Name: 圧力量ループ解析によるβ-アドレナリン刺激に対する心臓応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学ぶ マウスを用いた圧力-容量ループ解析による心臓機能評価法。イソプロテレノール刺激でβ-アドレナリン応答を定量的に測定し、遺伝子改変マウスの心収縮力と心不全機構を解明する。

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私たちは、マヌエラ・リッツァル、ハンス=ピーター・ゲンスハイマー、クリスティン・リヒター、そしてハイデルベルク大学のインターファクルテール・バイオメディジニシェ・フォルシュンツィニシュ・フォルシュンセインリヒトゥンのチームに感謝しています。
この研究は、DZHK(ドイツ心臓血管研究センター)、BMBF(ドイツ教育研究省)、バーデン・ヴュルテンベルク州イノベーション・フォン、ドイツ・フォルシュングスゲマイニンシャフト(DFG、ドイツ研究財団)プロジェクトID 239283807 - TRR 152、FOR 2289、共同研究センター(SFB)1118によって支援されました。

すべての動物実験は承認され、カールスルーエ地域評議会とハイデルベルク大学(AZ 35-9185.82/A-2/15、 AZ 35-9185.82/A-18/15、AZ 35-9185.81/G131/15、AZ 35-9185.81/G121/17)は、科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州議会の指令2010/63/EUのガイドラインに準拠しています。このプロトコルに示すデータは、野生型C57Bl6/N雄マウス(17±1.4週齢)から導出される。マウスは、ハイデルベルク医科大学の動物施設(IBF)で特定の病原体のない状態で維持された。マウスは12時間の明暗サイクルで収容され、相対湿度は56~60%、1時間当たり15回の空気変化、室温は22°C+/- 2°Cであった。 これらは、従来のケージII型またはII型に長期間、動物の寝具および組織紙を濃縮として提供した。標準的なオートクレーブ食品とオートクレーブ水は、アドリビタムを消費するために利用可能でした.
1. 器具および薬剤ソリューションの調製
<ol><li>中央静脈カテーテル:マイクロチューブ(0.6mm外径)を約20cm長いカテーテルチューブに切ります。鉗子を使用して、チューブの一端を23ゲージのカニューレの先端に引っ張ります。チューブのもう一方の端を斜めに切り取り、大腿静脈を突き刺すことができる鋭い先端を作成します。</li>
	<li>気管チューブ:挿管チューブのために注射器の取り付けを取り除くために長さ3cmの20ゲージの静脈穿刺カニューレを切断した。<ol>
<li>挿管チューブが換気装置の接続に完全に適合しない場合は、換気装置が接続されているチューブの端にパラフィルムをラップします。接続は、安定し、増粘によって密閉されなければなりません(図1A)。20ゲージの静脈穿刺カニューレの金属ガイドピンを2.7cmに短くし、挿管助剤として使用してください。気管の可視化を容易にする光ファイバーを含む挿管のための洗練されたアプローチもまた、例えばダスと共同研究者16によってよく説明される。</li>
	</ol>
</li>
	<li>挿管に使用する麻酔混合物:200 μLのヘパリン(1000 IU/mL)を0.9%NaClの50 μL、水中油エマルジョンベースの製品から2 mg/mL のエトミデートを750 μL混合します。各マウス(0.1 mg/kg BWブプレノルフィン10mg/kg BWエトミデート)に7μL/g体重(BW)を使用してください。</li>
	<li>筋弛緩剤:100mgのパンクロニウム臭化物を100mLの0.9%NaClに溶解する。マウスごとに体重1.0μL/g(1mg/kg BW)を使用してください。</li>
	<li>イソプロテレノール溶液:100mLのイソプロテレノールを0.9%NaCl(1 μg/μL)に溶解します。次の希釈液を準備し(表1)、それぞれを1mLシリンジで移します。<ol>
<li>希釈液1を得るために、ストック1:1.8を希釈する。希釈2を得るために、ストック1:6を希釈する。希釈3を得るために、希釈1を1:10に希釈する。最後に、希釈2の1:10希釈により希釈4を得る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>15%ハイパートニックNaCl(w/v):ダブル蒸留H2 Oの10 mLで0.9%NaClの1.5 gを溶解し、0.45 μmの細孔シリンジフィルターで溶液をフィルターします。</li>
	<li>12.5%アルブミン溶液の調製(w/v):1.25gのウシ血清アルブミンを10mLの0.9%NaClに溶解する。37°Cで30分間インキュベートします。室温まで冷却し、0.45 μmの細孔シリンジフィルターで溶液をフィルター処理します。</li>
	<li>セットアップの準備:まず加熱プレートをスイッチし、39-40°Cに設定します。 加熱パッドに生理食音を詰め込んだシリンジを置き、圧力量ループ(PVL)カテーテルをシリンジに移します。安定のために使用する前に、少なくとも30分間カテーテルを事前インキュベートします。使用する設定は、1.4-F圧力伝導カテーテル、制御ユニット、および対応するソフトウェアで構成されており、 図1B にグラフィカルに説明されており、プロバイダの参照は 、材料表に記載されています。</li>
</ol>2. 麻酔
<ol><li>ブプレノルフィン(0.1mg/kg BW腹腔内)を挿管する30分前に注入する。</li>
	<li>2.5%のイオブルランであらかじめ飽和したアクリルガラスチャンバーにマウスを入れ、チャンバーのベースに置かれた加熱パッドであらかじめ温めます。</li>
	<li>マウスが眠り(反射の欠如)、10 mg/kgのエトミデートとヘパリン(1,200 IU/kg BW)を含む麻酔混合物(7 mL/kg BW)を腹腔内に注入します。</li>
</ol>3. 換気
<ol><li>麻酔注射の3~4分後に、動物を挿管プラットフォーム(図1C)に移します。マウスは、オペレータに面した後ろ面で歯からぶら下がります。</li>
	<li>鉗子で舌をそっと持ち上げます。グロティスを識別するには、マウスの下顎を第2鉗子でわずかに持ち上げます。</li>
	<li>気管内チューブ(図1A)を気管に入れ、ガイドロッドを取り外します。</li>
	<li>動物を加熱プレートに移し、背面に置き、挿管チューブを小さな動物用呼吸器に接続します。</li>
	<li>呼吸数を53.5 x(体重グラム)-0.26[分-1]に調整し、11±の吸気圧をピークに潮量を1cmH2Oにピークし、2cmH2 OのPEEPを確立する。</li>
	<li>粘着ストリップで加熱プレート上のマウスの四肢を慎重に固定し、乾燥を防ぐために両眼に眼軟膏を塗布します。</li>
	<li>直腸温度プローブを挿入し、コア体温を37±0.2 °Cに保ちます。</li>
	<li>1-リード心電図をインストールし、麻酔の深さと安定性の指標として、オンラインで心拍数を監視します。</li>
	<li>デジタル間反射神経がない場合は、腹腔内の筋弛緩性パンクロニウム臭化物の1mg /kg BWを注入する。これにより、PVL測定中の呼吸アーティファクトを防ぐことができます。</li>
</ol>4. 手術
<ol><li>一般的な推奨事項<ol>
<li>手術中、O2で気化したイソフルランを1.5~2%と換気する。イソフルラン濃度は、マウスの緊張、性別、年齢、体重などの変数にも依存しますが、個別かつ実験的に決定する必要があり、ここでの値はC57BL6/Nマウス株の基準です。重要なことに、換気装置はオペレータがイオブルランを吸入するのを防ぐために抽出システムに接続される。</li>
		<li>手術の手術には、ステレオ顕微鏡から1.5~4倍の倍率を使用してください。 注:非生存手術のための動物の準備に関する制度的/地域的なガイダンスを参照してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>大腿部カヌリンテーション<ol>
<li>70%エタノールで後肢をすすい、左のイングイナル領域を切開し、左大腿静脈を露出させる。</li>
		<li>側頭動脈と静脈を焼灼して下さる。</li>
		<li>カテーテルアクセスに遠位に置かれた縫合糸で大腿静脈をリゲートします。</li>
		<li>大腿静脈の下に縫合糸を渡し、穿刺部位の結び目頭蓋を準備します。1 mL シリンジに取り付けられた、調製したマイクロチューブ(ステップ 1.1 参照)で大腿静脈を穿刺する。</li>
		<li>結び目を結び、容器の中の管を固定します。</li>
		<li>0.9%NaClの注入によって流体損失を打ち消し、自動シリンジポンプで15 μL/minの注入速度で12.5%のアルブミンを補った。さらに、露出した組織を、あらかじめ温めた0.9%NaClを使用して湿気を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>開 胸<ol>
<li>70%エタノールで胸郭をすすい上げる。</li>
		<li>キシポイドプロセスのすぐ下の皮膚を切開し、胸壁から胸部筋肉を鉗子または焼灼でぶっきらぼうに分離する。</li>
		<li>鉗子でキシフォイドプロセスを持ち上げ、横隔膜が下から完全に見えるまで、両側を側面に横方向に切り取ります。</li>
		<li>下から横隔膜を切開し、心臓の頂点を露出します。その後、慎重に鉗子で心膜を除去します。</li>
		<li>前述の6のように左側に限られた視使いを行う。</li>
		<li>下の騎兵静脈の下に縫合糸を渡し、後の段階で予負荷低減を行います。</li>
		<li>25ゲージカニューレ(最大4mm)で心臓の頂点を軽く穿刺します。カニューレを取り外し、すべての電極が心室内に入るまでPVカテーテルを挿入します。</li>
		<li>角形のループが得られるまで、穏やかな動きと旋回によってカテーテルの位置を調整する(図2A)。</li>
		<li>常に事前に温められた0.9%NaClを使用して、すべての露出した組織湿気を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 測定
<ol><li>一般的な推奨事項<ol>
<li>測定中、100%O2で気化したイソフルランを1.5~2%と換気する。
</li>
		<li>2つのベースライン測定と、用量応答プロトコルの各ステップで2つの静脈閉塞を行います。 注: 最初と 2 番目の大静脈の閉塞の後、圧力と体積値の両方が最初のオクルージョンの前と同様に定常状態の値に戻ることが重要です。この観察は、心室内容積の連続減少によるカテーテル位置の変化を認識するために必要である。カテーテル位置のシフトが当てはまる場合、特に体積値がシフトされます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パラメータ(心拍数、脳卒中量、dP/dtmax)のオンライン分析を行い、定常心機能が得られるまで待ちます。C57Bl6/Nマウスでここで使用した設定で期待されるパラメータ範囲については、公表された結果6を参照してください。</li>
	<li>エンド・クエシャレータ位置でレスピレーターを停止し、ベースライン・パラメーターを記録します。3〜5秒後、プリロード独立パラメータを得るために、下の騎兵静脈の下の縫合糸を鉗子で持ち上げることで心臓予負荷を減らす(図2B)。人工呼吸器の電源を入れます。血行力学パラメータが安定するまで、2回目のオクルージョンが30秒以上待ちます。</li>
	<li>基底条件下で測定を得た後、調製した注射器に切り替えることによってイソプロテレノールの用量応答に進む。ここでの注入速度は、心臓プリロードの変更を避けるために変化しないままである。シリンジを交換する際は気泡を注入しないように注意してください。<ol>
<li>新しい定常状態の心臓機能が得られるまで少なくとも2分間待ち、再び終気味の位置で呼吸器を停止し、ベースラインパラメータを記録する。3〜5秒後、プリロード独立したパラメータを得るために、下の騎静脈の下の縫合線を持ち上げることによって心臓予荷重を減らします。</li>
		<li>2 回目のオクルージョンが続くまで、少なくとも 30 秒待ちます。その後、次のイソプロテレノール濃度で調製されたシリンジに切り替え、ベースラインおよびプリロード独立パラメータの記録を繰り返す。 注:終期収縮期圧力スパイク(ESPS、 図2C)のようなアーティファクトは、カテーテルの封じ込めから生じるイソプロテレノールの投与量の増加の間に起こり得る。基底パラメータの開始前に発生するアーティファクトは、カテーテルの再位置決めによって容易に修正することができる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. キャリブレーション
メモ:キャリブレーション手順は、使用するPVLシステムによって異なる場合があります。
<ol><li>並列コンダクタンスキャリブレーション<ol>
<li>イソプロテレノール用量応答からの最後の測定後、15%NaCl溶液を含むシリンジを大腿カニューレに接続します。オンラインビジュアライゼーション中にPVLがわずかに右にシフトするまで、チューブに残っている高トニック溶液の5μLを慎重に注入します。ループが安定状態に戻るまで待ちます。</li>
		<li>終わりの満了の呼吸を止め、15%NaClの10 μLの1つのボーラスを2~3秒以内に注入して下さい。PVLが主に広がり、オンラインの視覚化中に右にシフトされているかどうかを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>コンダクタンス対体積キャリブレーション<ol>
<li>5分待って、少なからず、高量食塩水ボーラスが完全に希釈されるようにします。その後、カテーテルを取り外し、1 mLシリンジと21ゲージカニューレを使用して、心臓の左心室から少なくとも600μLの血液を引き出します。この時点で、動物は、心臓の換気および除去を停止することによって、大量の出血によって深い麻酔および鎮痛の下で安楽死させる。</li>
		<li>既知の体積のシリンダーを備えた事前に温めた(37°Cの水浴で)校正キュベットに血液を移します。PVカテーテルを各シリンダーに中央に置き、コンダクタンスを記録します。各動物の標準曲線を計算することで、コンダクタンス単位を絶対体積値に変換することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 分析
<ol><li>基礎条件下でのPVL測定とイソプロテレノール刺激、視覚化、デジタル化、計算、抽出、適切なPVL分析ソフトウェアを使用して、心機能(PRSW、dP/dt、末端拡張期圧力と体積、終期収縮期圧および体積、緩和定数タウなど)を特徴付けるパラメータを計算します。さらに統計解析とグラフィカル表現は、標準解析ソフトウェアで実行できます。</li>
	<li>プリロード独立パラメータの分析 注: この手順では、手順を標準化することが重要です。<ol>
<li>プリロード独立パラメータの解析に関して、すべての測定値全体でプレロードの減少を示す最初の5~6個のPVLを選択します(図2D)。プリロード削減中に分析のために選択された一定数のPVL数は、取得されたパラメータの測定値間の変動性を減少させます。</li>
		<li>プロトコルの各ステップでの2つの測定値の平均値を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

利益相反を宣言する必要はありません。

ここでは、βアドレナリン刺激の増加の下でマウスの生体内心機能を分析するプロトコルを提供する。この処置は、両方に対処するために使用することができる、心臓機能およびアドレナリンリザーブ(例えば、イトロピーおよびクロトロピー)の遺伝子組み換えマウスまたは介入時に。心機能を決定する他の手段と比較して、圧力容積ループ(PVL)測定の最も顕著な利点は、本質的な、負荷非依存性心機能の分析である。他のすべての方法(例えば、MRIおよび心エコー検査)は、心機能の負荷依存性パラメータのみを評価することができ、特に心収縮性を確実に決定することはできません。これにより、PVL測定は、心機能5の深度分析の終点測定のためのゴールドスタンダードになります。しかし、前に命名された方法は、心機能の逐次的な分析を可能にし、縦方向の観察(例えば、疾患進行中)のために最前線に持って来る。また、心室内容積、及びその後のストローク体積及び他の誘導パラメータは、マウス20におけるMRIと比較してPVL測定において過小評価され得る。
...

心血管疾患は通常、心機能に影響を与える。この問題は、動物病モデルにおける生体内の詳細な心機能の評価における重要性を指摘する。動物実験は、3つのRs(3R)指導原則(削減/リファイン/置換)のフレームで囲まれています。現在の発達レベルで全身応答(すなわち、心血管疾患)を含む複雑な病理を理解する場合、主な選択肢は、利用可能な方法を洗練することです。また、精製は、変動性が低いために必要な動物数の減少につながり、分析と結論の力を向上させます。また、神経体液刺激や大動脈バンディングなどの圧力過多によって誘発されるものを含む心臓疾患の動物モデルと心臓の収縮性測定の組み合わせは、例えば、変化したカテコールアミン/βアドレナリン性レベル1、2、3、4を模倣し、前臨床試験のための強力な方法を提供する。カテーテルベースの方法が心収縮性5の深度評価で最も広く使用されているアプローチであることを考慮して、我々は、このアプローチの特定のパラメータの評価を含む以前の経験に基づくβアドレナリン刺激の間に、圧力体積ループ(PVL)測定によってマウスの生体内心機能の洗練された測定をここに提示することを目指した6、 7.
画像またはカテーテルベースの技術を含む心臓血行力学パラメータアプローチを決定するために利用可能である。どちらのオプションも、それぞれの科学的な質問に対して慎重に考慮する必要がある長所と短所を伴います。画像化アプローチには、心エコー検査と磁気共鳴画像法(MRI)が含まれます。両方とも正常にマウスで使用されています。.心エコー測定は、マウスの高い心拍数に必要な高速プローブからの高い初期コストを伴います。それは比較的簡単な非侵襲的なアプローチですが、理想的には心臓構造の認識と視覚化を経験する必要があるオペレータの間で可変です。また、圧力測定は直接行う必要がなく、サイズの大きさと流量測定の組み合わせから計算が行われます。一方、同一の動物や心機能に対して複数の測定を行うことができるという利点を有し、例えば疾患進行中に監視することができる。容積測定に関しては、MRIはゴールドスタンダード手順であるが、心エコー検査と同様に、直接圧力測定は不可能であり、プリロード依存パラメータは8を得ることができる。制限要因は、可用性、分析作業、運用コストでもあります。ここで、心臓機能を測定するカテーテルベースの方法は、さらに、心臓内圧の直接モニタリングおよび前負荷リクルートストローク作業(PRSW)9のような負荷非依存性の判定を可能にする良い代替手段である。しかし、圧力伝導カテーテルで測定された心室容積は、MRIの測定よりも小さいが、グループ差は同じ範囲10に維持される。信頼性の高いボリューム値を決定するためには、対応するキャリブレーションが必要であり、PVL測定時の重要なステップです。これは、高量食音11,12のボーラス注入中の心筋の並列伝導性に対するインビボ解析と体積較正キュベットにおける血液伝導率の元生の測定(伝導度の体積への変換)を兼ね備える。それ以上に、心室内部のカテーテルの位置合わせと、心室の縦軸に沿った電極の正しい方向が、それらによって生成される周囲の電界の検出能力にとって重要である。それでもマウス心臓のサイズが小さくなっている場合、拡張心室5、10でもカテーテルの心室内向きの変化によって生成されるアーティファクトを避けることができるが、人工物はβアドレナリン刺激6、13の下で進化することができる。加えて、アドミタンスベースの方法の開発はキャリブレーションステップを回避するように見えたが、ここでの体積値はむしろ14、15を過大評価している。
マウスは心臓血管研究における最も重要な前臨床モデルの1つでありβ、心臓のアドレナリン予備は心臓生理学および病理学において中心的な関心事であるため、ここではβアドレナリン刺激中のPVL測定によってマウスの生体内心機能を決定するための洗練されたプロトコルを提示する。

<table><tbody><tr><td>1.4F SPR-839 カテーテル</td><td>Millar Instruments, USA</td><td>840-8111</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringes</td><td>Beckton Dickinson, USA</td><td>REF303172</td><td></td></tr><tr><td>Bio Amplifier</td><td>ADInstruments, USA</td><td>FE231</td><td></td></tr><tr><td>Bridge-Amplifier</td><td>ADInstruments, USA</td><td>FE221</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Roth, Germany</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン塩酸塩</td><td>バイエル、ドイツ</td><td>4007221026402</td><td></td></tr><tr><td>校正キュベット</td><td>ミラー、米国</td><td>910-1049</td><td></td></tr><tr><td>差圧トランスデューサ MPX</td><td>Hugo Sachs Elektronik- ハーバード 装置、ドイツ</td><td>タイプ 39912</td><td></td></tr><tr><td>デュモン鉗子 #5/45</td><td>ファイン サイエンス ツールズ インク</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>デュモン鉗子 #7B</td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td>11270から20</td><td></td></tr><tr><td>Graefe鉗子</td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Ver. 8.3.0</td><td></td></tr><tr><td>EcoLab-PE-Micotube</td><td>Smiths, USA</td><td>004/310/168-1</td><td></td></tr><tr><td>Etomidate Lipuro</td><td>Braun, Germany</td><td>2064006</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Ratiopharm, Germany</td><td>R26881</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレートとコントロールユニット</td><td>Labotec, Germany</td><td>ホットプレート 062</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター, ドイツ</td><td>HDG9623</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン 気化器</td><td>アボット</td><td>ヴェイパー 19.3</td><td></td></tr><tr><td>イソプレナリン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>I5627</td><td></td></tr><tr><td>ファインボア ポリエチレンチューブ 外径 0.61 mm, 内径 0.28 mm</td><td>Smiths Medical International Ltd, UK</td><td>Ref. 800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>MiniVentマウス用人工呼吸器</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus, ドイツ</td><td>Type 845</td><td></td></tr><tr><td>MPVS Ultra PVL System</td><td>Millar Instruments, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem, ドイツ</td><td>A3597</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0.9% 等張性</td><td>ブラウン, ドイツ</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>Pancuronium-bromide</td><td>Sigma-Aldrich, アメリカ</td><td>BCBQ8230V</td><td></td></tr><tr><td>Perfusor 11Plus</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Nr. 70-2209</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab 4/35 control unit</td><td>ADInstruments, USA</td><td>PL3504</td><td></td></tr><tr><td>Rechargeable Cautery-Set</td><td>Faromed, Germany</td><td>09-605</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science tools Inc.</td><td>140094-11</td><td></td></tr><tr><td>Software LabChart 7 Pro</td><td>ADInstruments, USA</td><td>LabChart 7.3 Pro</td><td></td></tr><tr><td>Standard mouse food</td><td>LASvendi GmbH, Germany</td><td>Rod18</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Zeiss, Germany</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Surgical suture 8/0</td><td>Suprama, Germany</td><td>Ch.B.03120X</td><td></td></tr><tr><td>Venipuncture-cannula Venflon Pro Safty 20-gauge</td><td>ベクトン・ディキンソン、米国</td><td>393224</td><td></td></tr><tr><td>血管カニューレ挿入鉗子</td><td>ファインサイエンスツール社</td><td>00574-11</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック社、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター (Filtropur S 0.45)</td><td>ザルシュテット社、ドイツ</td><td>Ref. 83.1826</td><td></td></tr></tbody></table>

圧力量ループ解析によるβ-アドレナリン刺激に対する心臓応答

Cardiac Response to &#946;-Adrenergic Stimulation Determined by Pressure-Volume Loop Analysis

心臓機能の決定は、心臓に対する特定の治療の影響を特徴付けるために、心血管疾患の動物モデルにおける堅牢なエンドポイント分析である。遺伝子操作の実現可能性のために、マウスは心臓機能を研究し、新しい潜在的な治療標的を探すために最も一般的な哺乳類動物モデルとなっています。ここでは、イソプロテレノールの濃度を増加させる静脈内注入による、基底状態およびβアドレナリン刺激の下での圧力体積ループ測定および分析を用いて生体内の心機能を決定するプロトコルについて説明する。オープンチェスト測定中の負の影響を改善するための正の終気味圧力を考慮した換気サポート、および処置中の痛みによって誘発される制御不能な心筋ストレスを避けるために強力な鎮痛(ブプレノルフィン)を含む洗練されたプロトコルを提供します。手順の詳細な説明と可能な落とし穴についての議論は、非常に標準化され、再現性のある圧力量ループ分析を可能にし、可能な方法論的バイアスを防ぐことによって実験コホートからの動物の排除を減らします。

圧力体積ループ(PVL)測定は、薬物の心臓薬力学を分析し、正常および病理学的状態下で遺伝子組み換えマウスモデルの心臓表現型を調査するための強力なツールです。このプロトコルは、成人マウスモデルにおける心臓βアドレナリンリザーブの評価を可能にする。ここでは、大腿静脈カテーテルを介してイソプロテレノール濃度を注入することにより、βアドレナリン刺激に対する心応答に焦点を当てたブプレノルフィン(鎮痛)およびパンクロニウム(筋弛緩剤)と組み合わせたイソフルラン麻酔下のオープンチェスト法について述べた。このプロトコルに示す代表的なデータの一部は、野生型C57Bl6/N成体雄マウス(図3 および 表2)に由来する。我々のPVL分析で測定されたいくつかの重要なパラメータの変動性を示す指標として、WTグループと無料利用可能なG*Powerソフトウェア17の結果を用いて、電力分析(α誤差確率0.05、0.8のパワー)を行いました。 表3 では、計算された効果サイズと心拍数、PRSW、ス...

ここでは、マウスにおける内因性心機能およびβアドレナリン性予備軍を決定するために、イソプロテレノールを静脈内注入する用量を増加させる下での心圧容ループ分析について説明する。圧力量ループ測定には、正の終値気圧を伴う換気を含む、変更されたオープンチェストアプローチを使用します。

Determination of the cardiac function is a robust endpoint analysis in animal models of cardiovascular diseases in order to characterize effects of ...

正の終気圧を伴う換気を含むオープンチェストアプローチは、生体内の心臓機能の評価と分析、およびβ-アドレナリン刺激の増加に大きな意味を持ちます。この手順は、負荷非依存性心機能のベースラインパラメータと、遺伝子組み換えマウスまたは介入時のβ-アドレナリン性予備軍の両方に対処するために使用することができる。ペダル反射への応答の欠如を確認した後、麻酔マウスの左後肢を70%エタノールで消毒し、切開して左大腿静脈を露出させる。側頭動脈と静脈を焼灼して下さる。大腿静脈をよりよく見るために、視野は腹部を通る縫合糸によってまたがれている。次いで、縫合糸はカテーテルアクセスに遠位に置かれ、大腿静脈をリゲートする。大腿静脈の下に縫合を渡し、穿刺部位に結び目頭蓋を準備します。1ミリリットルの注射器に取り付けられた準備されたマイクロチューブで大腿静脈を穿刺し、結び目の縫合糸で容器の中のチューブを固定します。任意の流体損失を打ち消すために、自動シリンジポンプを使用して、12.5%のアルブミンを15マイクロリットルの注入速度で補充した0.9%の塩化ナトリウムを注入し、露出した組織を前温め0.9%塩化ナトリウムで水和します。胸郭にアクセスするには、70%エタノールで胸郭をすすぐし、xiphoidプロセスのすぐ下の皮膚を切開します。胸部筋肉を胸壁から鈍く分離し、振動板が完全に見えるまで、胸壁を切断できるようにxiphoidプロセスを持ち上げるために鉗子を使用する。下からダイヤフラムを切開して心臓の頂点を露出させ、鉗子を使用して心膜を慎重に取り除きます。左側に限られたコトトミーを行い、下流の予負荷低減を可能にするために下側の騎兵静脈の下に縫合を渡す。25ゲージカニューレを使用して、心臓の頂点を軽く穿刺し、すべての電極が心室内になるまで、カニューレを圧力体積カテーテルに置き換えます。次に、長方形のループが得られるまでカテーテルの位置を穏やかに調整します。圧力体積ループ測定を取得するには、対象の心機能パラメータのオンライン分析を行い、定常心機能が得られるまで待ちます。終わりの呼び出し位置でレスピレーターを停止し、ベースラインパラメータを記録します。3~5秒後、下の騎兵静脈の下の縫合線を持ち上げて、プリロード独立したパラメータを取得し、人工呼吸器をオンにします。血行力学パラメータが安定するまで、2回目のオクルージョンが30秒以上待ちます。基礎条件下で測定を行った後、イソプロテレノールを搭載したシリンジをシリンジポンプに取り付けます。新しい定常心機能が観察されるまで、少なくとも2分間待ちます。終止め位置で呼吸を停止する前に、ベースラインパラメータを記録した。3~5秒後、下の騎兵静脈の下の縫合線を持ち上げて、独立したプリロードパラメータを得て、2回目の閉塞を少なくとも30秒間待ちます。次に、次のイソプロテレノール濃度を含むシリンジを取り付け、ベースラインを繰り返し、独立したパラメータ記録をプリロードする。並列コンデュランスキャリブレーションを行うには、最後のイソプロテレノール用量応答測定の後、15%塩化ナトリウム溶液を装填した注射器を大腿管カニューレに接続し、圧力体積ループがわずかに右にシフトするまで5マイクロリットルの高張液を慎重に注入します。ループが定常状態に戻るまで待ってから、終わりの満了時に呼吸器を停止し、直ちに10マイクロリットルの塩化ナトリウムを注入する。次に、圧力量ループが大きく広がり、右にシフトしているかどうかを確認します。コンダンダンス対体積比を実行するには、カテーテルを取り外す前に高トニック生理食塩水ボーラスが完全に希釈されるまで5分間待ち、1ミリリットルの注射器を使用して、21ゲージカニューレを装備し、心臓の左心室から少なくとも600マイクロリットルの血液を除去する。次に、既知の体積のシリンダーを使用して、37°Cの水浴で事前に温めた校正キュベットに血液を移し、圧力量カテーテルを各シリンダーに中央に入れてコンダクタンスの記録を可能にします。このオープン胸部圧力容積ループ測定法を用いて、カテーテルが心室内に正しく配置されれば、完全な心周期は長方形の圧力体積ループによって表される。図示されるように、収縮期は、両方の心臓弁が閉じられる間、等体積収縮の相から始まる。心室圧が大動脈圧を超えると、大動脈弁が開き、吐出期に血液が大動脈に送り込まれるとき。その後、大動脈圧が心室圧を超えると、大動脈弁が閉じ、そして、ダイストールが始まる。等体積緩和の間、心室圧は心室圧が心室圧を超えるまで下がり、僧帽弁が開く。受動拡張期充填は、末端-拡張期の圧力量関係によって特徴付けられる次の心周期が始まるまで起こる。それは予負荷から独立して心機能を決定することができるので、圧力量分析は心臓の収縮性の心機能に関する詳細な洞察を提供できる。例えば、この分析では、イソプロテレノールは、各測定された心機能、および心収縮性パラメータに有意な効果を誘導した。これに対し、拡張期パラメータの低下は、イソプロテレノール濃度を増加させることに応答して観察された。左心室内の正確なカテーテル配置は、アーティファクトのない再現可能なループを得るために重要です。カテーテルの配置を最適化するために、我々はオープン胸のアプローチを好む。PVループ測定の後、同種のエンドシスを決定することができ、組織を単離して、治療、または遺伝子改変によって引き起こされる分子および組織病理学的変化を同定することができる。この技術は、正常および病理学的条件下でマウスモデルにおけるβ-アドレナリンリザーブを分析する方法を開き、他の刺激をテストするためのテンプレートとして使用することができる。

cardiac-response-to-adrenergic-stimulation-determined-pressure-volume

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