Name: ミツバチのコロニーからの花粉の収集と同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶ、花粉トラップを用いてミツバチの花粉を収集し、色分けと酢酸処理で植物分類を同定する方法。これにより、採餌行動や花粉多様性、植物との相互作用を研究できます。

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グレッチェン・ジョーンズ博士(USDA-ARS, APMRU, College Station, TX)がカラーソーティングとアセトリシス分析を支援してくれたことに感謝します。この研究は、オレゴン州養蜂家協会からR.R.S.に提供された研究資金によって支援されました。

著者らには開示するものは何もありません。

西洋ミツバチ(Apis mellifera L.)は、ミツバチの受粉に依存する多くの農作物の重要な花粉媒介者です1。10年以上にわたり、ミツバチコロニーの著しい損失が2、3、4、5、6、7、8、9と報告されている。寄生虫や病気、栄養不良や農薬など、いくつかの要因がこれらのコロニーの減少に関与している10。栄養不良は、農業の強化と採餌生息地の喪失に起因する可能性がある11。ミツバチの栄養を改善し、ミツバチの保護活動を支援するために、さまざまな景観でミツバチが利用する花資源を理解することが不可欠です。花粉はミツバチのタンパク質、脂質、ビタミン、ミネラルの主な供給源であり、ミツバチのコロニーレベルの採餌嗜好を理解し、ミツバチのコロニーに対する花粉トラップの影響を評価し、ミツバチへの農薬曝露を決定するために、多くの農業および生態学的研究で使用されてきました12,13,14。
ミツバチは花から花粉を集め、花粉をコルビキュラのペレット(後肢の脛骨花粉バスケット)に詰め、コロニーに戻って保管します。皮質花粉は、巣箱の入り口または花の上でそれらを捕獲し、それらを固定するためにそれらを短時間冷やし、次いで鉗子で後肢から花粉ペレットを除去することによって、狩猟採集者から除去することができる。個別に捕獲された狩猟採集者から皮質花粉を手作業で収集する面倒なプロセスは、かなりの量の花粉を必要とする場合、遅くて非効率的です。大量の花粉を収集するより簡単で効率的な方法は、巣箱の入り口にミツバチからの皮質花粉ペレットを閉じ込めることです。花粉トラップは、巣箱に入るときに戻ってきた花粉狩猟者の足から皮質花粉を取り除くように設計されています15。狩猟採集者は、ミツバチの労働者の体の通過を狭く許可する大きさのメッシュ穴を絞らなければなりません。
ミツバチがこれらの穴の1つを通過すると、より大きな花粉ペレットは彼女の足からこすり落とされ、収集トレイ16に落ちる。研究によると、花粉の捕獲は、より多くの花粉を集めるために狩猟採集者を刺激し、周囲の作物や植生の受粉効率を高めることが示されています17,18,19,20。花粉収集方法論は、開花植物種の量、質、分類群を決定するための最初のステップとして、風景の中でミツバチが利用する飼料を理解するためにも使用できます。したがって、効果的な花粉捕捉方法論は、受粉とミツバチの栄養研究の両方を促進します。これらの花粉採取方法の比較を表1に例示する。花粉採餌行動は、卵および幼虫の個体群レベル21,22と比較して、コロニーの貯蔵花粉の必要性に基づいて変化する。これらの変化には収集強度の変化が含まれるため、花粉量の大きな変動は、同じ場所のコロニー間および同じ収穫システムまたは景観タイプの異なる場所の間でしばしば予想される23,24。花粉を捕獲するコロニーと場所の数を増やすことは、この変化に対応するのに役立ちます。
花粉トラップは効率が異なります 25,26.ミツバチによって収集された花粉ペレットのサイズは植物種によって異なり、コロニー内の花粉貯蔵のレベルに基づいて変化する可能性がある27,28。これは、小さな花粉ペレットが過小評価され、大きなペレットが花粉トラップを介して収集されたサンプルで過剰に表現される可能性を提起する。成体のミツバチは体の大きさが異なり、トラップに集められた花粉の表現にも影響する可能性があります。また、主に蜜を産生する植物種もあり、一部の景観で収集された花粉を評価するだけでは検出されません。捕獲効率は、花粉トラップの種類とハイブ機器の状態によって影響を受ける、狩猟採集者のドリフトと見当識障害によっても影響を受けます。この問題は、このホワイト ペーパーで指定されている手法を採用することで軽減できます。研究者らは、コロニーレベルの採餌嗜好の結果を補うために、採餌者による花の訪問を数えるなどの追加の研究技術を検討することができる。花粉の多様性を評価するための有用な方法は、皮質花粉を色でソートすることです。ミツバチはジェネラリストの狩猟採集民ですが、花の忠実度も示し、収集旅行中に同じ場所にある同じ植物種から花粉を収集します。この採餌行動に基づいて、任意の所与の皮質花粉ペレットが、主に単一の植物種27、29、30、31によって表されると仮定する。したがって、科学者は、皮質花粉をペレット色でソートし、検出された色の総数または各色群12,32,33,34で表される合計の割合を報告することによって、花粉の多様性を記述することができる。これは、各色群の質量またはペレット数を測定することによって達成することができる。各色群のペレット数を測定することは、異なる分類群からのペレットの重量に既知または疑わしい系統的差異がある場合に示唆される。系統的な違いは、ペレットのサイズまたはペレットを形成するときに狩猟採集者が花粉に追加する蜜の量によって引き起こされる可能性があります。
色の選別は時間効率が高く簡単なプロセスですが、異なる植物分類群が同様の花粉ペレットの色を持つ可能性があるため、一部の受粉調査研究では許容できる精度が得られない可能性があります35,36。さらに、花粉ペレットを分離できる別個の色グループの数には物流上の制限があります。したがって、個々の植物分類群花粉をそれ自身の別個のペレット色群に分離することは、受粉研究において常に可能ではないかもしれない。光顕微鏡による花粉粒の形態学的特徴付けは、しばしば、同じ色群のペレット中の2つ以上の分類群の花粉を区別することによって、ペレットの色分離を補完する。特定の花粉ペレットの色群で複数の分類群の花粉粒を見つけるのが一般的ですが、ミツバチによって収集された個々の花粉ペレットは、一般的に1つの優勢な分類群を含み、おそらく他の分類群と少量です。したがって、ミツバチの皮質花粉ペレットにおける分類学的忠実度を仮定することが一般的である。マルハナバチのような花の忠実度行動を示さない他の花粉媒介者からの花粉ペレットは、しばしば多くの植物種を含み、優勢な分類群を有しないかもしれない。ポリフローラル花粉ペレット中の分類群比率の定量的推定が望まれる場合、適切な分析のためには、アセト分解を含む微視的方法がさらに必要である。
アセトライズされた花粉粒の形態学的特徴を評価することは、分類学的同定のための最も一般的な方法である16。アセト分解手順は、花粉粒の原形質を除去して、光学顕微鏡下で観察することができる診断特性を露出させる37,38。この方法を使用して、研究者は異なる分類群、特定の作物栽培システムに見られる分類群の頻度、およびペレット色の優勢な分類群を報告することができる33,36。アセト分解は、花粉の形態を明らかにするための最良の分析技術である28。しかし、多くのバラ科の種類など、いくつかのアセトライズされた花粉粒は、アセト分解および光学顕微鏡法のみでは属または種レベルに同定できない。研究者らは、走査型電子顕微鏡またはメタバーコード法を、属または種レベルの同定を達成するための代替方法と見なしています。しかし、これらの代替方法は定性的な分類群の同定のみを提供し、多花花粉ペレット中の異なる花粉粒分類群の割合を推定することができない36,39。さらに、これらの方法では、費用と必要な専門知識がかなり高くなります。これらの同定方法の比較を表1に示します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>メソッド</td>
			<td>時間</td>
			<td>費用</td>
			<td>解決</td>
			<td>ノウハウ</td>
		</tr><tr><td>花粉コレクション</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>花粉捕り</td>
			<td>低い</td>
			<td>適度</td>
			<td>変数</td>
			<td>適度</td>
		</tr><tr><td>花粉採集</td>
			<td>高い</td>
			<td>適度</td>
			<td>高い</td>
			<td>低い</td>
		</tr><tr><td>花粉の同定</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ビジュアル (カラーソートのみ)</td>
			<td>適度</td>
			<td>低い</td>
			<td>低い</td>
			<td>低い</td>
		</tr><tr><td>アセト分解</td>
			<td>適度</td>
			<td>適度</td>
			<td>適度</td>
			<td>適度</td>
		</tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td>
			<td>高い</td>
			<td>高い</td>
			<td>高い</td>
			<td>高い</td>
		</tr><tr><td>メタバーコード</td>
			<td>変数</td>
			<td>高い</td>
			<td>高い</td>
			<td>高い</td>
		</tr></tbody></table>
表1:時間、費用、解像度、および専門知識に基づく花粉の収集と同定のさまざまな方法の比較。 視覚的メソッド (カラー ソートのみ) は、検出された色の総数または各カラー グループによって表される合計の割合を、花粉の発生源を決定するためのメトリックとして報告しますが、分類群の識別は提供しません。
花粉の捕獲と選別、花粉粒の分解に関する情報は多様であり、多くの場合、複数の情報源にまたがって広がっており、さまざまな分野の研究者によって異なります。この論文では、研究者と養蜂家の両方が大量の皮質花粉を効果的に収集するために使用できるさまざまな種類の花粉トラップに関する詳細な洞察を提供します。また、植物分類群の同定のために、アセト分解、染色、スライドマウントによる花粉サンプルの調製プロトコルも提供されています。ここで詳述する方法論は包括的であり、ミツバチが特定の景観、特に作物栽培システムにおいて餌を採餌する優勢な植物種を特定するためのユニークなリソースとして役立ちます。以前の研究からのこれらの方法に基づく知見が提示され、5つの収穫システムにおけるミツバチによって収集された皮質花粉からの花粉ペレットの色および植物分類群の多様性を文書化している14。

<table><tbody><tr><td>#8 ハードウェアクロス</td><td></td><td></td><td>2.7 mm アパーチャ</td></tr><tr><td>10 mL メスシリンダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000 uL マイクロピペットチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1250 mL フィルターマイクロピペットチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 x 75 mm スライド</td><td></td><td></td>ガラス <td>厚さ: 0.93 mm - 1.05 mm</td></tr><tr><td>2 mL 微量遠心チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL目盛り付きホウケイ酸ガラスビーカー(x3)</td><td>VWR</td><td>10754-952</td><td></td></tr><tr><td>50 mL目盛り付きホウケイ酸ガラスビーカー(x6)</td><td>VWR</td><td>10754-946</td><td></td></tr><tr><td>95% EtOH</td><td>Pharmco AAPER</td><td>111000200DM55</td><td>ACS/USP/Kosherグレード</td></tr><tr><td>ブチルビニール手袋</td><td></td><td></td><td></td></tr>遠心<tr><td>分離</td><td></td><td></td>機<td>1060 x g最大速度、水平スイングが好ましい</td></tr><tr><td>化学安全ゴーグル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カラーガイド</td><td>Pantone</td><td>SKU: GP1601A</td><td>ソリッドコーティング</td></tr><tr><td>1または1.5</td><td></td><td></td>のカバースリップ <td>厚さ:0.13 mm - 0.19 mm</td></tr><tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒュームフード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>BDHケミカル</td><td>BDH3092</td><td>ACSグレード</td></tr><tr><td>ガラス漏斗</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリセリン</td><td>ハムコ</td><td>103196001_1</td><td>USPグレード、99.5%、無水</td></tr><tr><td>有害廃棄物容器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハイブツール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホットブロック</td><td></td><td></td> 長袖で<td>80°Cに達する必要があります</td></tr><tr><td>白衣 長袖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラテックスまたはポリウレタンフォーム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マニキュア、透明</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000ピペット</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチックスプーン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サフラニン</td><td>ワードの科学</td><td>470302-322</td>ラボ<td>グレードの</td></tr><tr><td>喫煙者</td><td></td><td></td>花<td>粉トラップ設置用</td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>EMDミリポア</td><td>SX0320</td><td>ACSグレード、粉末</td></tr><tr><td>噴出ボトル(x2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>EMDミリポア</td><td>SX1244</td><td>ACSグレード</td></tr><tr><td>サンダンスボトムマウント花粉トラップ</td><td>Betterbee養蜂供給</td><td>PTRAPB</td><td></td></tr><tr><td>テープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>木製攪拌棒木製</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>つまようじ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ミツバチのコロニーからの花粉の収集と同定

Collection and Identification of Pollen from Honey Bee Colonies

研究者はしばしばミツバチから皮質花粉を収集して分析し、花粉を採餌する植物源を特定したり、花粉を介してミツバチの農薬曝露を推定したりします。本明細書に記載されるのは、巣箱に戻るミツバチから皮質花粉を収集するための効果的な花粉捕捉方法である。この採取方法は、研究目的に使用できる大量の皮質花粉をもたらす。ミツバチは多くの植物種から花粉を集めますが、通常、各収集旅行中に1つの種を訪れます。したがって、各皮質花粉ペレットは、主に1つの植物種を表し、各花粉ペレットは色によって記述することができる。これにより、皮質花粉のサンプルを色で分類して植物源を分離することができます。研究者らは、分類学的同定のためにアセトライズされた花粉粒の形態を分析することによって、皮質花粉をさらに分類することができる。これらの方法は、受粉効率、花粉媒介者の採餌ダイナミクス、食事の質、多様性などの花粉媒介者に関連する研究で一般的に使用されています。花粉トラップを使用して皮質花粉を収集し、花粉を色で分類し、花粉粒をアセトリゼーションするための詳細な方法論が提示される。また、5つの異なる作物栽培システムにおけるミツバチから採取された皮質花粉のペレット色と分類群の頻度に関する結果も提示されている。

以前の研究では、ミツバチがアーモンド、チェリー、ハイブッシュブルーベリー、ハイブリッドニンジン、メドウフォーム14の農作物で収集した花粉の多様性の評価が報告されました。記載された方法を用いて、皮質花粉を収集し、色別にソートし、各ペレット色群の植物源を同定し、花粉の多様性を評価した。ボトムマウント花粉トラップは、作物ごとに複数の場所のコロニーに設置されました(図1A)。各部位から採取した花粉の量は、色選別法およびアセト分解分析法のサンプル重量要件を満たすのに十分であった。すべての花粉収集サンプルには、複数の区別可能なカラーグループがありました(図2および図3)。いくつかのサンプルでは、花粉の色群はわずか4〜5個のペレットしか含んでいませんでした。しかし、ほとんどの群はそれより有意に多くを有し、したがって、アセト分解のための独自の標識色群として役立った(図4および図5)。アセト分解後(図6)、明視野光学顕微鏡を用いて、各研究部位の周囲から採取したバウチャー標本の形態学的特徴を確認することにより、各色群を可能な限り低い分類学的ランクまで効果的に同定した(図7)。 
<img alt="ミツバチの行動と巣の活動に関する野外調査における比較分析のための3つのミツバチの巣箱のセットアップ" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:皮質花粉を収集するためにミツバチのコロニーに取り付けられた花粉トラップ。 (A)ハイブボトムボードの上と最も低いハイブボックスの真上に配置されたボトムマウントトラップ。他の花粉トラップスタイルには、(B)フロントマウントと(C)オーガーホールエントランスマウントトラップがあります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="メッシュによるミツバチの行動観察。グループダイナミクス研究;昆虫学研究のセットアップ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:花粉トラップのトラップ機構と回収トレイ。 戻ってきた花粉の狩猟採集者は、巣箱に到達する前にメッシュトラップメカニズムを圧迫する必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="ミツバチの巣の検査、花粉トレイを木製の台の上の黄色い巣箱から引き出して分析します。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:花粉トラップの収集トレイ 皮質花粉は、花粉トラップによって戻ってきた花粉狩猟者の足を削り取られ、収集トレイに落ちます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="シャーレ分析、Pantoneカラーガイド、ピンセットによるサンプル調整による測色セットアップ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:皮質花粉のサンプルをカラーグループに分類する。 皮質花粉は、カラーグループに分類した後に乾燥させて秤量し、収集された異なるカラーペレットの割合を報告することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Pantone見本上のシャーレ内の石を用いた色比較実験,視覚分析法" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図5:パントンカラーガイドを使用して色別にソートされた花粉ペレットの4つのグループ。 カラー グループは、(A) グレー、パントン 5855C、(B) ブラウン、パントン 7557C、(C) イエロー、パントン 458C、および (D) ライト ブラウン、パントン 3547C とラベル付けされています <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig05large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="クロマトグラフィー実験のための実験室のセットアップ。ワークスペースには試薬、ピペット、フラスコが含まれています。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図6:ヒュームフード内のアセト分解装置のセットアップ ヒートブロック、試薬、溶剤廃棄物および酸廃棄物容器、ラベル付きビーカー、ピペット、ピペットチップ、攪拌スティック、およびヒュームフードの内側に位置する微量遠心チューブ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="顕微鏡画像;赤血球、明視野顕微鏡、細胞分析、血液学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62064/62064fig07.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 図7:染色され、アセトリゼーションされた花粉粒の顕微鏡写真。 アセトリゼドマスタード(アブラナ科)花粉粒の多くの側面を倍率40倍で。スケール バー = 50.398 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62064/62064fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
アーモンドの収穫地から採取された花粉は、他の作物から採取した花粉よりも花粉の多様性が比較的低く、1カ所あたり平均3.0±0.5個のペレット色と3.2±1.2個の植物分類群であった(表2)14。残りの4つの作物栽培システムは、花粉の多様性レベルが高く、ハイブリッドニンジンでは1サイトあたり平均6.0±2.0ペレット色と8.0±1.5植物分類群、ハイブッシュブルーベリーでは1サイトあたり8.8±1.4ペレット色と13.5±2.0植物分類群、ハイブリッドニンジンでは1サイトあたり7.0±1.0ペレット色と11.0±0.0植物分類群、メドウフォームでは1サイトあたり10.0±0.0ペレット色と13.0±1.5植物分類群でした。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>実り</td>
			<td>花粉ペレットの色/サイトの平均数(SE)</td>
			<td>植物分類群/サイトの平均数 (SE)</td>
			<td colspan="3">特定された分類群の合計</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>家族</td>
			<td>属</td>
			<td>種</td>
		</tr><tr><td>アーモンド</td>
			<td>3.0 (0.5)</td>
			<td>3.2 (1.2)</td>
			<td>4</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>ブルーベリー</td>
			<td>8.8 (1.4)</td>
			<td>13.5 (2.0)</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>人参</td>
			<td>7.0 (1.0)</td>
			<td>11.0 (0.0)</td>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>桜桃</td>
			<td>6.0 (2.0)</td>
			<td>8.0 (1.5)</td>
			<td>4</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>メドウフォーム</td>
			<td>10.0 (0.0)</td>
			<td>13.0 (1.5)</td>
			<td>5</td>
			<td>4</td>
			<td>14</td>
		</tr></tbody></table>
表2:5つの作物栽培システムにおけるミツバチから採取された皮質花粉の多様性。 多様性の指標には、ペレットの色の平均数(±SE)、植物分類群の平均数(SE±)、および識別された総分類群が含まれます。この表は14 から変更されました。省略形: SE = 標準エラー。

ミツバチから皮質花粉を採取する方法、色分類、アセトリシス、分類学的同定のための花粉の顕微鏡スライド調製のプロトコルについて説明します。さらに、花粉トラップを用いて5つの作物栽培システムから採取した皮質花粉のペレット色と分類学的多様性を提示する。

Researchers often collect and analyze corbicular pollen from honey bees to identify the plant sources on which they forage for pollen or to estimate ...

このプロトコルには、花粉トラップを使用した角質花粉の収集、色による花粉の選別、およびアセト分解の3つの方法が記載されています。これらの方法は、受粉効率、花粉媒介者の採餌動態、食事の質と多様性など、花粉媒介者に関連する研究で一般的に使用されています。花粉トラップは、ミツバチのコロニーから大量の花粉を収集する簡単な方法です。花粉ペレットを色で分類することは、専門知識を必要としない花粉を分類するための手頃な方法であり、アセトリシスにより、各ペレットの色に関連する植物分類群を特定できます。手順を実演するのは、教員研究助手のエレン・トピッツホーファーと、私の研究室の大学院研究助手であるエミリー・カーソンです。まず、目的の養蜂場の場所から花粉を捕獲する時期を決定し、花粉を捕獲するのに最適なミツバチのコロニーを選択します。コロニーの入り口に戻る採餌者を2分間カウントしてコロニーの強度を評価し、戻ってきた採餌者の総数が最も多いコロニーを選択します。できれば余分な入り口やゆがんだ蓋のない、良好な状態の木製製品を備えたじんましんを選択してください。そのようなコロニーに戻る採餌蜂はトラップの入り口に向きを変える可能性が高いため、代替の入り口が少ないコロニーを使用してください。可能な限り、南向きのハイブの入り口を選択してください。じんましんがパレット化されている場合は、特定のパレットの同じ方向を向いているすべてのコロニーに花粉トラップを設置して、採餌者が隣接する巣箱の入り口に漂流するのを防ぎます。必要に応じて、幼虫の存在についてフレームを検査することによってコロニーのひなの巣を評価し、比較的大量の幼虫がいるコロニーを選択します。次に、選択したミツバチのコロニーに花粉トラップを取り付けます。フロントマウントトラップの場合は、ステープル、ネジ、テープで入り口の前にトラップを取り付けるか、トラップをハイブに巻き付けられたバンジーコードに接続します。コロニーへの他のすべての可能な入り口を、ラテックスやポリウレタンフォーム、またはオーガー穴用の8番のハードウェアクロスなどの非粘着性で成形可能な材料でシールします。小さなひび割れには粘着テープを使用してください。地上の巣箱にあるフロントマウントトラップを使用する場合は、露による湿気による損傷を避けるために、収集バスケットと草の間にゴムマットなどのバリアを配置します。設置から24時間後、その日の採餌飛行が始まる前に、花粉トラップの捕獲メカニズムを作動させます。収集トレイから特定の花粉を収集し、ビニール袋または遠心チューブに入れてから、氷を入れたクーラーボックスに保管します。スクーパーまたは大きなスプーンを使用して、代表的なサブサンプルとして10グラムの花粉をすくい取ります。サブサンプルからすべてのミツバチの部分と破片を取り除き、花粉の色とテクスチャの両方を使用して10グラムのサブサンプルの各花粉ペレットをカラーグループに分類し、グループを区別します。下流工程で各色グループの少なくとも0.25グラムを確保するには、少なくとも0.25グラムの色グループを形成するのに十分に豊富ではないペレットをその他のグループに配置します。Pantoneカラーガイドを使用して、個々のカラーグループに名前を付けます。各カラーグループから0.25グラムの花粉ペレットを量ります。適切なPPEを着用してください。次に、500グラムの色群花粉を含む各微量遠心管に0.25マイクロリットルの氷酸性酸をゆっくりと加えます。チューブを目視検査しながら、きれいなつまようじで花粉を10〜15秒間かき混ぜます。サンプルを1、100倍Gで3分間遠心分離し、上清を酸廃ビーカーにデカントします。アセト分解混合物を調製するには、ビーカー標識アセトン分解混合物に10.8ミリリットルの氷酸性を加えます。次に、原液から1, 200マイクロリットルの濃硫酸をゆっくりと加えます。各チューブに1, 000マイクロリットルのアセト分解混合物をゆっくりと加え、きれいなつまようじで10〜15秒間攪拌します。摂氏80度に予熱したヒートブロックにサンプルを置きます。チューブを5分間インキュベートし、インキュベーションの途中できれいなつまようじで各チューブを完全に攪拌します。インキュベーション後、500マイクロリットルの氷酢酸を各チューブにゆっくりと加え、きれいなつまようじで10〜15秒間攪拌します。サンプルを遠心分離し、各チューブの上清を酸廃ビーカーにデカントします。各チューブに1, 000マイクロリットルの蒸留水を加え、きれいなつまようじで攪拌することにより、各サンプルを水で3回すすぎます。サンプルを遠心分離し、上清をチューブから重曹のビーカーにデカントします。その後、水すすぎをさらに2回繰り返します。エタノールビーカーから各チューブに1, 000マイクロリットルの95%エタノールを加え、きれいなつまようじでかき混ぜます。次に、サンプルを遠心分離し、上清をチューブからエタノール廃ビーカーにデカントします。サフラニン-O染色ストック溶液を混合し、各チューブに5〜10滴を加えます。つまようじで10〜15秒間かき混ぜ、つまようじをチューブに入れたままにします。エタノールビーカーから1, 000マイクロリットルの95%エタノールを各チューブに加えて攪拌する。サンプルを遠心分離した後、上清をエタノール廃ビーカーにデカントします。各チューブに10〜15滴のグリセリンを加え、内容物を10〜15秒間攪拌します。チューブをヒュームフードで開いたままにして、周囲の室温で少なくとも2時間エタノールを蒸発させます。花粉識別用の顕微鏡スライドにラベルを付けます。チューブから花粉残留物を1滴取り除き、ラベル付けされた顕微鏡スライドの中央に配置し、滴がわずかに広がるようにします。スライドのドロップの上にきれいなカバースリップを置き、透明なマニキュアでカバースリップをスライドに密封します。記載された方法を使用して、花粉を収集し、色で分類し、各ペレット色グループの植物源を特定して花粉の多様性を評価しました。すべての花粉収集サンプルには、複数の識別可能な色グループがありました。いくつかのサンプルでは、花粉の色グループはわずか4〜5個のペレットを含んでいました。しかし、ほとんどのグループは有意に多く、アセト分解のための独自の標識色グループとして機能しました。アセト分解後、明視野光学顕微鏡を用いて、各調査地周辺から採取したバウチャー標本の形態学的特徴と形態学的特徴を確認することにより、各色群を可能な限り低い分類学的ランクに効果的に識別した。アーモンド作物の場所から収集された花粉は、他の作物から収集された花粉よりも花粉の多様性が比較的低く、サイトあたり3.2の植物分類群で平均3つのペレット色があり、選別された花粉は、ミツバチの飼料植物に見られる農薬を解明するための農薬をテストしたり、ミツバチに対する栄養価を決定するために化学組成を分析したりすることができます。この研究の結果は、コロニーによって収集された花粉で観察された種の多様性に関する貴重な洞察を提供し、アーモンド作物システムで収集された花粉の多様性が大幅に低いことを浮き彫りにしました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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