CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定
July 1st, 2021
ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera (Hübner)胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体同定のプロトコルを紹介します。変異昆虫は、生体内の異なる遺伝子間の遺伝子機能および相互作用のさらなる研究を可能にする。
コットンボルワームは世界で最も破壊的な害虫の1つです。CRISPR/Cas9技術によるゲノム編集により、この生物の遺伝子機能や遺伝子間の相互作用をさらに研究することができます。この技術の2つの主な利点は、それが高い特異性を有し、遺伝可能であることである。
sgRNA標的を選択するには、CRISPRオンラインWebサイトにアクセスして、可能なガイドサイトと遺伝子の5つの主要な非翻訳領域に近いエクソンを検索します。テキストボックスにエクソン配列を入力し、ヘリコベルパ・アルミゲラの標的ゲノムを選択します。20 BPNGGのPAMオプションを選択し、ウェブサイトのユーザーマニュアルに従って、デフォルトのパラメータに他の設定を残します。
ソフトウェアから予測されたガイドシーケンスを比較し、予測効率が最も高く、ミスマッチが最も少ない5つのプライム非翻訳領域の近くに1つまたは2つのグアニンを含む20塩基対のガイドシーケンスを選択して、編集効率を向上させ、オフターゲット編集を削減します。胚調製のために、3日齢の男性と2日齢の女性から50人の健常者を選択し、それらをきれいなネットケージに混ぜる。10%砂糖溶液を含む湿った綿片をケージに入れます。
ネットケージをガーゼで覆い、ガーゼを輪ゴムで固定します。ガーゼに水をスプレーして湿らせます。黒い布を適切な大きさにカットし、湿ったガーゼをこの黒い布と交換して、30分間自由な卵子の位置を可能にします。
顕微鏡スライドに両面テープを貼り付けます。鉗子を使用して、両面テープの表面に卵の入ったパッチを一列に貼り付けます。各パッチの余白を押して、テープにしっかりとくっついていることを確認します。
顕微鏡スライドあたり50〜100個の卵を集める。マイクロインジェクションの前に、顕微鏡を氷の上にスライドさせて胚の発生を遅らせてください。本文原稿に記載されているようにマイクロピペットプーラーを用いてキャピラリーガラスを引っ張って針を準備する。
マイクログラインダーを使用して針先を鋭利な先端に研削します。PCRチューブ内のRNaceフリー水に市販のCas9タンパク質とsgRNAの2マイクロリットルを加えて注射液を調製し、10マイクロリットルの容量混合物を得た。ピペッティングでよく混ぜて氷の上に置きます。
電子マイクロインジェクタのパラメータを設定します。マイクロローダーピペットチップを使用して2マイクロリットルの混合物を針にロードし、ニードルの先端にできるだけ多くの残留空気を排出する。注射針をマイクロマニピュレーターに接続し、2つの部品をしっかりと接続します。
スライドをペトリ皿に置き、顕微鏡のステージに置きます。針先を胚の上半球に45度の角度で慎重に挿入する。ペダルを押して混合物を胚に送り込み、胚のわずかな膨張をもたらす。
胚からすぐに針を引っ込め、次の胚が針に接するまで片手でペトリ皿を動かします。十分な孵化量を確保するために、同じ手順を用いて少なくとも300個の胚を注入する。注射後にペトリ皿の蓋を覆う。
胚の表面色が暗くなったら、顕微鏡スライドの周りのペトリ皿に人工飼料を入れます。24穴培養プレートを用意し、各ウェルを体積容量の1/3まで人工飼料で満たします。小さなペイントブラシを使用して孵化幼虫を選び出し、1つの井戸に1つの幼虫が1匹いるように、それらを24ウェル培養プレートに移す。
幼虫が第3齢期に成長したら、それらを新しいガラス延性エトラエに移す。新しく封入されたG-zeroオス成虫と野生型雌成虫を、同じ比率で新鮮なネットケージに移す。綿球に落とした10%砂糖溶液を彼らに供給します。
G-oneの蛹化まで日常的な方法を用いて昆虫を後方にする。鉗子を使用して後肢を慎重に取り除き、各脚をライシングマトリックスチューブに入れます。組織ホモジナイザーを使用して後肢を均質化する。
ホモジナイズされた試料のゲノムDNAを、製造元の指示に従って市販のgDNA抽出キットを用いて抽出する。テキスト原稿からジェノタイピングプライマーおよびPCR反応条件を用いて遺伝子セグメントを増幅する。遺伝子シーケンシングサービスで遺伝子型を確認します。
同じ遺伝子型のG-one個体を1つのネットケージに入れ、G-one子孫を自己横断し、同じ方法を用いてスクリーニングを継続する。目的遺伝子の標的部位は、その第2エクソンに位置していた。この部位は高度に保存され、合成されたsgRNAの標的バンド断片をアガロースゲル電気泳動を用いて確認した。
単一のsgRNA標的の変異体検出は、G-one親ユニットからのPCR産物を配列決定することによって行った。異なるエクソン間で重複しないsgRNAペアを使用することの有効性は、変異体の大きな欠失が野生型パンと容易に区別されるため、実証された。一定数の変異個体を得た後、電気生理学的または行動学的実験を行い、異なる遺伝子間の遺伝子機能および相互作用を明らかにすることができる。
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概要
この記事では、Helicoverpa armigeraの胚へのマイクロインジェクションを行い、CRISPR/Cas9ゲノム編集を用いてノックアウト変異体を同定するためのプロトコルを提示します。この技術により、遺伝子機能と相互作用に関する生体内研究が可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 遺伝学
- 昆虫学
- ゲノム編集
背景
- Helicoverpa armigeraは重要な農業害虫です。
- CRISPR/Cas9技術は遺伝子編集に高い特異性と遺伝性をもたらします。
- 遺伝子相互作用の理解は害虫管理に不可欠です。
- マイクロインジェクション技術はノックアウト変異体の作成に必要不可欠です。
研究目的
- 胚のマイクロインジェクションのための信頼できるプロトコルを確立すること。
- ノックアウト変異体の同定を促進すること。
- Helicoverpa armigeraの遺伝子機能に関する研究を強化すること。
使用した方法
- オンラインのCRISPRツールを用いたsgRNAターゲットの選択。
- CRISPR/Cas9コンポーネントを用いた胚のマイクロインジェクション。
- 成功したノックアウト変異体のスクリーニング。
- 生体内での遺伝子機能と相互作用の分析。
主要な結果
- 成功したマイクロインジェクションによりノックアウト変異体を作成しました。
- さらなる研究が可能な遺伝子相互作用を特定しました。
- Helicoverpa armigeraにおけるCRISPR/Cas9の有効性を示しました。
- この種の将来の遺伝学的研究のための枠組みを提供しました。
結論
- このプロトコルはHelicoverpa armigeraでの効率的な遺伝子編集を可能にします。
- ノックアウト変異体は遺伝子機能の理解に有益です。
- この研究は遺伝学的研究を通じた害虫管理戦略に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Helicoverpa armigera enables precise functional interrogation of gene targets in a major agricultural pest, supporting translational research in pest control and resistance mechanisms. The protocol's specificity and heritability facilitate robust target validation and mechanistic de-risking at early discovery stages. This workflow strengthens predictive confidence for gene function studies and informs portfolio decisions in agricultural biotechnology R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct knockout of candidate genes to clarify their biological roles in vivo.
- Supports functional target validation by linking genotype to phenotype in a disease-relevant pest model.
- Reduces mechanistic ambiguity by allowing systematic gene disruption and downstream phenotypic analysis.
- Facilitates portfolio triage by providing actionable data on gene essentiality and interaction.
Screening & Assay Development
- Prepares validated mutant lines for downstream behavioral and electrophysiological assays.
- Standardizes knockout generation, improving reproducibility and comparability across experiments.
- Enables quantitative assessment of gene disruption efficiency via PCR and sequencing outputs.
- Supports scalable screening of multiple gene targets using non-overlapping sgRNA pairs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene function studies with translational goals in pest management and resistance research.
- Provides continuity from genetic manipulation to phenotypic validation in a relevant model organism.
- De-risks advancement of gene targets by confirming functional impact prior to field or applied studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification, enabling iterative hypothesis testing and functional validation in H. armigera and related Lepidoptera.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven knockout of target genes and pathway elucidation.
- Screening: Delivers reproducible mutant lines and quantitative genotyping outputs for downstream assays.
- Analytics: Provides PCR and sequencing-based confirmation of gene disruption for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges genetic manipulation with phenotypic and behavioral validation in pest models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genome editing workflow applicable to other Lepidopteran species.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and target validation.
- Operational Value: Standardizes genome editing and mutant identification for scalable research.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking genotype to phenotype in a key pest species.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene targets for translational advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo microinjection and molecular genetics workflows.
- Needs access to microinjection equipment, PCR, and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization for mutant screening and genotyping protocols.
- Adaptable to other Lepidopteran models with protocol optimization.
- Efficiency may vary based on sgRNA design and embryo handling, as noted in troubleshooting guidance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:29
Design of Gene-Specific Primers and Preparation of sgRNA and Embryos
2:18
Microinjection of Embryos
3:47
Post-Injection Insect Rearing
4:41
Knock-Out Mutation Detection
5:27
Results: Selection and Synthesis of Target sgRNAs and Detection of Mutants by PCR and Gel Electrophoresis
6:08
Conclusion
