Name: CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9によるHelicoverpa armigeraの胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体同定法。遺伝子機能と相互作用のin vivo研究に有用な、高特異性で遺伝可能なゲノム編集プロトコルを解説します。

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この研究は、中国国家自然科学財団(31725023、GW 31861133019、31171912 CY)の支援を受けた。

1. 遺伝子特異的プライマーの設計とsgRNAの作製
<ol><li>目的の遺伝子内の保存されたゲノム領域を、PCR 増幅およびシーケンシング解析によって検証します。 H. armigera のゲノムDNAから標的遺伝子を増幅し、エクソンとイントロンを区別する。 注:ガイド部位の配列特異性は、オフターゲット遺伝子編集を避けるために必要です。エクソン中の探索可能なガイド部位は、遺伝子の5'UTRに近い。次に、遺伝子が完全に機能していないことを確認することが重要です。sgRNAの調製のための流路の概要を 図1に例示する。</li>
	<li>sgRNAターゲットを選択します。CRISPRオンラインウェブサイト CRISPOR (Version 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py)を使用して、遺伝子の5' UTRに近いエクソン内の可能なガイドサイトを検索します。テキストボックスにエクソン配列を入力し、 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Harm_1.0)の標的ゲノムを選択します。「20 bp-NGG」のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)オプションを選択し、ウェブサイトのユーザーマニュアルに従ってデフォルトのパラメータに他の設定を残します。</li>
	<li>ソフトウェアから予測されたガイドシーケンスを比較し、予測効率が最も高く、ミスマッチが最も少ないガイドシーケンスを選択して、編集効率を向上させ、ターゲット外の編集を減らします。5' UTRに1つまたは2つのGを含む20 bpのガイドシーケンスは、切断効率を高める可能性があるため、推奨されます。 注: 大きなセグメント欠失を得るためには、エクソン領域にわたる gRNA のペアも推奨され、後のステップでの変異体の検出が簡素化されます。選択した 2 つのガイド シーケンス間の間隔距離が 100 bp 以上であることを確認します。このプロトコルでは、NGGモチーフを認識する一般的に使用されるSpCas9タンパク質を選択します。製造業者の指示によれば、Gを欠いているガイド配列も、プロモーターが配列の5' UTRにGを付加するので、T7プロモーターを選択する際にも許容される。</li>
	<li>順方向および逆方向のオリゴヌクレオチドを設計します。配列順序を5'-20 bpガイド配列-NGG-3'に設定し、ガイド配列を逆相補する。T7プロモーター配列を順鎖および逆鎖ガイド配列にそれぞれ、gRNA合成キットのユーザーガイドに従って追加する。 注:PAM配列NGGはオリゴヌクレオチド配列から除外されるべきである。</li>
	<li>gRNA合成キットを用いてsgRNAを生成する。このプロセスには、DNAテンプレートの組み立て、インビトロ転写、およびsgRNAの精製の3つのステップが含まれます(図2)。ユーザーの指示に従って各手順を実行します。</li>
</ol>2. 胚の準備と収集
<ol><li>Hongtao et al.34 によって記述されているように、雄と雌の蛹を分離し、それらを2つの異なる網のケージに分離する。エクロジション後、脱脂綿中の10%(w/v)白糖溶液をペトリ皿に約30mL与えます。 注:3gの白糖を30mLの滅菌水に溶解し、10%(w/v)白糖溶液を調製した。</li>
	<li>生後3日齢の男性と生後2日の女性からそれぞれ50人の健常者を選択し、清潔なネットケージに混ぜる。10%(w / v)糖液を含む綿片をケージに入れ、綿を湿らせたままにします。ネットケージをガーゼで覆い、ガーゼを輪ゴムで固定します。ガーゼに水をスプレーして湿らせます。</li>
	<li>ステップ2で選択した雄と雌の蛾が完全に交尾し、産卵量を観察できるようにします。 注: H. armigera の産卵のピークは、午後9時以降に現れ.mす。したがって、交配の時間は、その後のステップで十分な数の卵を確保するために考慮されるべきである。産卵のピーク時に、ガーゼを黒い布と交換し、30分間自由な産卵を有効にします。新鮮な卵を集めるために30分ごとに黒い布を交換してください(図3A)。</li>
	<li>黒い布を約3mmの大きさの不規則な形のパッチに切ります。各パッチでより多くの卵を確保してください。 注:しわのある卵は通常未受精であるため、選択しないでください。</li>
	<li>顕微鏡スライド(25 mm x 75 mm)に両面テープを貼り付けます(図3B)。鉗子を使用して、両面テープの表面に卵の入ったパッチを一列に貼り付けます。各パッチの余白を押して、テープにしっかりとくっついていることを確認します。顕微鏡スライドごとに50〜100個の卵を収集します(図3C)。 注:パッチは両面テープの表面全体を覆う必要があります、さもなければ孵化幼虫は這い上がるのが難しくなります。</li>
	<li>マイクロインジェクションの前に、顕微鏡を氷の上にスライドさせて胚の発生を遅らせてください。</li>
</ol>3. 胚のマイクロインジェクション
<ol><li>マイクロピペットプーラーを用いてキャピラリーガラスを引っ張って針を準備する(図4A)。 熱 を 540、 プル を 80、 ベル を 75、 時間を 170、 圧力 を 450 に設定します。マイクログラインダーを用いて針先を研削する。理想的な針は、鋭い刃先を示しています(図4B)。</li>
	<li>注射液の調製。PCRチューブ内のRNase非含有水に、市販のCas9タンパク質(1mg/mL)およびsgRNA(最終濃度300~500ng/μL)2 μLを加え、10 μL容量混合物を得た。sgRNAの体積は、その濃度に依存する。ピペッティングでよく混ぜて氷の上に置きます。 注:このステップで使用するピペットチップとPCRチューブはすべてRNaseフリーです。</li>
	<li>電子マイクロインジェクタのパラメータを設定します。射出圧力(pi)を1,500hPa、射出時間(ti)を0.1s、補償圧力(pc)を30hPaに設定してください。</li>
	<li>マイクロローダーピペットチップを用いて2 μLの混合物を針にロードする。針の先端の残留空気はできるだけ排出する必要があります。</li>
	<li>注射針をマイクロマニピュレーターに接続し、2つの部品をしっかりと接続します。</li>
	<li>スライドをシャーレ(100mm)に置き、顕微鏡のステージ上に置きます(図5A)。</li>
	<li>顕微鏡下で針先と胚の両方が見えるまで、光学顕微鏡下で針先の位置を調整します(図5B)。</li>
	<li>液滴の音量を調整します。ペダルを押し、針先の液体滴を観察します。液体滴の体積が胚の体積の約10分の1になるまで、マイクロインジェクタの注入圧力を調整する。 注:注射針の品質は、胚の生存率にとって不可欠です。</li>
	<li>針先を胚の上半球に45度の角度で慎重に挿入します(図5C)。ペダルを押して混合物を胚に送達する。注射は胚のわずかな拡大をもたらす。胚から直ちに針を引っ込め、次の胚が針に接するまで片手でペトリ皿を動かし、同じ手順で次の胚を注入する。 注:ピンホールでの細胞質流出は許容されます。細胞質の漏れが多すぎる場合は、液体の流出が制御されるまで、針の角度をより厳しい角度に調整します。</li>
	<li>十分な孵化量を確保するために、少なくとも300個の胚を注入する。注射後、ペトリ皿の蓋を覆います。 注:産卵から50〜100個の胚の注射までの時間は2時間に制限されています。胚のほとんどは、この時間枠内でまだ1細胞段階にあります。一般に、効率を促進するために胚注入中に産卵手順を繰り返すことは有用である。</li>
</ol>4. ポストインジェクション昆虫飼育
<ol><li>G0胚の繁殖。<ol>
<li>胚を相対湿度60%、暗10時間で人工気候ボックス内で28°Cで孵化させる。</li>
		<li>注射後に毎日胚の発生を確認してください。胚の表面色が暗くなったら、顕微鏡スライドの周りのペトリ皿に人工飼料を入れ、12時間ごとに胚の発生を確認します。 注:人工食は、Wu et al.35およびJha et al.36 によって記載されるように調製される。</li>
		<li>24穴培養プレートを用意し、各ウェルを体積容量の3分の1まで人工飼料で満たします。</li>
		<li>小さな絵筆を使って孵化幼虫(図5D)を選び出し、24穴培養プレートに移します。各幼虫が生き残るのに十分な食物を持っていることを確認するために、井戸ごとに1つの幼虫を挿入します。 注: H. armigera の幼虫は、通常、互いに共食いしたため、各井戸で個別に飼育されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>G0幼虫飼育<ol>
<li>胚と同じ条件で幼虫を育てる。</li>
		<li>孵化した幼虫を毎日チェックしてください。幼虫が第3齢期まで成長したら、各幼虫を新しいガラスダクチルエトラエに移し、体積の5分の1を人工飼料で満たします。</li>
		<li>孵化後約12dで、成熟した幼虫は蛹化し始めるはずです。</li>
		<li>G0成熟した蛹は性別に基づいて区別され、閉鎖前に別々のケージに入れられる。野生型の同じ年齢の蛹も準備されています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>G0大人飼育<ol>
<li>野生型と変異型の蛹の両方の侵入を毎日チェックしてください。</li>
		<li>新しく閉じたG0のオス成虫と野生型メス成虫を新鮮なネットケージに移し、G0と野生型の比率を約1:1にします。綿球に落とした10%(w / v)砂糖溶液を彼らに供給します。</li>
		<li>後部昆虫は、第1世代(G1)の蛹化まで上記の日常的な方法を用いた。</li>
		<li>ダクチルエスラを使用して、新しく閉じたG1成虫の単一ペアを、10%(w / v)糖溶液が付属のプラスチック製の瓶(13cm x 12cm x 12cm)に移す。各瓶をガーゼで覆います。合計で約50組のG1成人を連れて行きます。 注:雌の蛾の侵入は、雄の蛾のそれよりも前です。一般的に、生後3日の男性と生後2日の女性は性的に成熟しており、交尾する準備ができています。新しく閉鎖された成虫は、摂食せずに最初の光期に交尾することはありません。</li>
		<li>彼らが卵を産んだ後、プラスチック製の瓶にG1の大人を集めます。各成虫の蛾を1.5mLの遠沈管に入れる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ノックアウト変異体検出
<ol><li>予測された切り詰められた部位にまたがる一対のプライマーを設計する。プライマーは、標的部位から両側(上流および下流)に少なくとも50bpの距離を設定する必要があります。 注:標的配列を同定するためのプライマーは、効率的に増幅するために大きなスパンをカバーすることが多い。</li>
	<li>セクション1で抽出したゲノムDNAを用いたジェノタイピングプライマーを用いてPCR反応を行う。PCRサイクルを95°Cで20秒間行う。95 °C で 20 秒間、55 °C で 20 秒間、72 °C で 1 分間のサイクルを 35 サイクル;72°Cで5分間、4°C保留にした。1%(w/v)アガロースゲルを介して反応生成物を検証する。選択された一対の検出用プライマーをPCR産物の品質により確認した。バンドが明らかで特異的であれば、プライマーはアンプリコンサイズに基づくさらなる変異体検出に使用することができる。</li>
	<li>潜在的な編集された個人のためのスクリーニング。鉗子を使用して後肢を慎重に取り外し、各脚をそれぞれ溶解マトリックスチューブに入れます。溶解マトリックスチューブに、ガラスのダクチルエスラ上の番号と一致するラベルを貼る。</li>
	<li>組織ホモジナイザーを使用して後肢を均質化する。速度を 6.0 m/s に、時間を 60 秒に設定します。ホモジナイズされた試料のゲノムDNAを、製造元の指示に従って市販のgDNA抽出キットを用いて抽出する。</li>
	<li>工程2で説明したのと同じPCR反応条件でジェノタイピングプライマーを用いて遺伝子セグメントを増幅する。遺伝子シーケンシングサービスにより遺伝子型を確認する。同じジャーに含まれるG1変異遺伝子型(同じ部位を標的とする)が検出されたら、G1の子孫を保持し、第2世代(G2)と改名する。</li>
	<li>同じ遺伝子型のG1個体を1つのネットケージに入れる。G1の子孫を自己横断し、同じ方法を使用してスクリーニングを続けます。</li>
	<li>遺伝子セグメントを増幅し、ステップ2で概説したのと同じ手順で遺伝子型を確認する。G2ホモ接合株を取得し、ノックアウト変異株を維持する。</li>
</ol>

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<li>Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+mediated+genome+editing+of+Helicoverpa+armigera+with+mutations+of+an+ABC+transporter+gene+HaABCA2+confers+resistance+to+Bacillus+thuringiensis+Cry2A+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins.</a> Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147(2017).</li>
<li>Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+two+ABC+transporter+proteins+in+mediating+toxicity+of+Bacillus+thuringiensis+to+cotton+bollworm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm.</a> PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427(2020).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+point+mutation+in+a+tetraspanin+gene+associated+with+field-evolved+resistance+of+cotton+bollworm+to+transgenic+Bt+cotton%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).</li>
<li>Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexing+of+Helicoverpa+assulta+and+Helicoverpa+armigera+pupae+based+on+machine+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Tobacco+Sciene+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision.</a> Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).</li>
<li>Wu, K., Gong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+practical+artificial+diet+for+the+cotton+boll-worm%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+science%22%5BJournal%5D)">A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm.</a> Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).</li>
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<li>Kamimura, M., Tatsuki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diel+rhythms+of+calling+behavior+and+pheromone+production+of+oriental+tobacco+budworm+moth%2C+Helicoverpa+assulta%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae).</a> Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).</li>
<li>Edwards, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+rhythms+of+lepidopterous+defoliators%3A+ii.+Halisidota+argentata+pack.+%28arctiidae%29%2C+and+nepytia+phantasmaria+stkr.+%28GEOMETRIDAE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE).</a> Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

CRISPR/Cas9システムの適用は、遺伝子機能や様々な遺伝子間の相互作用の解析に強力な技術サポートを提供してきました。ここで提示する詳細なプロトコルは、CRISPR/Cas9ゲノム編集による H. armigera におけるホモ接合体変異体の生成を実証する。この信頼性の高い手順は、 H. armigeraにおける指向性遺伝子突然変異誘発のための簡単な方法を提供する。
CRISPR標的部位の選択は、突然変異誘発効率に影響を与える可能性がある37。このプロトコルでは、オンラインサイトCRISPORからの複数の結果を比較および分析し、適切なターゲットサイトを取得しました。インシリコでは、gRNA予測はいくつかの利点を提示する。まず、彼らはオフターゲットの影響を最小限に抑えるためにsgRNAを設計する際に H. armigera の全ゲノムを解析した。上記のオンラインリソースとCHOPCHOP(http://chopchop.cbu.uib.no/)は、多くの鱗翅目ゲノムで機能し、他の...

ゲノム編集技術の応用は、多様な種において標的遺伝子変異体を達成するための効率的なツールを提供する。クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/関連タンパク質9(Cas9)システムの出現は、ゲノムを操作するための新しい方法を提供します1。CRISPR/Cas9システムはガイドRNA(gRNA)とCas9エンドヌクレアーゼ2,3からなり、gRNAはさらに標的相補的なCRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)の2つの部分に分けることができます。gRNAはCas9エンドヌクレアーゼと統合し、リボヌクレオタンパク質(RNP)を形成する。gRNAを用いると、Cas9エンドヌクレアーゼを塩基相補を介してゲノムの特定の部位に導くことができる。Cas9のRuvCドメインとHNHドメインは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列の3塩基前にゲノムの標的部位を切断し、二本鎖切断(DSB)を作り出します。DNA切断は、非相同末端結合(NHEJ)または相同性指向修復(HDR)4の2つのメカニズムを介して修復することができる。DSBの修復は、標的遺伝子を不活性化する方法として挿入または欠失を導入し、潜在的に遺伝子機能の完全な喪失を引き起こす。したがって、CRISPR/Cas9システムの遺伝性と特異性により、CRISPR/Cas9システムは、生体内の遺伝子機能を特徴付け、遺伝子相互作用を分析するための堅牢な方法となっています5。
CRISPR/Cas9システムは、多くのメリットにより、生物医学6,7、遺伝子治療8,9、農業10,11,12など様々な分野に応用され、微生物13、植物14,15、線虫16、哺乳類17を含む様々な生物系に利用されています。.無脊椎動物では、ショウジョウバエのメラノガスターなど、多くの昆虫種がCRISPR/Cas9ゲノム編集を受けています18,19,20,21,22。
ヘリコバーパ・アルミゲラは世界で最も破壊的な害虫の1つであり23、綿花、大豆、ソルガムなど数多くの作物に被害を与えています24,25。シーケンシング技術の発展に伴い、H. armigeraのゲノム、ならびに鱗翅目昆虫種の範囲のゲノムが完全に配列決定されました26,27,28,29。近年、これらの昆虫から多数の耐性および嗅覚受容体遺伝子が同定され、特徴付けられている19、27、28、29。いくつかの耐性関連遺伝子は、カドヘリン30、ATP結合カセットトランスポーター31、32、ならびにHaTSPAN133をコードする遺伝子など、H. armigeraにおいて同定されている。CRISPR/Cas9技術を用いたこれらの遺伝子のノックアウトは、感受性株におけるバチルス・チューリンゲンシス(BT)毒素に対する高レベルの耐性をもたらす。また、Chang et al. (2017)はフェロモン受容体をノックアウトし、交配時間調節におけるその有意な機能を検証した19。これらの報告は、CRISPR/Cas9が昆虫系における生体内の遺伝子機能を研究するための効果的なツールとして作用し得ることを示唆している。しかしながら、昆虫系におけるCRISPR/Cas9改変の詳細な手順は不完全なままであり、昆虫機能ゲノミクスにおけるその適用範囲が制限されている。
ここでは、CRISPR/Cas9システムを用いて H. armigera の機能遺伝子をノックアウトするためのプロトコルを提示する。gRNA産生、胚採取、マイクロインジェクション、昆虫飼育、および変異同定のための遺伝子特異的プライマーの設計および調製を含む、詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。このプロトコルは、 H. armigera の機能遺伝子を操作するための貴重な参照として機能し、他の鱗翅目種に拡張することができます。

<table><tbody><tr><td>2kb DNAラダー</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM101</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーガラス</td><td>ワールド 精密機器</td><td>504949</td><td>プロトコルで「キャピラリーガラス」と呼ばれる</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>ミネソタ鉱業製造株式会社</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ フェムトジェット 4i マイクロインジェクター</td><td>エッペンドルフ コーポレート</td><td>E5252000021</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf InjectMan 4 マイクロマニピュレーター</td><td>Eppendorf Corporate</td><td>5192000051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader Pipette Tips</td><td>Eppendorf Corporate</td><td>G2835241</td><td></td></tr><tr><td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A29377</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 スライド</td><td>セイル ブランド</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS (Premix)</td><td>Takara Biomedical Technology</td><td>R040</td><td>変異体検出に使用</td></tr><tr><td>Sutter Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>TIANamp Genomic DNA Kit</td><td>TIANGEN Corporate</td><td>DP304-03</td><td></td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A36499</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

コットンボールワーム、 ヘリカバーパアルミゲラは、世界で最も破壊的な害虫の1つです。分子遺伝学、生理学、機能ゲノミクス、行動研究の組み合わせにより、 H. armigera は鱗翅目Noctuidaeのモデル種となっています。異なる遺伝子間の相互作用のインビボ機能を研究するために、クラスター化された規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/関連タンパク質9(Cas9)ゲノム編集技術は、機能的ゲノム研究を行うために使用される便利で効果的な方法である。本研究では、CRISPR/Cas9システムを用いて H. armigera の遺伝子ノックアウトを段階的に体系的に完了させる方法を提供する。ガイドRNA(gRNA)の設計および合成について詳細に説明する。次に、ガイドRNA(gRNA)作成のための遺伝子特異的プライマー設計、胚採取、マイクロインジェクション、昆虫飼育、変異体検出からなるその後の工程をまとめる。最後に、遺伝子編集の効率を向上させるためのトラブルシューティングのアドバイスとメモが提供されています。我々の方法は、 H. armigera および他の鱗翅目の蛾におけるCRISPR/Cas9ゲノム編集の適用のための参照として役立つであろう。

このプロトコルは、CRISPR/Cas9技術を用いて H. armigera の遺伝子ノックアウト株を取得するための詳細な手順を提供する。このプロトコールによって得られた代表的な結果は、gDNA選択、胚採取および注入、昆虫飼育、および変異体検出について要約される。
本研究では、我々の目的遺伝子の標的部位は、その第2エクソンに位置していた(図2A)。この部位は高度に保存されており、合成したsgRNAの標的バンド断片をアガロースゲル電気泳動を用いて確認した(図2B、C、D)。
雄と雌の蛾は、当初、予定より早く交配するのを防ぎ、可能な限り十分な量の胚を確保するために、別...

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノム編集によって作成された Helicoverpa armigera (Hübner)胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体同定のプロトコルを紹介します。変異昆虫は、生体内の異なる遺伝子間の遺伝子機能および相互作用のさらなる研究を可能にする。

CRISPR/Cas9ゲノム編集 ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

コットンボルワームは世界で最も破壊的な害虫の1つです。CRISPR/Cas9技術によるゲノム編集により、この生物の遺伝子機能や遺伝子間の相互作用をさらに研究することができます。この技術の2つの主な利点は、それが高い特異性を有し、遺伝可能であることである。sgRNA標的を選択するには、CRISPRオンラインWebサイトにアクセスして、可能なガイドサイトと遺伝子の5つの主要な非翻訳領域に近いエクソンを検索します。テキストボックスにエクソン配列を入力し、ヘリコベルパ・アルミゲラの標的ゲノムを選択します。20 BPNGGのPAMオプションを選択し、ウェブサイトのユーザーマニュアルに従って、デフォルトのパラメータに他の設定を残します。ソフトウェアから予測されたガイドシーケンスを比較し、予測効率が最も高く、ミスマッチが最も少ない5つのプライム非翻訳領域の近くに1つまたは2つのグアニンを含む20塩基対のガイドシーケンスを選択して、編集効率を向上させ、オフターゲット編集を削減します。胚調製のために、3日齢の男性と2日齢の女性から50人の健常者を選択し、それらをきれいなネットケージに混ぜる。10%砂糖溶液を含む湿った綿片をケージに入れます。ネットケージをガーゼで覆い、ガーゼを輪ゴムで固定します。ガーゼに水をスプレーして湿らせます。黒い布を適切な大きさにカットし、湿ったガーゼをこの黒い布と交換して、30分間自由な卵子の位置を可能にします。顕微鏡スライドに両面テープを貼り付けます。鉗子を使用して、両面テープの表面に卵の入ったパッチを一列に貼り付けます。各パッチの余白を押して、テープにしっかりとくっついていることを確認します。顕微鏡スライドあたり50〜100個の卵を集める。マイクロインジェクションの前に、顕微鏡を氷の上にスライドさせて胚の発生を遅らせてください。本文原稿に記載されているようにマイクロピペットプーラーを用いてキャピラリーガラスを引っ張って針を準備する。マイクログラインダーを使用して針先を鋭利な先端に研削します。PCRチューブ内のRNaceフリー水に市販のCas9タンパク質とsgRNAの2マイクロリットルを加えて注射液を調製し、10マイクロリットルの容量混合物を得た。ピペッティングでよく混ぜて氷の上に置きます。電子マイクロインジェクタのパラメータを設定します。マイクロローダーピペットチップを使用して2マイクロリットルの混合物を針にロードし、ニードルの先端にできるだけ多くの残留空気を排出する。注射針をマイクロマニピュレーターに接続し、2つの部品をしっかりと接続します。スライドをペトリ皿に置き、顕微鏡のステージに置きます。針先を胚の上半球に45度の角度で慎重に挿入する。ペダルを押して混合物を胚に送り込み、胚のわずかな膨張をもたらす。胚からすぐに針を引っ込め、次の胚が針に接するまで片手でペトリ皿を動かします。十分な孵化量を確保するために、同じ手順を用いて少なくとも300個の胚を注入する。注射後にペトリ皿の蓋を覆う。胚の表面色が暗くなったら、顕微鏡スライドの周りのペトリ皿に人工飼料を入れます。24穴培養プレートを用意し、各ウェルを体積容量の1/3まで人工飼料で満たします。小さなペイントブラシを使用して孵化幼虫を選び出し、1つの井戸に1つの幼虫が1匹いるように、それらを24ウェル培養プレートに移す。幼虫が第3齢期に成長したら、それらを新しいガラス延性エトラエに移す。新しく封入されたG-zeroオス成虫と野生型雌成虫を、同じ比率で新鮮なネットケージに移す。綿球に落とした10%砂糖溶液を彼らに供給します。G-oneの蛹化まで日常的な方法を用いて昆虫を後方にする。鉗子を使用して後肢を慎重に取り除き、各脚をライシングマトリックスチューブに入れます。組織ホモジナイザーを使用して後肢を均質化する。ホモジナイズされた試料のゲノムDNAを、製造元の指示に従って市販のgDNA抽出キットを用いて抽出する。テキスト原稿からジェノタイピングプライマーおよびPCR反応条件を用いて遺伝子セグメントを増幅する。遺伝子シーケンシングサービスで遺伝子型を確認します。同じ遺伝子型のG-one個体を1つのネットケージに入れ、G-one子孫を自己横断し、同じ方法を用いてスクリーニングを継続する。目的遺伝子の標的部位は、その第2エクソンに位置していた。この部位は高度に保存され、合成されたsgRNAの標的バンド断片をアガロースゲル電気泳動を用いて確認した。単一のsgRNA標的の変異体検出は、G-one親ユニットからのPCR産物を配列決定することによって行った。異なるエクソン間で重複しないsgRNAペアを使用することの有効性は、変異体の大きな欠失が野生型パンと容易に区別されるため、実証された。一定数の変異個体を得た後、電気生理学的または行動学的実験を行い、異なる遺伝子間の遺伝子機能および相互作用を明らかにすることができる。

embryo-microinjection-knockout-mutant-identification-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

このビデオでは、トランスジェニック線虫株を作成する一般的な方法であるマイクロインジェクションについて説明しています。この例では、CRISPRベースの遺伝子編集のためのリボ核タンパク質(RNP)複合体を導入するためのマイクロインジェクションを使用しています。...

生殖腺マイクロインジェクション:C.エレガンスの生殖細胞系に直接化合物送達する方法

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胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

ここで rootworm 胚生殖細胞変換や CRISPR/Cas9-ゲノム編集など機能ゲノム試金の実行の目的のため収集、マイクロインジェクション precellular...

マイクロインジェクション ウエスタン トウモロコシ Rootworm、 Diabrotica virgifera virgifera胚の生殖細胞への変換、または CRISPR/Cas9 ゲノム編集

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キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

我々は、卵の飼育、マイクロインジェクション、およびゲノム編集後に変異株を生成し維持するために、ファイヤーブラット サーモビア家電...

ファクトブラトサーモビア家電におけるゲノム編集のための卵マイクロインジェクションと効率的な交配

このプロトコルは、胚の採取、注射、昆虫飼育、同定、および目的の突然変異の選択など、砂ハエにおけるCRISPR/Cas9標的突然変異のステップを詳述する。...

CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

昆虫の真社会性の多くの特徴は、コロニー内のコミュニケーションと分業に依存しています。マイクロインジェクションとCRISPRを介した突然変異誘発によるアリ胚の主要な調節遺伝子の遺伝子操作は、真社会性昆虫の利他的行動の性質に関する洞察を提供します。...

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

ここには、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集を介してゲノムを改変する目的で、または生殖系列形質転換を介して顕著な転移性要素を追加する目的で、前細胞トウモロコシウンカ胚を収集してマイクロ注入するためのプロトコルがあります。...

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

この研究は、CRISPR/Cas9リボヌクレアーゼベースのホモ接合型ローカスト変異体の構築の体系的に最適化された手順と、イナゴ卵の凍結保存と蘇生のための詳細な方法を提供します。...

CRISPR/Cas9技術を用いた渡りバッタのホモ接合変異体の構築

この論文は、オリエンタルショウジョウバエBactrocera dorsalisのCRISPR/Cas9突然変異誘発のための段階的なプロトコルを提示します。この標準化されたプロトコルによって提供される詳細な手順は、B.

オリエンタルショウジョウバエバクトセラ背側のCRISPR/Cas9変異誘発のためのプロトコル

本稿では、昆虫病原性線虫(EPN:昆虫寄生)線虫であり、新たな遺伝モデルである Steinernema hermaphroditum におけるCRISPR-Cas9媒介ゲノム工学を実証しています。この技術は変異体の作成に有用であり、相利共生および寄生共生に関連する線虫生物学の遺伝子機能の解明を可能にします。...

CRISPR-Cas9ベースの線虫 Steinernema hermaphroditum における変異誘発と変異系統の維持

学ぶCRISPR/Cas9によるHelicoverpa armigeraの胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体同定法。遺伝子機能と相互作用のin vivo研究に有用な、高特異性で遺伝可能なゲノム編集プロトコルを解説します。

CRISPR/Cas9ゲノム編集ヘリコベルパ・アルミゲラ (Hübner)の胚マイクロインジェクションとノックアウト変異体の同定

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