マウスの洞房結節と房室結節のホールマウント免疫蛍光染色、共焦点イメージング、3D再構成
2020年12月22日
マウス心臓の洞房結節(SAN)と房室結節(AVN)のホールマウント免疫蛍光染色のための段階的なプロトコルを提供します。
このプロトコルでは、マウスの洞結節およびAV結節に対して、マイクロ解剖、ホールマウント免疫蛍光染色、および顕微鏡検査を行うために必要な手順を説明しています。ホールマウント法は、洞およびAVリンパ節の正確な3D局在と形態に対処し、周囲の組織との関係を調べるのに有利です。組織の形態は、組織の脱水と物理的破裂を最小限に抑えてかなり保存されています。
まず、針を左心室に慎重に押し込み、5〜10ミリリットルの氷冷PBSを静かに注入して心臓を大量に注入することにより、頂点の領域に27ゲージの針で心臓を穿刺します。ピンセットを使用して心臓を慎重に持ち上げ、大きな血管を切って心臓を取り除きます。解剖顕微鏡下で氷冷PBSで満たされた解剖皿に心臓を入れます。
心臓の向きを決定したら、心臓の前面が皿の底にくるように心臓を回転させます。小さなピンを頂点と心房付属器を通して解剖皿の下部にあるアガロースに入れることにより、心臓を固定します。細いピンセットやハサミを使って、上大静脈と下大静脈の周りの非心臓組織を慎重に取り除きます。
大静脈間領域を露出させるには、マイクロハサミで心室と心房の間の溝と平行に切断することにより、心室の大部分を切除します。固定および脱水のために、サンプルを4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で一晩入れます。翌日、心臓を15%ショ糖溶液に移し、摂氏4度で24時間インキュベートします。
インキュベーション後、心臓を30%ショ糖溶液に4°Cでさらに24時間移します。PBSで希釈した1%Triton X-100で心臓を洗浄します。次に、ブロッキング溶液で摂氏4度で一晩ブロックし、透過化します。
心臓を1.5ミリリットルのチューブに入れ、ブロッキング溶液で希釈したウサギ抗マウスConnexin 43およびラット抗マウスHTN4抗体と4°Cで7日間インキュベートします。7日後、一次抗体を含む溶液をピペットで取り除きます。オービタルシェーカーで1%Triton X-100溶液を1回の洗浄につき1時間、3回心臓を洗浄します。
インキュベーション後、二次抗体とDAPIで洗浄ステップを繰り返します。プラスチックリングを準備して粘土で満たした後、心臓の後ろを上にして心臓を粘土の溝に入れます。心臓の背側に位置し、脳頭間領域があるSANを特定します。
心臓にPBSを追加して、心臓がPBSで完全に覆われるまで、空洞内のすべての空気を置換します。プラスチックリングの端にシリコンを塗布します。サンプルの周囲を粘土にそっと押し込んで心臓を固定し、カバースリップで心臓を覆います。
次に、粘土の裏側をそっと押してPBSの一部を絞り出し、イメージング領域内の気泡を避けながら心臓をカバースリップに取り付けます。ホールマウント染色サンプルを逆さまにして共焦点顕微鏡のプラットフォームに置き、テキスト原稿に記載されているようにイメージングを進めます。共焦点顕微鏡の各チャンネルのパラメータは、それぞれのソフトウェアを使用して設定します。
このプロトコルは、マウスの心臓の洞房結節と房室結節の両方の共焦点顕微鏡イメージングを実行するために使用されました。HCN4 と Connexin 43 をそれぞれ標的とする蛍光抗体による伝導系と作用性心筋の特異的染色により、無傷の解剖学的構造内の洞房結節と房室リンパ節を同定することが可能になります。このホールマウント染色プロトコルにより、さまざまな抗体を使用して、さまざまな細胞タイプの相互作用を研究することができます。
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概要
本プロトコルでは、マウス心臓における洞房結節（SAN）および房室結節（AVN）のホールマウント免疫蛍光染色の手順について解説します。この手法により、これらの心臓構造の精密な3D局在化および形態学的解析が可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 心血管生物学
- 免疫蛍光染色法
背景
- 洞房結節（SAN）および房室結節（AVN）は、心機能において極めて重要である。
- ホールマウント免疫蛍光染色により、これらの結節の形態に関する知見が得られる。
- この手法は、脱水を最小限に抑えることで組織形態を維持する。
- これらの結節と周囲組織との関係を理解することは、心臓研究において不可欠である。
研究目的
- マウス心臓におけるSANおよびAVNの染色のための詳細なプロトコルを提供すること。
- 心臓結節の3D局在研究を促進すること。
- 心臓組織の相互作用に関する理解を深めること。
使用方法
- マウス心臓の顕微解剖。
- ホールマウント免疫蛍光染色。
- 染色組織の可視化のための顕微鏡観察。
- 組織保存のための氷冷PBSの使用。
主な結果
- マウス心臓におけるSANおよびAVNの染色の成功。
- 組織形態の保持が確認された。
- 3D局在の明確な可視化を達成。
- 心臓の結節と周囲組織との関係性に関する理解が深まった。
結論
- このプロトコールは、マウスにおけるSANおよびAVNの研究に有効です。
- ホールマウント免疫蛍光染色は、心臓研究において価値のある手法です。
- さらなる知見を得るために、この手法を基盤とした今後の研究が期待されます。
よくある質問
業界における重要性
マウスモデルにおける洞房結節および房室結節の高解像度3D可視化は、心臓電気生理学研究における重要な課題を解決し、精密な解剖学的および細胞学的マッピングを可能にします。この手法により、不整脈メカニズムに関する初期段階の標的妥当性確認における予測精度が向上し、発見から前臨床心臓研究へのトランスレーショナルな連続性が維持されます。組織の完全性を保持しつつ、多重細胞型解析を可能にするこのワークフローは、心血管系の研究開発ポートフォリオにおいて再利用可能な資産となります。
バイオ医薬品研究開発における戦略的活用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- ペースメーカーおよび伝導系細胞集団のin situでの詳細な解析を可能にします。
- 結節の構造と機能の関係を明らかにすることで、メカニズムに基づくリスク低減を支援します。
- 不整脈発生において疾患に関連するターゲットの確実な特定を促進します。
- 機能研究や仮説検証のための解剖学的コンテキストを提供します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 下流のイメージングおよび解析ワークフローに向けて、完全で検証済みの心臓組織系を調製します。
- 結節および心筋マーカーに対して、再現性のある定量的な免疫蛍光出力を提供します。
- 同一サンプル内で複数の細胞型を評価するための、多重抗体標識を可能にします。
- 比較研究のためのアッセイの標準化とスケーラビリティをサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 3D解剖学的データを、心伝導障害の疾患関連前臨床モデルと照合します。
- 分子レベルの発見から組織レベルの検証までの一貫性を維持します。
- 構造的および細胞的な根拠に基づき、リスク調整された候補標的の進展を可能にします。
- 結節細胞および非心筋細胞の相互作用をマッピングすることで、バイオマーカー開発を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このホールマウント免疫蛍光染色および共焦点イメージングのワークフローは、高コンテンツかつ定量的な解剖学的データを提供することで、初期段階の発見、ターゲットのバリデーション、そして前臨床的な心臓研究を橋渡しします。
- 探索生物学：心臓伝導研究における仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：結節同定のための、再現性と定量性のある免疫蛍光読み取り値を提供します。
- 分析：結節領域および心筋領域の3D再構築および比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：前臨床不整脈モデルにおける解剖学的および細胞的な連続性を提供します。
- 企業での再利用：心血管系R&Dチーム向けに、標準化されたイメージングおよび分析プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 心臓標的のバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値： 再現可能で拡張性のあるアウトプットのため、組織標本作製とイメージングを標準化する。
- 戦略的価値： 心臓疾患の創薬プログラムにおけるgo/no-go判断と資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： 伝導系標的およびモデルのリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 心臓の解剖、免疫蛍光染色、および共焦点顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- 高度なイメージングプラットフォームおよび画像解析ソフトウェアへのアクセスが不可欠です。
- 組織処理および抗体プロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 異なる心臓モデルや種への適用には、最適化が必要な場合があります。
- サンプルサイズや抗体の浸透性が、大規模研究におけるスループットを制限する可能性があります。
