-18 (1972).</li>
<li>Aro, T., Fatehi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+Application+of+Lignosulfonates+and+Sulfonated+Lignin%5BTitle%5D)+AND+%22ChemSusChem%22%5BJournal%5D)">Production and Application of Lignosulfonates and Sulfonated Lignin.</a> ChemSusChem. 10, 1861-1877 (2017).</li>
<li>Frei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignin%3A+Characterization+of+a+Multifaceted+Crop+Component%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Lignin: Characterization of a Multifaceted Crop Component.</a> The Scientific World Journal. 2013, 436517(2013).</li>
<li>Lora, J. H., Glasser, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Industrial+Applications+of+Lignin%3A+A+Sustainable+Alternative+to+Nonrenewable+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Polymers+and+the+Environment%22%5BJournal%5D)">Recent Industrial Applications of Lignin: A Sustainable Alternative to Nonrenewable Materials.</a> Journal of Polymers and the Environment. 10, 39-48 (2002).</li>
<li>Wang, R., Zhou, B., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+Preparation+and+Application+of+Lignin-Derived+Polycarboxylic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Study on the Preparation and Application of Lignin-Derived Polycarboxylic Acids.</a> Journal of Chemistry. 2019, 5493745(2019).</li>
<li>Welker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Plant+Biomass+Lignin+Content+and+Composition+for+Biofuels+and+Bioproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Energies%22%5BJournal%5D)">Engineering Plant Biomass Lignin Content and Composition for Biofuels and Bioproducts.</a> Energies. 8, 7654-7676 (2015).</li>
<li>Mendu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+bioenergy+potential+from+high-lignin+agricultural+residue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Global bioenergy potential from high-lignin agricultural residue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 4014-4019 (2012).</li>
<li>Brinkmann, K., Blaschke, L., Polle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Different+Methods+for+Lignin+Determination+as+a+Basis+for+Calibration+of+Near-Infrared+Reflectance+Spectroscopy+and+Implications+of+Lignoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Different Methods for Lignin Determination as a Basis for Calibration of Near-Infrared Reflectance Spectroscopy and Implications of Lignoproteins.</a> Journal of Chemical Ecology. 28, 2483-2501 (2002).</li>
<li>Moreira-Vilar, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Acetyl+Bromide+Method+Is+Faster%2C+Simpler+and+Presents+Best+Recovery+of+Lignin+in+Different+Herbaceous+Tissues+than+Klason+and+Thioglycolic+Acid+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Acetyl Bromide Method Is Faster, Simpler and Presents Best Recovery of Lignin in Different Herbaceous Tissues than Klason and Thioglycolic Acid Methods.</a> PLoS One. 9, 110000(2014).</li>
<li>Iwaasa, A. D., Beauchemin, K. A., Acharya, S. N., Buchanan-Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+stage+of+maturity+and+growth+cycle+on+shearing+force+and+cell+wall+chemical+constituents+of+alfalfa+stems%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of stage of maturity and growth cycle on shearing force and cell wall chemical constituents of alfalfa stems.</a> Canadian Journal of Animal Science. 76, 321-328 (1996).</li>
<li>Arai-Sanoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+Variations+in+Non-Structural+Carbohydrate+and+Cell-Wall+Components+of+the+Stem+in+Rice%2C+Sorghum%2C+and+Sugar+Vane%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Genotypic Variations in Non-Structural Carbohydrate and Cell-Wall Components of the Stem in Rice, Sorghum, and Sugar Vane.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. , 1105072478(2011).</li>
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著者らは、利益相反はないと宣言している。

リグニンは植物の成長と開発に重要な役割を果たし、最近バイオ燃料、バイオエネルギー、バイオ製品の用途について広く研究されています。リグニンは、全ての血管植物二次細胞壁に保存されている芳香族化合物が豊富である。それは、木材パネル製品、バイオ分散剤、凝集剤、ポリウレタンフォーム、回路基板29、30、31の樹脂などの産業用途を有する。紙やパルプ産業から生成されたリグニンのほとんどは、廃棄物として放出されるか、熱生産のために燃やされます。このように、効率的に処理すれば、リグニンは化石燃料ベースの製品32、33およびバイオ電気生産34の両方に代わるものとして利用することができる。したがって、リグニン含有量と組成の正確な推定は、植物種と植物器官の種類に応じて組成が異なるため、産業用途にとって重要です。リ...

リグニンは、植物細胞壁の重要な耐荷重成分の1つであり、地球上で2番目に豊富なポリマーである。化学的には、リグニンは、芳香族ポリマーの自然な再生可能な供給源を形成し、生体材料2、3の天然の再生可能な供給源を形成する高分子量の複合フェノール化合物で構成される架橋ヘテロポリマーである。この天然ポリマーは、植物の成長、発達、生存、機械的支持、細胞壁剛性、水輸送、鉱物輸送、宿泊抵抗、組織および臓器の開発、エネルギーの沈着、および生物および非生物的ストレス4、5、6、7からの保護において重要な役割を果たす。リグニンは主に3つの異なるモノリニョールで構成される:針葉ニル、シナピルおよびp-コマリルアルコールはフェニルプロパノイド経路8、9に由来する。リグニンの量とモノマーの組成は、植物種、組織/器官の種類、および植物の開発の異なる段階に基づいて異なります10.リグニンは、ソースとモノリグノール組成物に基づいて、針葉樹、広葉樹、および草リグニンに大別される。針葉樹は、主に4%p-コマリルと1%のシナピルアルコールと95%の針葉樹アルコールで構成されています。硬質木材は、同じ割合で針葉樹およびシナピルアルコールを有し、一方草リグニンは針葉樹、シナピルおよびp-コマリルアルコール11、12の様々な割合で構成されている。単量体の組成は、細胞壁のリグニン強度、分解、分解、分解、ならびに分子構造、分岐、および他の多糖類13,14との架橋を決定する際に極めて重要である。
リグニン研究は、採餌、繊維産業、製紙産業、バイオエタノール、バイオ燃料、バイオ製品の重要性を増しています。各種化学方法(例えば、臭化アセチル、酸洗剤、クラソン、過マンガン酸酸化)と共に、インストゥルメンタル法(例えば、近赤外(NIR)分光法、核磁気共鳴(NMR)分光法、および紫外線(UV)分光法)を用いた9,17。リグニンの分析方法は、一般に電磁放射、重力測定、および溶解度に基づいて分類される。電磁放射によるリグニン推定の原理は、特定の波長で光を吸収するリグニンの化学的性質に基づいていました。これらの結果は、リグニンが炭水化物よりも強いUV吸光度を有するという原理に基づいて推定された。1962年、ボルカーとサマヴィルは、塩化カリウムペレットを使用して、木18のリグニン含有量を推定しました。しかし、この方法は、非リグニンフェノール化合物の存在および適切な絶滅係数の欠如による草本サンプルからのリグニン含有量の推定に欠点がある。1970年、ファーガスとゴリングは、グアイアシルおよびシリンギル化合物吸収マキシマが280nmおよび270nmであることを発見し、ボルカーおよびサマヴィル法19の絶滅係数問題を修正した。その後、フェノールを特徴付けるための高感度技術である赤外線分光法が、少量の植物バイオマスサンプルによるリグニン推定にも用いられた。このような技術の一例は、拡散反射率フーリエ変換分光測定であった。しかし、この方法はUV法20と同様の適切な標準を欠いている。その後、リグニン含有量はNIRS(近赤外分光法)およびNMR(核磁気共鳴分光法)によって推定された。しかし、これらの方法には欠点があり、リグニンの化学構造を変えない、その純度20を保持する。
重量測定クラソン法は木質茎のリグニン推定のための直接かつ最も信頼できる分析方法である。重量測定リグニン推定の基礎は、非リグニン化合物の加水分解/可溶化と、重力測定21のための不溶性リグニンの収集である。この方法では、糖質は、濃縮H2SO4でバイオマスの加水分解により除去され、リグニン残基20,22を抽出する。この方法で推定されるリグニン含量は、酸不溶性リグニンまたはクラソンリグニンとして知られている。Klason法の適用は、植物種、組織タイプおよび細胞壁タイプに依存する。タンニン、多糖類、タンパク質などの非リグニン成分の可変量の存在は、酸不溶性/可溶性リグニン含量の推定における比例差をもたらす。したがって、クラソン法は、木質茎17、23などの高リグニン含量バイオマスのリグニン推定にのみ推奨される。臭化アセチル(AcBr)、酸不溶性リグニン、チオグリコール酸(TGA)などの溶解方法は、様々な植物バイオマス源からのリグニン含有量の推定に最も一般的に使用される方法である。Kim et al. は、可溶化によるリグニン抽出のための 2 つの方法を確立した。第1の方法は、セルロースとヘミセルロースを可溶化して不溶性残基としてリグニンを抽出し、第2の方法は、リグニンを可溶性画分で分離し、セルロースとヘミセルロースを不溶性残基として残す。
溶解度に基づくリグニン推定に用いられる類似の方法は、チオグリコール酸(TGA)および臭化アセチル(AcBr)法25である。TGAおよびアセチルブロマイド法はいずれも、280nmでの可溶化リグニンの吸光度を測定することによってリグニン含有量を推定する。しかしながら、AcBr法はリグニン可溶化の過程でキシランを分解し、リグニン含量26の誤った増加を示す。チオグリコレート(TGA)法は、TGAとリグニンのベンジルアルコール基のチオエーテル群との特異的結合に依存するので、より信頼性の高い方法である。TGA結合リグニンは、HClを用いて酸性条件下で沈殿し、リグニン含量は280nm27での吸光度を用いて推定される。TGA法は、構造修飾の少ない、リグニン推定の可溶性形態、非リグニン成分からの干渉が少なく、TGAとの特異的結合によるリグニンの正確な推定という付加的な利点を有する。
このTGA法はリグニン含量推定に用いられる植物バイオマス試料の種類に基づいて修飾される。ここでは、稲わらのTGA法を綿組織に変更 ・適応し、リグニン含有量を推定した。簡単に言えば、乾燥粉末植物試料を、タンパク質可溶化緩衝液及びメタノール抽出を行い、タンパク質およびアルコール可溶性画分を除去した。アルコール不溶性残基を、酸性条件下でTGAおよび沈殿したリグニンで処理した。市販の竹リグニンを用いてリグニン標準曲線を生成し、回帰直線(y =mx+c)を得た。「x」値はリグニンの平均吸光度値を280nmで使用し、回帰直線から「m」と「c」の値を入力して、綿花植物バイオマスサンプル中の未知のリグニン濃度を計算しました。この方法は5つの段階に分けられます: 1)植物サンプルの調製;2)水とメタノールでサンプルを洗浄;3)TGAと酸を用いてペレットを処理し、リグニンを沈殿させる。4)リグニンの沈殿;5)サンプルの標準的な曲線調製およびリグニン含有量推定。最初の2つの相は、主に、水、PSB(タンパク質可溶化バッファー)およびメタノール抽出が続く植物材料調製物に焦点を当て、アルコール不溶性物質を得る。次いで、TGA(チオグリコール酸)とHClで処理し、第3相においてリグニンと複合体を形成した。最後に、HClを使用してリグニンを沈殿させ、水酸化ナトリウムに溶解して280nm28で吸光度を測定した。

<table><tbody><tr><td>BioSpectrophotometer 動力学</td><td>エッペンドルフ 動力学</td><td>6136000010</td><td>280 nmで吸光度を測定するため</td></tr><tr><td>遠心分離</td>機<td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>遠心分離機用&nbsp; サンプル</td></tr><tr><td>商業用竹リグニン</td><td>Aldrich</td><td>1002171289</td><td>標準曲線の準備に使用されます</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td>フィッシャー科学</td><td>16690382</td><td>で使用されますプロトコル</td></tr><tr><td>ファルコンチューブ</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>溶液用容器</td></tr><tr><td>冷凍庫ミル</td><td>Spex サンプル調製</td><td>68-701-15</td><td>植物組織サンプルの微粉砕用</td></tr><tr><td>ヒートブロック/サーマルミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>13527550</td><td>リグニン抽出中の温度制御ステップ用</td></tr><tr><td>ホットプレートスターラー</td><td>ウォルター</td><td>WP1007-HS</td><td>溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>塩酸(HCL)</td><td>シグマ221677</td><td></td><td>プロトコルに使用</td></tr><tr><td>インキュベータ</td>ー <td>フィッシャーブランド</td><td>150152633</td><td>植物組織サンプルの徹底的な乾燥に</td></tr><tr><td>測定スケール</td><td>メトラー・トレド</td><td>30243386</td><td>植物組織の重量、標準、マイクロチューブの測定に</td></tr><tr><td>メタノール (100%)</td> <td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>67-56-1</td><td>プロトコルに使用</td></tr><tr><td>マイクロチューブ(2mL)</td><td>マイクロ遠心分離</td>機 <td>Z628034-500EA</td><td>リグニン抽出用容器</td></tr><tr><td>植物バイオマスジェリンダー</td><td>ハンヒェン</td><td>アマゾン</td><td>乾燥サンプルの粉砕に使用</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AE150</td><td>リグニン抽出用に調製された溶液のpH測定</td></tr><tr><td>温度制御インキュベーター/オーブン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-015-2633</td><td>プロトコルで使用されます</td></tr><tr><td>チオグリコール酸(TGA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68-11-1</td><td>プロトコルに使用</td></tr><tr><td>真空乾燥機</td><td>エッペンドルフ</td><td>22820001</td><td>サンプルの乾燥に使用</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>3340001</td><td>サンプルの適切な混合に</td></tr></tbody></table>

チオグリコール酸(tga)を用いた植物バイオマスリグニン含量の推定

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

リグニンは、セルロースに次いで地球上で2番目に豊富なポリマーである天然ポリマーです。リグニンは、主に植物二次細胞壁に堆積し、主に重要な工業的重要性を有する3つのモノリニョールで構成される芳香族ヘテロポリマーである。リグニンは植物の成長と開発に重要な役割を果たし、生物および非生物的ストレスから保護し、動物飼料、木材、および工業用リグニン製品の品質において保護します。リグニン含量の正確な推定は、リグニン生合成の基本的な理解とバイオマスの産業応用の両方に不可欠です。チオグリコール酸(TGA)法は、植物バイオマス中のリグニン含有量の合計を推定する信頼性の高い方法です。この方法は、アルカリ性条件に可溶性であり酸性条件に不溶であるリグニンのベンジルアルコール基を有するチオエーテルを形成することによってリグニン含有量を推定する。総リグニン含有量は、市販の竹リグニンから生成された標準的な曲線を使用して推定される。

2つの異なる綿の実験ラインを、異なる組織におけるリグニン含分の違いについて比較した。各試料の抽出リグニン含量を280nmで測定し、それぞれの吸光度値を記録した。各生物学的複製の平均吸光度値をリグニン標準曲線の回帰線と比較した(表2、図3C)。回帰直線 y = mx + c は、抽出された実験線の未知のリグニン含有量を計算するために使用されます, サンプル 1 とサンプル 2.平均OD値の結果は「x」に置換され、一方、「m」および「c」値はリグニン標準曲線の回帰線から差し込まれ、mgでリグニン濃度"y"を得た(表3、図3B)。次のステップでは、リグニン含量の1mg当たりを計算し、メタノール抽出後に「y」値をサンプルの重量(15mg)で割った。次のステップでは、グラム当たりの計算(= 1,000 mg)に対してy/15値に1,000を掛けた。リグニンの % を取得するには、y/15 値を 1,000 で除算し、100 を掛けます。3つの生物学的複製(各ライ...

ここでは、草本植物バイオマスにおけるリグニン含量の推定のための改変TGA法を提示する。この方法は、リグニンと特定のチオエーテル結合を形成することによってリグニン含有量を推定し、リグニン含有量推定のために比較的小さなサンプルを必要とするため、クラソン法よりも有利である。

チオグリコール酸(TGA)を用いた植物バイオマスリグニン含量の推定

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...

リグニンは、3つのモノリニョールから構成される複合ヘテロポリマーです。これは、セルロースの隣に地球上で2番目に豊富なポリマーです。ここでは、リグニン含量の推定に最も信頼性の高い方法であるチオグリコール酸法を示す。この方法は、リグニンがチオエーテル結合を介してチオグリコール酸に結合するという原理に基づいています。さらに、このプロトコルを5つのフェーズに分けた。第1段階では、植物材料を準備します。第2段階では、アルコール不溶性抽出物を分離する。第3段階では、チオグリコール酸および酸性条件を用いてリグニンを沈殿させます。第4段階では、工業用竹リグニンを用いてリグニン標準曲線を調製する。最後に、第5段階では、第4段階で調製した標準曲線を用いてリグニン含有量を推定する。植物材料を回収し、鉢をひっくり返して根を分け、水で十分に洗浄し、2日間空気乾燥し、標識容器に移し、1週間から10日間摂氏49度でインキュベーターにインキュベーターでインキュベーターに入れ込んだ。はさみを使用して、組織をさらに1mm〜3mmサイズに切断する。あるいはバイオマスグラインダーは、植物組織を粉砕するために使用される。根組織を使用する バイオマスグラインダーをオンにして、粉砕した粉末を事前ラベル付き容器に集めます。同様に、幹細胞組織および葉組織についても繰り返す。粉砕された粉は、その後、冷凍工場に置かれ、3サイクルの10 CP速度の速度で冷凍工場を実行する粉砕花瓶にロードされます。20mgの粉砕組織粉末を秤量し、あらかじめ作られた2mlチューブに移す。空のチューブとチューブにティッシュパウダーと、ラボノートブックのティッシュパウダーをメモします。60°Cで開いたキャップでチューブを1時間インキュベートします。インキュベーション後、15,000 RPMの各サンプル渦遠心分離機に1.8mlの水を10分間加えます。上清を捨て1.8mlのメタノールを加えます。ボルテックスとインキュベートは、予熱された摂氏60度ブロックで20分間、15,000RPMで遠心分離機を10分間インキュベートした後に行う。この手順をもう一度繰り返します。遠心分離後、上清を捨て、真空乾燥機のペレットを2〜3時間、またはパレットが完全に乾燥するまで乾燥させます。最後にリグニン含有量を推定するために、ラボノートブックの各チューブの重量を測定し、記録します。また、この時点でトリケートで0.5 mgから4 mgから始まるポジティブコントロール工業用竹リグニンが含まれます。1 mlの通常塩酸を1ml加え、各サンプルボルテックスに100マイクロリットルのグリコール酸を加え、摂氏80度で3時間インキュベートします。3時間後にインキュベーションをラックに移し、10分間冷却します。その後、15,000 RPMで10分間遠心分離機を使用します。遠心分離

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

植物バイオマスは、バイオ燃料の生産に使用できる主要なカーボンニュートラルな再生可能な資源です。植物バイオマスは、主に細胞壁、リグノセルロースと呼ばれる構造的に複雑な複合材料で構成されています。ここでは、コンテンツとポリフェノールリグニンの組成の包括的な分析のためのプロトコルについて説明します。...

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートI：リグニン

植物バイオマスは、バイオ燃料の生産に使用できる主要なカーボンニュートラルな再生可能な資源です。植物バイオマスは、主に細胞壁、リグノセルロースと呼ばれる構造的に複雑な複合材料で構成されています。ここでは、壁由来の炭水化物の含有量と組成の包括的な分析のためのプロトコルについて説明します。...

植物細胞壁の包括的な組成分析（リグノセルロース系バイオマス）パートII：炭水化物

共焦点ラマン顕微鏡法に基づく方法は、ラベルフリー植物細胞壁中のリグニンの可視化と異なる組織、試料や種の木質化の比較に支払うよう提示される。...

ラベルフリーその場で</em植物細胞壁の木化の>イメージング

二本鎖RNA干渉（dsRNAi）技術は、より低い植物リグニン含量にトウモロコシシンナモイル補酵素Aレダクターゼ（ZmCCR1）遺伝子をダウンレギュレートするために採用される。細胞壁からのリグニンのダウンレギュレーションは、顕微鏡分析によって可視化しクラソン法により定量される。ヘミセルロースおよび結晶セルロース中の組成変化を分析する。...

のリグニンダウンレギュレーション<em&gt;トウモロコシ</em&gt; dsRNAiとクラソンリグニン分析によって

植物の細胞壁の構造と化学的特性が評価され、バイオ燃料とバイオマテリアルの理想的な原料を特定します。標準メソッドを大規模なデータセットに適用すると、制限があります。これらのハイスループット前処理法、酵素糖化法、および熱分解分子ビーム質量分析法は、実験時間とコストを削減しながら、大量のバイオマスサンプルを比較します。...

リグノセルロース系バイオマス中の反抗バリエーションのハイスループットスクリーニング：総リグニン、リグニンモノマー、および酵素シュガーリリース

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ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

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高 β-O-4 コンテンツによるリグニンの抽出軽度エタノール抽出と脱重合の収量に及ぼす影響

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有機Catプロセスを用いたリグノセルロース系バイオマスの分画

深いユーテク系溶媒ベースのマイクロ波アシスト前処理は、リグノセルロース分画および高純度リグニン回収のための、緑色で迅速かつ効率的なプロセスです。...

特殊地中海リグノセルロース残基からの超高速リグニン抽出

リグニンとタンニンの定量 31P NMR分析

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新規アルカリリグニンマイクロ/サブミクロン粒子のグリーン合成、特性評価、カプセル化、および放出電位の測定

学ぼう、チオグリコール酸法を用いた植物バイオマスのリグニン含量推定プロトコル。5段階の工程で少量サンプルから正確に測定可能な信頼性の高い手法を解説します。

チオグリコール酸(TGA)を用いた植物バイオマスリグニン含量の推定

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