SITUハイブリダイゼーションにおける免疫RNA-蛍光を用いたSARS-CoV-2の可視化
2020年12月23日
ここでは、その蛍光におけるRNA蛍光をその蛍光(RNA-FISH)と免疫蛍光と組み合わせて、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAを可視化する簡単な方法を説明する。このプロトコルは、単一細胞レベルでのSARS-CoV-2 RNA-宿主相互作用の分子特性の理解を深める可能性がある。
このプロトコルにより、細胞株および完全分化型の三次元ヒト気道上皮培養物中のSARS-CoV-2 RNAの可視化が可能になり、ウイルスの病原性と複製をシングルセルレベルでより深く理解するためのツールが提供されました。この方法は、その高い特異性、感度、分解能により、SARS-coronavirus-2の基礎科学研究だけでなく、診断などの応用プロジェクトにも有用です。その手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるAgnieszka Suderです。
本文原稿に記載されているように細胞を固定し、透過処理した後、ウェルから1X PBS溶液を取り出し、各ウェルに少なくとも300マイクロリットルの増幅バッファーを加えます。サンプルを室温で30分間インキュベートします。各HCRヘアピンは、別々のチューブで目的のボリュームをスナップ冷却して準備します。
300マイクロリットルの増幅溶液を調製するには、各ヘアピンに18ピコモルを使用します。ヘアピン溶液をチューブに移し、摂氏95度で90秒間インキュベートします。その後、暗闇の中で30分間室温まで冷却します。
スナップ冷却されたH1ヘアピンとH2ヘアピンを増幅バッファーに追加して、ヘアピン混合物を調製します。30〜50マイクロリットルのヘアピン混合物をパラフィルムに滴下します。細胞の入ったカバースリップをヘアピン混合物の滴上に置き、サンプルを室温で暗所で一晩インキュベートします。
スライドを取り付けるには、10マイクロリットルの封入剤を2滴スライド上に置き、液滴が十分に分離され、2枚のカバーガラスが1枚のスライドに置けるようにします。清潔なタオルのカバースリップを軽くたたいて、余分な液体を取り除きます。次に、セルを下に向けて色あせ防止封入剤に入れます。
マウントされたサンプルを暗闇の乾燥した平らな面に置き、硬化させます。本文原稿に記載されているようにHAE細胞を固定し、透過処理した後、サンプルを増幅バッファーと室温で30分間インキュベートして、サンプルを前増幅します。各ヘアピンの30ピコモルを使用して、500マイクロリットルの増幅溶液を調製します。
ヘアピン溶液をチューブに移し、摂氏95度で90秒間インキュベートします。その後、暗闇の中で30分間室温まで冷却します。スナップ冷却したすべてのヘアピンを室温で500マイクロリットルの増幅バッファーに追加して、ヘアピン溶液を調製します。
プレアンプ溶液を取り外し、完全なヘアピン溶液を追加します。次に、サンプルを室温で暗所で一晩インキュベートします。トランズウェルインサートからの切り抜きメンブレンを、セルを上に向けて10マイクロリットルの退色防止封入剤に置き、メンブレンに封入剤を追加します。
次に、膜をカバースリップで覆います。この免疫-RNA-FISHプロトコールは、Vero細胞株と3Dヒト気道上皮培養の2つの細胞系で実施されました。ここでは、感染細胞と模擬接種したVero細胞におけるSARS-コロナウイルス-2サブゲノムRNAの局在を示しています。
ウイルスRNAは赤で見ることができます。ここでは、感染したヒト気道上皮細胞および模擬接種されたヒト気道上皮細胞におけるSARS-コロナウイルス-2サブゲノムRNAの局在を示しています。透過化プロトコルは、Vero細胞で最適化されました。
界面活性剤による透過処理では、SARS-コロナウイルス-2サブゲノムRNAの明確な特異的なシグナルが得られますが、エタノールを使用すると、画像がぼやけて焦点が合っていない結果になります。Veroセルでスライドを取り付ける場合は、セルを下に向けてカバースリップを配置することが重要です。HAEスライドを取り付けるときは、細胞を上に向けてメンブレンを配置する必要があります。
この手法は、ノンコーディングRNAや将来出現する可能性のあるRNAウイルスなど、あらゆるRNAの検出を可能にするために簡単に変更することができます。免疫蛍光法と組み合わせることで、単一細胞レベルでのタンパク質-RNA相互作用の研究に使用できます。
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概要
この記事では、RNA蛍光in situハイブリダイゼーション（RNA-FISH）と免疫蛍光を統合してSARS-CoV-2 RNAを可視化する手法を紹介します。この手法により、単一細胞レベルでのSARS-CoV-2 RNA-宿主相互作用の理解が深まります。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- ウイルス学
- 細胞生物学
背景
- ウイルスの病原性の理解は、効果的な診断法と治療法の開発に不可欠です。
- SARS-CoV-2は公衆衛生に重大な影響を及ぼします。
- 単一細胞レベルでのRNAの可視化は、ウイルスの複製に関する洞察を提供します。
- RNA-FISHと免疫蛍光を組み合わせることで、高い特異性と感度が得られます。
研究の目的
- 様々な細胞モデルでSARS-CoV-2 RNAを可視化する。
- 宿主細胞内でのウイルス相互作用の理解を深める。
- ウイルス学における基礎研究と応用研究の両方のためのツールを提供する。
使用された方法
- 細胞の固定と通過性化。
- RNA可視化のための増幅バッファーの適用。
- 特定のRNA検出のためのHCRヘアピンの使用。
- RNA-FISHを補完する免疫蛍光技術。
主要な結果
- SARS-CoV-2 RNAは細胞株とヒト気道上皮培養で成功裏に可視化されました。
- この方法は高い特異性と感度を示しました。
- 結果はウイルス病原性のより良い理解に貢献します。
- このプロトコルは研究と診断目的の両方に適用可能です。
結論
- この組み合わせ方法は、単一細胞レベルでのSARS-CoV-2の研究に効果的です。
- RNA-宿主相互作用の貴重な洞察を提供します。
- このアプローチは診断ツールの開発に役立ちます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral replication and localization in physiologically relevant systems.
- Supports functional validation of host-virus interaction targets at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific infection events from background.
- Provides high-confidence data for triaging antiviral targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for viral RNA detection in cell-based assays.
- Supports assay standardization and reproducibility across cell lines and 3D cultures.
- Enables multiplexed detection of RNA and protein targets for comprehensive screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant airway models for translational continuity.
- Enables mapping of infection and host response in preclinical tissue systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, single-cell data.
- Facilitates biomarker discovery through simultaneous RNA and protein visualization.
Pipeline & Workflow Integration
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides high-specificity detection of viral RNA for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables single-cell resolution measurements and multiplexed readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and ex vivo models for preclinical validation of infection and host response.
- Enterprise Reuse: Adaptable for detection of any RNA, supporting rapid deployment against emerging pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral pathogenesis studies.
- Operational Value: Standardizes sensitive, multiplexed detection workflows across diverse biological models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to confocal imaging platforms and validated amplification reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across cell and tissue models.
- Adaptable to various RNA targets with protocol optimization for new systems.
- Dependent on careful permeabilization and mounting to ensure signal specificity and clarity.
