Name: プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶDNAテザリングT7 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写の制御法。人工核酸転写因子による遺伝子発現制御システムの構築と分子計算への応用可能性を解説します。

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L.Y.T.Cは、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)ディスカバリー・グラント、カナダ第一研究優秀基金(CFREF)から資金を受け取るトロント大学の医学設計イニシアチブに関する研究基金探査(NFRF-E)の新フロンティアからの寛大な支援を認めています。

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<li>Khalil, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biology+framework+for+programming+eukaryotic+transcription+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A synthetic biology framework for programming eukaryotic transcription functions.</a> Cell. 150 (3), 647-658 (2012).</li>
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<li>Howland, S. W., Tsuji, T., Gnjatic, S., Ritter, G., Old, L. J., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducing+efficient+cross-priming+using+antigen-coated+yeast+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Inducing efficient cross-priming using antigen-coated yeast particles.</a> Journal of immunotherapy. 31 (7), 607(2008).</li>
<li>Abil, Z., Ellefson, J. W., Gollihar, J. D., Watkins, E., Ellington, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+partnered+replication+for+the+directed+evolution+of+genetic+parts+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized partnered replication for the directed evolution of genetic parts and circuits.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2493-2512 (2017).</li>
<li>Baugh, C., Grate, D., Wilson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2.8+%C3%85+crystal+structure+of+the+malachite+green+aptamer11%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">2.8 Å crystal structure of the malachite green aptamer11.</a> Journal of Molecular Biology. Doudna, J. A. 301 (1), 117-128 (2000).</li>
<li>Chou, L. Y. T., Shih, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transcriptional+regulation+via+nucleic+acid-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro transcriptional regulation via nucleic acid-based transcription factors.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (11), 2558-2565 (2019).</li>
<li>Lykke-Andersen, J., Christiansen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C-terminal+carboxy+group+of+T7+RNA+polymerase+ensures+efficient+magnesium+ion-dependent+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The C-terminal carboxy group of T7 RNA polymerase ensures efficient magnesium ion-dependent catalysis.</a> Nucleic Acids Research. 26 (24), 5630-5635 (1998).</li>
<li>Pu, J., Disare, M., Dickinson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+C-terminal+modification+tolerance+in+full-length+and+split+T7+RNA+Polymerase+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Evolution of C-terminal modification tolerance in full-length and split T7 RNA Polymerase biosensors.</a> Chembiochem. 20 (12), 1547-1553 (2019).</li>
<li>Gardner, L. P., Mookhtiar, K. A., Coleman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+elongation%2C+and+processivity+of+carboxyl-terminal+mutants+of+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Initiation, elongation, and processivity of carboxyl-terminal mutants of T7 RNA polymerase.</a> Biochemistry. 36 (10), 2908-2918 (1997).</li>
<li>Yin, J., Lin, A. J., Golan, D. E., Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+protein+labeling+by+Sfp+phosphopantetheinyl+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Site-specific protein labeling by Sfp phosphopantetheinyl transferase.</a> Nature Protocols. 1 (1), 280-285 (2006).</li>
<li>Warden-Rothman, R., Caturegli, I., Popik, V., Tsourkas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortase-tag+expressed+protein+ligation%3A+combining+protein+purification+and+site-specific+bioconjugation+into+a+single+step%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sortase-tag expressed protein ligation: combining protein purification and site-specific bioconjugation into a single step.</a> Analytical Chemistry. 85 (22), 11090-11097 (2013).</li>
<li>Zhang, W. -B., Sun, F., Tirrell, D. A., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+macromolecular+topology+with+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (37), 13988-13997 (2013).</li>
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著者の誰かによって宣言する競合する財政的利益はありません。

本研究は、N末端SNAPタグ組換えT7 RNAPとBG官能オリゴヌクレオチドを共有結合させることによってT7 RNAポリメラーゼの活性を制御するDNAナノテクノロジーに触発されたアプローチを示し、その後TMDSD反応をプログラムするために使用された。設計上、SNAPタグはポリメラーゼのN末語に位置付けられており、野生型T7 RNAPのC末語がタンパク質構造コア内に埋もれ、DNAテンプレート28と重要な接触を行う。ポリメラーゼC末流を改変する以前の試みは、他の補償突然変異が導入されない限り、酵素活性の完全な損失をもたらした。対照的に、T7 RNAPのN末端融合は、融合タグの選択がポリメラーゼ活性に影響を与える可能性があるが、十分に許容される。異なるタグがRNAPアクティビティに与える影響は体系的に決定されていません。SNAPタグは、効率的かつ堅牢であるため、タンパク質およびオリゴヌクレオチドの量的な量論比のタグ付けを可能にするため選択されました。あるいは、他の結合化学は、Yb...

DNAコンピューティングは、計算の媒体として設計されたオリゴヌクレオチドのセットを使用します。これらのオリゴヌクレオチドは、ユーザー指定のロジックに従って動的に組み立て、特定の核酸入力に応答する配列でプログラムされています。概念実証研究では、計算の出力は、典型的には、ゲル電気泳動または蛍光プレートリーダーを介して検出することができる蛍光標識オリゴヌクレオチドのセットで構成されています。過去30年間で、さまざまなデジタル論理カスケード、化学反応ネットワーク、ニューラルネットワーク1、2、3など、ますます複雑化するDNA計算回路が実証されています。これらのDNA回路の作製を支援するために、合成遺伝子回路4、5の機能性を予測するために数理モデルが使用され、直交DNA配列設計6、7、8、9、10の計算ツールが開発されています。.シリコンベースのコンピュータと比較すると、DNAコンピュータの利点は、生体分子と直接インターフェースし、電源がない場合に溶液中で動作する能力、ならびに全体的なコンパクト性と安定性を備えています。次世代シーケンシングの出現により、DNAコンピュータの合成コストは、ムーアの法則11よりも速い速度で過去20年間減少しています。このようなDNAベースのコンピュータの応用は、現在、疾患診断12、13、分子生物物理学14、およびデータ記憶プラットフォーム15として、現れ始めている。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig01.jpg"> 図1:足のホールド媒介DNA鎖変位のメカニズム δの間のつま先は、部分二重での自由な非バインド シーケンスです。第2の鎖に相補的なドメイン(δ*)が導入されると、フリー δドメインはハイブリダイゼーションの足掛かりとして機能し、ストランド移行と呼ばれる圧縮/解凍可逆反応を通じて競合他社をゆっくりと置き換えることを可能にします( 安打 *)δの長さが長くなるにつれて、前進反応のΔGは減少し、変位はより容易に起こる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
現在までに、DNAコンピュータの大部分は、足のホールド媒介DNA鎖変位として知られる動的DNAナノテクノロジーの分野において確立されたモチーフを利用している(TMDSD,図1)16。このモチーフは、短い「足掛け」の突出し(すなわち、7-〜10ヌクレオチド(nt))を示す部分的に二本鎖DNA(dsDNA)二重から成る。核酸「入力」鎖は、足止めを通して部分的な二重鎖と相互作用することができる。これにより、部分的なデュプレックスからのストランドの 1 つの変位が起き、この解放されたストランドは下流の部分的なデュプレックスの入力として機能します。このように、TMDSD は信号のカスケードと情報処理を可能にします。基本的に、直交TMDSDモチーフは、ソリューションで独立して動作することができ、並列情報処理を可能にします。TMDSD反応には、足がかりを媒介するDNA鎖交換(TMDSE)17、二重長ドメイン18との「リークレス」足音、配列不一致の足掛かり19、および「ハンドホールド」媒介鎖変位20など多くのバリエーションがあった。これらの革新的な設計原則により、より細かく調整されたTMDSDのエネルギーとダイナミクスがDNAコンピューティングの性能を向上させることができます。
転写遺伝子回路などの合成遺伝子回路は、計算21、22、23も可能である。これらの回路は、タンパク質転写因子によって調節され、特定の調節DNA要素に結合することによって遺伝子の転写を活性化または再抑制する。DNAベースの回路と比較して、転写回路には複数の利点があります。まず、酵素転写は既存の触媒DNA回路よりもはるかに高い回転率を有し、入力の単一コピー当たりの出力のコピーが多く生成され、より効率的な信号増幅手段を提供する。さらに、転写回路は、治療用タンパク質をコードするアプタマーやメッセンジャーRNA(mRNA)などの異なる機能分子を計算出力として生成することができ、異なる用途に利用することができます。しかし、現在の転写回路の大きな制限は、スケーラビリティの欠如です。これは、直交タンパク質ベースの転写因子のセットが非常に限られており、新しいタンパク質転写因子のデノボ設計は技術的に困難で時間がかかるためです。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig02.jpg"> 図2:「テザー」および「ケージ」ポリメラーゼ複合体の抽象化およびメカニズム(AおよびB)のオリゴヌクレオチドテザーは、SNAPタグ反応を通じてT7ポリメラーゼに酵素的に標識されている。テザー補体オーバーハングを有する「フェイク」T7プロモーターからなるケージは、テザーとブロック転写活性にハイブリダイズすることを可能にする。(C)オペレータ(a*b*)が存在すると、オリゴヌクレオチドテザー(ab)上のつま先に結合し、ケージのb*領域を置き換え、転写が起こることを可能にする。この図は、チョウとシー27から変更されています。略語: RNAP = RNA ポリメラーゼ<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
この論文では、転写回路の機能性とDNAベース回路の拡張性を組み合わせた分子計算のための新しいビルディングブロックを紹介する。このビルディングブロックは、T7 RNAP共有結合体である一本鎖DNAテザー(図2A)このDNAテザリングT7 RNAPを合成するために、ポリメラーゼをN末端SNAPタグ24に融合させ、エシェリヒア・コリで組換え発現させた。次いで、SNAPタグを、BG基質と機能するオリゴヌクレオチドと反応させた。オリゴヌクレオチドテザーは、DNAハイブリダイゼーションを介してポリメラーゼに近接した分子ゲストの位置決めを可能にする。そのようなゲストの1つは、下流に遺伝子のない「フェイク」T7プロモーターDNAデュプレックスで構成される「ケージ」と呼ばれる競争的な転写ブロッカーでした(図2B)。オリゴヌクレオチドテザーを介してRNAPに結合すると、ケージはRNAP結合のための他のDNAテンプレートを上回ることによってポリメラーゼ活性を失速させ、RNAPを「オフ」状態でレンダリングする(図2C)。
ポリメラーゼを「ON」状態に活性化させるために、T7遺伝子のT7プロモーターの上流に一本鎖「オペレータ」ドメインを有するT7 DNAテンプレートが設計された。オペレータドメイン(すなわち、ドメインa*b*図2C)は、TMDSDを介してRNAPからケージを置き換え、RNAPを遺伝子のT7プロモーターに近い位置に置き、したがって転写を開始するように設計することができる。あるいは、DNAテンプレートは、オペレータ配列が「人工転写因子」と呼ばれる補助核酸鎖と相補的であるところも設計された(すなわち、図3AのTFAおよびTFB鎖)。両方のストランドが反応に導入されると、それらはオペレータサイトで組み立てられ、新しい擬似連続ドメインa*b*が作成されます。このドメインは、TMDSD を介してケージを置き換えて、転写を開始することができます (図 3B)。これらのストランドは外因性に供給されるか、または製造することができる。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig03.jpg"> 図3:3成分スイッチアクチベータを用いたポリメラーゼ活性の選択的プログラミング (A) 転写因子(TFA およびTFB)が存在する場合、それらはプロモーターのオペレータドメイン上流に結合し、トーホールド媒介DNA変位を通してケージを変位させることができる疑似一本鎖配列(a*b*)を形成する。(B) この a*b* ドメインは、TMDSDを介してケージを置き換えて転写を開始することができます。この図は、チョウとシー27から変更されています。略語: TF = 転写因子;RNAP = RNA ポリメラーゼ;TMDSD = 足掛け媒介DNA鎖変位。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62073/62073fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
インビトロ転写制御に核酸ベースの転写因子を使用することで、デジタルロジック、フィードバック、信号カスケードなどの高度な回路挙動をスケーラブルに実装できます。例えば、上流の遺伝子からの転写産物が下流遺伝子を活性化するような核酸配列を設計することによって、ロジックゲートカスケードを構築することができます。この提案された技術によって可能なカスケードと多重化を利用する1つのアプリケーションは、ポータブル診断と分子データ処理のためのより洗練された分子コンピューティング回路の開発です。さらに、分子計算とデノボRNA合成機能の統合により、新たなアプリケーションが可能になります。例えば、分子回路は、ポイント・オブ・ケア・メディカル・アプリケーション用の機能性ペプチドまたはタンパク質をコードする機能性ペプチドまたはタンパク質をコードする、入力および出力治療用RNAまたはmRNAとして、ユーザー定義RNAの1つまたは組み合わせを検出するように設計することができる。

<table><tbody><tr><td>0.5% ポリソルベート 20 (TWEEN 20)</td><td>BioShop</td><td>TWN510.5</td><td></td></tr><tr><td>0.5M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Bio Basic</td><td>SD8135</td><td></td></tr><tr><td>10 mM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7)</td><td>Bio Basic</td><td>PD0435</td><td>錠剤 10 mM 緩衝</td></tr><tr><td>液 10% 過硫酸アンモニウム (APS)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>100% アセトン</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A18P4</td><td></td></tr><tr><td>100% エタノール (EtOH)</td><td>ハウスブランド</td><td>39752-P016-EAN</td><td></td></tr><tr><td>10x in vitro 転写 (IVT) バッファー</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>10x トリス-ホウ酸-EDTA (TBE) バッファー</td><td>バイオベーシック</td><td>A0026</td><td></td></tr><tr><td>1M イソプロピル &beta;- d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>I5502-1G</td><td></td></tr><tr><td>1M 重炭酸ナトリウム緩衝液</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>1M トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) Sigma</td> <td>Aldrich</td><td>648311-1KG</td><td></td></tr><tr><td>1X Tris-EDTA (TE) 緩衝液</td><td>ThermoFisher</td><td>12090015</td><td></td></tr><tr><td>2M イミダゾール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56750-100G</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (BME)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>3M 酢酸ナトリウム</td><td>バイオベーシック</td><td>SRB1611</td><td></td></tr><tr><td>40% アクリルアミド (19:1)</td><td>バイオベーシック</td><td>A00062</td><td></td></tr><tr><td>4x LDS タンパク質サンプルローディングバッファー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>5M 塩化ナトリウム (NaCl)</td> <td>バイオベーシック</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>5mM ジチオスレイトール (DTT)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>6x ゲルローディング色素</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>アガロース B パウダー</td><td>バイオベーシック</td><td>AB0014</td><td></td></tr><tr><td>BG-GLA-NHS</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>S9151S</td><td></td></tr><tr><td>BL21 有能な大腸菌</td><td>Addgene</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>BLUeye 既染色タンパク質ラダー</td><td>FroggaBio</td><td>PM007-0500</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>バイオベーシック</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>クマシーブルー (SimplyBlue SafeStain)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>シアニン色素 (SYBR 金核酸ゲル染色)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>シアニン色素 (SYBR セーフ核酸ゲル染色)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>ドライジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>バイオベーシック</td><td>GB0232</td><td></td></tr>カナ<tr><td>マイシン硫酸バイオ</td><td>ショップ</td><td>KAN201.5</td><td></td></tr><tr><td>リソジェニーブロス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L2542-500ML</td><td></td></tr><tr><td>マラカイトグリーンシュウ酸塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>2437-29-8</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS ランニングバッファー (20x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>LSNP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド (ケージアンチセンス)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TATAGTGAGTCGTATTAATTTG</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド (ケージセンス)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド (マラカイトグリーンアプタマーアンチセンス)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GGATCCATTCGTTACCTGGCTCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTACT</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド (マラカイトグリーンアプタマーセンス)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGGCCAGGT AACGAATGGATCC</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド (転写因子 A)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>AGTACACCAACTACGAGTGAG</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド (転写因子 B)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG</td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド with 3'アミン修飾(テザー)</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/</td></tr><tr><td>Pierce強イオン交換スピンカラム</td><td>Fisher Scientific</td><td>90008</td><td></td></tr><tr><td>SNAP T7 RNAPおよびカナマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミド</td><td>Genscript</td><td>N/A</td><td>custom gene insert</td></tr><tr><td>protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)</td><td>Fisher Scientific</td><td>88226</td><td></td></tr><tr><td>rNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roche mini quick DNA スピンカラム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11814419001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Low Range DNA ladder</td><td>Fisher Scientific</td><td>10597012</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td></td><td>BioShop URE001.1</td><td></td></tr></tbody></table>

プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのdnaテザリングrnaポリメラーゼ

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNAナノテクノロジーは、核酸をプログラム可能な自己集合化をユーザー指定の形状および多様なアプリケーションのためのダイナミクスに可能にします。この研究は、DNAナノテクノロジーの概念を使用して、ファージ由来のT7 RNAポリメラーゼ(RNAP)の酵素活性をプログラムし、スケーラブルな合成遺伝子調節ネットワークを構築できることを実証しています。まず、オリゴヌクレオチドと結合したT7 RNAPは、N末端SNAPタグ付きRNAPの発現と、その後のSNAPタグとベンジルグアニン(BG)修飾オリゴヌクレオチドとの化学的結合を介して設計される。次に、核酸鎖変位を使用して、オンデマンドでポリメラーゼ転写をプログラムします。さらに、補助核酸アセンブリを「人工転写因子」として使用して、DNAプログラムT7 RNAPとDNAテンプレートとの相互作用を調節することができます。このインビトロ転写調節機構は、デジタルロジック、フィードバック、カスケード、多重化などの様々な回路動作を実装できます。この遺伝子調節アーキテクチャの構成性は、設計の抽象化、標準化、およびスケーリングを促進します。これらの機能により、生体センシング、疾患検出、データ保存などのアプリケーションに対するインビトロ遺伝子デバイスの迅速な試作が可能になります。

<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62073/62073fig05.jpg"> 図5:スナップT7 RNAP発現およびインビトロ転写アッセイのSDS-PAGE分析.(A)SNAP T7 RNAPタンパク質精製分析、SNAP T7 RNAP分子量:119.4kDa。FT=カラムからの流れスルーは、W1=不純物を含む洗浄緩衝液の溶出画分、精製物を含むE1-3=溶出画分、およびDE=10倍希釈された全脱塩溶出。4-12%プレキャストビストリスタンパク質ゲル、ステイン:クマシーブルー、ランニングバッファ:MESバッファ、条件:35分間200V(B)の蛍光アプタマーの製造を測定することにより、SNAP T7 RNAPタンパク質に対してインビトロ転写アッセイを行った。転写キネティクスは、470nmの励起波長と512nmの発光波長を用いて...

インビトロ転写反応を調節する新規DNAつながされたT7 RNAポリメラーゼの工学について述べています。タンパク質合成と特性評価のステップについて議論し、概念実証の転写制御を検証し、分子コンピューティング、診断、分子情報処理における応用について議論する。

プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

人工核酸転写因子を用いてポリメラーゼ活性を調節する方法を提案する.この遺伝子調節アーキテクチャは、将来のインビトロ遺伝子デバイスのビルディングブロックとして機能します。この技術は、DNA結合ドメインをT7 RNAポリメラーゼにテザリングすることにより、DNAベースの回路の拡張性と転写回路の機能性を兼ね備えています。表に示すように、1本鎖BGオリゴヌクレオチドを50マイクロリットルの二重蒸留水の最終体積に9回希釈させることから始めます。4マイクロリットルのBGオリゴヌクレオチドと4マイクロリットルのSNAP T7 RNAPを4マイクロリットル混合して、各希釈ごとに1つの反応混合物を調製します。オリゴヌクレオチドを二重蒸留水に置き換え、SNAP T7 RNAPを二重蒸留水に置き換えてDNA制御を行い、RNAP制御を準備します。各サンプルの2マイクロリットルを4マイクロリットルのSNAPバッファーに加え、サンプルあたり2マイクロリットルのタンパク質負荷染料を加えることで、11個の反応を設定します。各サンプルの2マイクロリットルを4~12%のバイトラルプロテインゲルに200ボルトで氷上で35分間加熱し、10分間加熱します。実行の最後に、シェーカー上の3つの水交換でゲルを洗浄し、1回の洗浄で少なくとも10分間洗浄し、続いてシアニン色素で核酸染色を15分間洗浄します。適切なゲルイメージングシステム上のゲルを画像化し、20ミリリットルのクマシーブルーで再びゲルを染色します。1時間後、再びゲルをイメージングする前に少なくとも1時間、二重蒸留水で脱染色する。オリゴヌクレオチドとつながれたSNAP T7精製の場合、まず、50マイクロリットルの1モルトレースを50マイクロリットル混合し、5モル塩化ナトリウムを100マイクロリットル、850マイクロリットルの二重蒸留水で混合して溶出バッファーを調製する。次に、サンプルごとに1つのイオン交換カラムを個々の2つのミリリットル遠心管に入れ、各カラムからすべてのバッファーが溶出するまで遠心分離によって精製バッファーでカラムを洗浄します。各サンプルを精製バッファーで 3 ~ 1 の精製バッファーで希釈し、サンプル比に対して 400 マイクロリットルのサンプルを各カラムに積み込みます。すべてのバッファーが示されているように溶出したら、各サンプルのフローを収集し、ラベルを付けます。洗浄ごとにすべてのバッファーが溶出し、必要に応じてフロースルーを収集してラベリングするまで、洗浄ごとに400マイクロリットルの精製バッファーでカラムを3回洗浄します。最後の洗浄後、50マイクロリットルの溶出バッファーをカラムの中央に加え、50マイクロリットルのバッファーがすべて溶出するまでカラムを3回遠心分離して溶出したタンパク質を回収します。各遠心分離後にエルテを収集し、ゲル分析のために各エルトの少量を残しながら、最後の遠心分離後に単一のチューブにエルトをプールします。260および280ナノメートルで残りのエルテアリコートの吸光度を測定し、使用するまでマイナス20度の貯蔵のための1対1の比率でサンプルにグリセロールを加えます。500マイクロリットル30キロダルトンの中心フィルターユニットを使用して、2倍の貯蔵バッファとの総エルト製品をバッファ交換します。そして、実証したように吸光度を測定する。その後、マイナス20°Cの貯蔵のための1対1の比率で製品にグリセロールを追加します。SDS-PAGEでエルトを評価するには、200ボルトで35分間、または色素フロントがゲルの端まで移動するまで、適切なタンパク質ラダーでサンプルを4〜12%のバイトラで実行します。テザーRNAPのオンデマンド制御活動を実証するには、各テンプレートの2.4マイクロリットルを5マイクロリットルの5マイクロアニーリングバッファと、14.2マイクロリットルの二重蒸留水と混合します。得られた1つのマイクロモル二本鎖DNA CAGEを摂氏75度で2分間インキュベートする。そして、表に示されるのと同様に、プロモーター及びマラカイトグリーンアプタマーDNA鋳型のセンス及び抗センス株をアニールする。インキュベーションの最後に、500ナノモルRNAPの最終濃度に対して1〜5モル比で二本鎖DNA CAGEにつながれたSNAP T7 RNAPを追加します。室温で15分後、氷の上にサンプルを置き、25ミリモルリボヌクレシド三リン酸の1マイクロリットル、1ミリモルマラカイトグリーンの1マイクロリットル、RNAP CAGEの2.5マイクロリットル、混合物2.5マイクロモララー転写因子とB鎖状配列とB.鎖状の10xの転写バッファーの2.5マイクロリットルを混合します。 10マイクロリットルの二重蒸留水に1ミリモルマラカイトグリーンアプタマーテンプレートの3マイクロリットル。15マイクロリットルの二重蒸留水に、2.5マイクロリットルの10xインビトロ転写バッファー、25ミリモルリボヌクレオシド三リン酸ミックスの1マイクロリットル、1ミリモルマラカイトグリーンの1マイクロリットル、RNAP混合物CAGEの2.5マイクロリットル、および1ミリモラルマラーテアパターガーアパタータタラの3マイクロリットルを含む第2の反応を設定する。バッファーのみを含む反応を設定するには、2.5マイクロリットルの10xインビトロ転写バッファー、25ミリモルリボヌクレオシドトリリン酸ミックスの1マイクロリットル、1ミリモルマラカイトグリーンの1マイクロリットル、1ミリモルマラカイトグリーンアプタマーテンプレートの3マイクロリットルを17.5マイクロリットルの二重蒸留水に混ぜます。すべての反応が調製されたら、各反応を384ウェルプレートに移し、610ナノメートルの励起で摂氏37度で2時間、蛍光プレートリーダー上のマラカイトグリーンアプタマー転写を監視し、655ナノメートルの発光を行います。読み取りの最後に、プレートを氷の上に置き、20分間、または染料前部がゲルの端に達するまで、摂氏70度TBEバッファーで変性12%TBE-尿素ポリアクリルゲル内の各ウェルからRNA製品を実行します。次いで、シアニン色素核酸染色を軌道シェーカー上で10分間、実証したようにイメージングする前にゲルを染色する。組換えSNAP T7 RNAPタンパク質の発現と精製が成功したのは、SDS-PAGEを用いて確認できる。SDS-PAGEに続いて、酵素活性は、インビトロ転写反応によって検証することができる。BG機能性オリゴヌクレオチドの結合に成功すると、18%変性TBE-尿素PAGEを介して検証することができます。非修飾オリゴヌクレオチドと比較して、その分子量が増加するのが、オリゴヌクレオチドにBG部分を添加する。この代表的なシアニン色素染色体ゲルで観察されるように、過剰なBGオリゴヌクレオチドからのDNAにつながれたT7 RNAP精製を確認するために、分画を通る最初の流れは、ほとんどが過剰なBGオリゴヌクレオチドを含み、ならびに、カチオン交換樹脂に結合しなかったDNA結合ポリメラーゼのごく一部を含んでいた。プール希釈画分には、オリゴヌクレオチドテザーに結合するシアニン色素によって引き起こされるRNAPオリゴの単一バンドのみが含まれ、アップ濃縮された製品レーンは同じを示すが、より暗いバンドは正常なアップ濃度を示した。同じパターンは、クーマッシーブルー染色によって観察され、非共役RNAP制御で観察された小さなゲル移動性シフトを有する。ここで、リアルタイム運動におけるインビトロ転写の終了時に生成される蛍光シグナルが示されている。この分析では、蛍光シグナルにおける336倍の活性化が観察され、ポリメラーゼ活性の強い制御を実証した。このプロトコルを試す際には、核酸染色の前に、ゲルからSDSを十分に洗い流してください。これは、STSが色素をゲルにトラップし、高いバックグラウンド信号を生じるためです。複数のカスケードを持つ大きな遺伝子回路に我々の方法を適用することは、テザリング転写システムのスケーラビリティと合成可能性を示す。この技術は、現在、ニューラルネットワークスタイルの計算が可能な遺伝子回路の開発に使用されています。

dna-tethered-rna-polymerase-for-programmable-vitro-transcription

Research

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Bioengineering

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プログラム可能なインビトロ転写と分子計算のためのDNAテザリングRNAポリメラーゼ

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