Name: マルチカラムプレートアダプタを用いた経済的で多用途の高スループットタンパク質精製システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶ マルチカラムプレートアダプタを用いた高スループットタンパク質精製法。重力または真空下でミリグラム級のタンパク質を効率的に精製し、機能的プロテオミクス研究の時間とコストを大幅に削減します。

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本論文では、国立衛生研究所の国立総合医学研究所の助成番号P20GM103451とリバプール大学の内部研究助成金の機関開発賞(IDeA)によって報告された研究が報告されました。

<ol><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Automated+Mid-Scale+Parallel+Protein+Purification+System+for+Antibody+Purification+and+Affinity+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography.</a> Protein Expression and Purification. , 128(2016).</li>
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<li>Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Biology+and+Drug+Discovery+for+Protein-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).</li>
<li>Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Structural+Genomics%3A+the+First+Quindecennial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial.</a> Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この方法は、比較的経験の浅いタンパク質生化学者に対して堅牢で使いやすいものですが、留意すべき考慮事項がいくつかあります。
コレクション プレートの過剰充填に関する注意
48ウェルコレクションプレート自体はウェルあたり5mLしか保持しませんが、各96ウェルは2mLしか保持しません。これは、井戸を過剰充填するリスクがあるので、列を通してバッファと実行サンプルを追加するときに注意する必要があります。特に、より大きなサンプルを精製のためにクロマトグラフィーカラムに移す際には注意が必要です。余分な上清がある場合は、部分で分割し、列を埋めるのに十分であり、次の部分を追加する前に実行してサンプルの過剰充填や損失を防ぐ必要があります。上清の各添加後、カラムは、ポンプをオンにする前に、ビーズにタンパク質結合の可能性を高めるために、小さなプラスチックループと混合する必要があります。プレートの向きとウェルの内容を追跡するには、精製を開始する前に、ラベル付きコーナー'A1'が常にプレートの左上隅にあることを確認してく...

精製タンパク質のミリグラム量を達成するためのタンパク質精製技術は、特にNMRなどの生物物理学的方法において、その特性評価と分析に不可欠です。タンパク質精製は、創薬プロセスやタンパク質とタンパク質相互作用の研究など、他の研究分野の中心でもあります。しかし、このような純粋なタンパク質の量を達成することは、これらの技術1、2、3のボトルネックになる可能性があります。タンパク質精製の主な方法は、タンパク質の個々の特性とそのタグに依存する様々な方法を含むクロマトグラフィーです。アフィニティークロマトグラフィーにおいて、タンパク質は、クロマトグラフィー樹脂4上の特定の基質に対する親和性を有するタグとして働く追加のタンパク質またはペプチドモチーフを有する。最も一般的な親和性法は、Hisタグ付きタンパク質を用いた固定化金属親和クロマトグラフィー(IMAC)であるのに対し、別の一般的な方法は、その電荷に基づいてタンパク質を分離するイオン交換クロマトグラフィーである。高純度のため、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換の組み合わせが頻繁に使用され、通常は高スループットのために高価なラボ機器が必要です。
機能性プロテオミクスの進化する時代は、特定の分析のために単数形のタンパク質ではなく、多数のタンパク質を同時に精製して包括的な解析とゲノム全体の研究のために、ハイスループット技術の需要を促進している5。固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)は、高スループットタンパク質精製6、7に最も広く使用されている方法の1つですが、その自動化システムは、より小さな実験室8のために高価で手頃な価格です。現在利用可能な、より手頃な価格のプレートベースの代替品は、真空などのアクセス可能な実験室ベースの機器の使用を採用しています。これらの方法は精製速度の向上に成功しているが、より小さなスケールでしか高スループット精製を達成でき、マイクログラム範囲でタンパク質を生み出すだけである。これらの制限は、プレパックされた96ウェルフィルタープレート(例えば、Cytivaが現在所有しているGEヘルスケアから)を生物物理学的技術の前に使用できないことを意味します。重力クロマトグラフィーは、最もコスト効率の高い精製方法です。ただし、複数の列を設定するのは不便であり、複数のタンパク質ではエラーが発生しやすくなります。
マルチカラムプレートアダプタ(MCPA)が開発され、一度に平行アフィニティークロマトグラフィーカラムを正常かつ便利に実行し、Hisタグ付き酵母SH3ドメイン10を精製することが実証されています。MCPAは費用がかかる器械使用に依存しない費用効率の高い高い効率の精製方法を提供する。その柔軟な設計は、重力または真空マニホールドの下で複数の親和性クロマトグラフィーカラムによって効果的にタンパク質のミリグラムを精製することができます。さらに、樹脂の種類、体積、およびその他のパラメータを個々のカラムごとに調整して、最適化を高速化することができます。この研究は、MCPAによるイオン交換クロマトグラフィーがMCPAによるアフィニティークロマトグラフィーと組み合わせて使用され、Abp1 SH3ドメインの精製を強化できることを示している。さらに、これらの方法を用いて、最大24種類のタンパク質を並列に分離することができます。

<table><tbody><tr><td>2 mL/ ウェルコレクションプレート</td><td>Agilent technologies</td><td>201240-100</td><td></td></tr><tr><td>5 mL/ well コレクションプレート</td><td>Agilent technologies</td><td>201238-100</td><td></td></tr><tr><td>12 mL クロマトグラフィーカラム</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルロングドリッププレート</td><td>Agilent technologies</td><td>200919-100</td><td>0.25 um フィルターが付属しています。</td></tr><tr><td>96ウェルプレートシール/マット</td><td>Agilent technologies</td><td>201158-100</td><td>peirceable</td></tr><tr><td>His60 Ni スーパーフロー樹脂</td><td>タカラバイオ</td><td>635660</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP 陰イオン交換カラム</td><td>GE Healthcare(Cytiva)</td><td>17115301</td><td></td></tr><tr><td>Lvis プレートリーダー</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td>FLUOstar Omegaプレートリーダーに対応</td></tr><tr><td>オス leur plugs</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45503-70</td><td></td></tr><tr><td>PlatePrep 96ウェル真空マニホールドスターターキット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>575650-U</td><td></td></tr><tr><td>リザーバーコレクションプレート</td><td>Agilent technologies</td><td>201244-100</td><td></td></tr><tr><td>The Repeater Plus</td><td>Eppendorf</td><td>2226020</td><td>With 5 mL and 50 mL syringes</td></tr><tr><td>VACUSAFE 真空</td><td>INTEGRA</td><td>158 320</td><td>真空真空は、300mBarから600mBarまでの真空範囲と4Lの廃棄物収集ボトルを備えています</td></tr></tbody></table>

マルチカラムプレートアダプタを用いた経済的で多用途の高スループットタンパク質精製システム

An Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System Using a Multi-Column Plate Adapter

タンパク質の精製は、タンパク質の構造と機能の研究に不可欠であり、通常、生物物理学的手法と組み合わせて使用されます。また、新しい治療薬の開発における重要な要素でもあります。機能性プロテオミクスの進化する時代は、これを容易にするための高スループットタンパク質精製と改良された技術の需要を促進しています。マルチカラムプレートアダプタ(MCPA)は、並列精製のためにマルチウェルプレートを持つ異なる樹脂の複数のクロマトグラフィーカラムをインターフェースできると仮定しました。この方法は、自動化されたシステムの速度に匹敵する、重力または真空の下で使用することができるタンパク質精製の経済的で汎用性の高い方法を提供する。MCPA は、その後の特性評価と分析のための手頃な価格と時間効率の高い方法によってタンパク質のミリグラムの収率を回復するために使用できます。.MCPAはSH3ドメインのハイスループットアフィニティー精製のために使用されている。また、MCPAを介してイオン交換が実証され、タンパク質ポストNi-NTAアフィニティークロマトグラフィーを精製し、このシステムを他の精製タイプにどのように適合させることができるかを示しています。複数の列を使用した設定により、パラメータの個別カスタマイズは同じ精製で行うことができます。

一例として、MCPAはNi-NTAを介して変性条件で14 AbpSH3変異体を精製することに成功した(図2A)。小さな汚染物質~25kDaが見られますが、タンパク質はまだ大部分が純粋です。この汚染物質は、大腸菌11に見られる一般的な共精製タンパク質であるYodAであると考えられている。図2Bは、天然条件下における11種類のSH3ドメインの精製を示す。変性条件で見られる小さな汚染物質は、ネイティブ条件で除去されます。これは、表1に示すように、MCPAがネイティブまたは変性バッファで構成される精製の比較に使用できることを示しています。 
IEX MCPAを介したライセートの精製のための代表的なデータを 図3に示す。これは、AbpSH3が後で425 mMから700 mMの間で溶出するので、汚染物質の大部分から分離できることを示唆...

マルチカラムプレートアダプタにより、クロマトグラフィーカラムを並列アフィニティーまたはイオン交換精製用のマルチウェルコレクションプレートとインターフェースして、経済的に高スループットのタンパク質精製方法を提供します。それは現実的な器械使用によって蛋白質のミリグラム量を得る重力または真空の下で使用することができる。

Protein purification is imperative to the study of protein structure and function and is usually used in combination with biophysical techniques. It is ...

マルチカラムプレートアダプタを使用した経済的で多用途の高スループットタンパク精製システム。こんにちは、タンパク質の構造と機能の研究にはタンパク質精製が不可欠です。そして、それは通常、生物物理学的技術と組み合わせて使用されます。これは、高スループットタンパク質の生産を必要とする機能プロテオミクスの時代に特に重要です。我々は、マルチカラムプレートアダプターであるMCPAが、並列精製のためにマルチウェルプレートと異なる樹脂の複数のクロマトグラフィーカラムをインターフェースすることができると仮定した。このアダプターを使用して、我々は自動化システムの速度で重力または真空のライバルの下で使用することができるタンパク質浄化の経済的で、汎用性の高い方法を開発しました。ここでは、ニッケル親和性クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーに関するこの方法を示す。穿刺されたシールマットを長いドリッププレートに置いてMCPAを組み立て、シーリングマットの穴に所望の列数を挿入します。マニホールドの基部に開いたコレクションプレートを置き、マニホールドの上部で閉じます。チューブを取り付け、上部に柱を持つ組み立てられた MCPA を配置します。ニッケルNTA溶液のピペット1.2ミルを柱に入れます。ピペットしながら、ビーズが完全に混合されたままであることを確認してください。ポンプのスイッチを入れ、20%エタノールをカラムから下のコレクションプレートに流します。液体が通ったらポンプをオフにします。回収板の中身をゴミ箱に入れなさい。すべての列にEDTAバッファーの3つの樹脂ボリュームを追加します。ポンプの電源を入れ、液体を通します。今0.5モル水酸化ナトリウムバッファーの3つの樹脂ボリュームでカラムを洗浄します。100ミリモルニッケル硫酸の4つの樹脂容積、ミリQ水の10樹脂ボリュームでカラムを洗浄します。カラムの動作が遅い場合は、シリンジプランジャーで液体を押し通します。回収プレートの中身をゴミ箱に注ぎます。その後、10ミリモルイミダゾール洗浄バッファーの4つの樹脂ボリュームでカラムを2回洗浄し、コレクションプレートを空にします。複数のサンプルを精製する場合は、開いた回収プレートを48ウェルプレートに交換します。真空をオフにして、ライセートをカラムにロードします。薄いプラスチック製のスターラーを使用して、ビーズとライゼを列内に穏やかに混ぜて結合を最大化します。ポンプの電源を入れ、液体を通します。カラムがブロックされた場合は、新しいフィルターを使用して、ライセート樹脂混合物をカラムに移します。フロースルーを含めるには、コレクションプレートをフリーズします。開いたコレクションプレートに交換し、10ミリモルイミダゾール洗浄バッファーの9樹脂ボリュームでカラムを洗浄します。この手順を 4 回または 5 回繰り返します。オーバーフローを避けるために、定期的に廃棄物プレートを空にします。開いたコレクションプレートを96ウェルプレートに置き換え、A1が左上隅に表示されていることを確認します。変性溶出バッファーの樹脂体積を柱にピペットする。液体を通して、井戸間に汚染がないことを確認するために回収板を点検しなさい。次の希釈のために、前のステップを繰り返し、新鮮なコレクションプレートに集めます。純度および濃度分析のために各溶出の50マイクロリットルのアリコートを取る。次に、20%エタノールの2ミリリットルでカラムを洗浄します。20%エタノールの別の2ミルを列に加え、新鮮な薄いプラスチックスターラーを使用してエタノール中のビーズを混ぜ合わせ、摂氏4度で貯蔵するために50milチューブに移します。すべての柱にオープンコレクションプレートと注射器プランジャーを使用して、MCPAを真空マニホールドで組み立てます。前列からすべての注射器のプランジャーを取り外します。5ミルシリンジプランジャーからゴム製ガスケットを取り出し、中央に穴を開けます。次に、開いた柱の底部を穿刺されたゴム製ガスケットを通して押します。これらの手順を繰り返し、列の最前列に挿入します。Qセファロースビーズが完全に混合されていることを確認します。そして、下から2センチメートルカットされた青いピペットチップで、Qセファローズビーズの800マイクロリットルを開いた柱にピペットします。ビーズがカラムの底に落ち着いたら、20%エタノールを通して実行するのに十分な真空ポンプをオンにします。10ミリモルトリスの2ミルで列を2回洗います。トリスバッファーが通る直前にポンプをオフにして、樹脂が乾燥するのを防ぎます。流出は廃棄され、48ウェルのコレクションプレートに置き換えることができます。精製するすべてのサンプルを最初の行のQセファローズ列に移し、薄いプラスチックスターラーを使用してサンプルとビーズを約2分間混合してから真空ポンプをオンにします。後で分析するためにフロースルーを保存またはフリーズします。オープンコレクションプレートで、10ミリモルトリスの2ミルでカラムを2回洗います。開いたコレクションプレートを96ウェルプレートに交換します。最初の溶出分数は、最初の行または2番目の行に集めることができます。2列目に溶け出すために、これらの位置から注射器のプランジャーを取り外します。Q セファローズ列をこれらの位置に移動し、最初の行の開いた列にシリンジ のプランジャーを配置します。第1塩濃度の1ミリリットルをQセファローズ列にピペットする。ポンプの電源を入れ、溶出を収集します。次の溶出を収集するには、次の位置から注射器のプランジャーを取り外し、Qセファローズ列をこれらの位置に移動し、前の位置のプランジャーを交換します。溶出に使用される連続した塩濃度ごとにこれらのステップを繰り返します。4 つの溶出ごとに新しいコレクション プレートが使用され、すべてのプレートにラベルが付いて保存されていることを確認します。オープンコレクションプレートで、4つのモル塩化ナトリウム、10ミリモルトリスの2ミルで柱を洗います。20%エタノールの2ミルをピレットし、ビーズのすぐ上になるまでこれを実行し、保管のために列を密封します。一例として、MCPAはニッケルNTAによる変性条件下での14個のAbpSH3変異体の精製に成功した。タンパク質はまだ大部分が純粋であるが、小さな汚染物質は25キロダルトンで見ることができます。変性条件で見られる小さな汚染物質は、ネイティブ条件で除去されます。これは、11種類のSH3ドメインを精製した際に示した。これは、MCPAが精製条件の比較に使用できることを示しています。AbpSH3は、イオン交換精製を介して、大部分の汚染物質から、分解物から分離することができる。かなり純粋なAbpSH3タンパク質の良好な収率は、種々のより高い分子量の汚染物質で回収された。MCPAとのイオン交換を用いたニッケル-NTA後の試料の精製は、これらの高重量汚染物質を正常に除去しました。まだわずかな汚染がありますが、分画はまだ大部分が純粋であり、NMRと熱化学的変性アッセイを使用して良好な生物物理学データを生み出しています。結論として、我々の仮説は正しく、MCPAは異なるクロマトグラフィー技術を用いてミリグラム量のタンパク質を正常に精製できることを示している。MCPA システムは、同じ実行内で複数の方法で構成して、精製条件を最適化することができます。セットアップは、特に日常的にタンパク質を精製しないラボでは、シンプルで安価で、経験の浅いユーザーを訓練するのは簡単です。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このプロトコルは、より効率的な並列明確化し、プラスミドDNA精製のための費用対効果の高い代替手段です...

原核生物培養液からプラスミドDNAの合理化精製

タンパク質精製のプロセスで使用される適切な疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）メディアを識別するための自​​動化された方法が示されています。メソッドは、自動化されたバッファ·ブレンディング、動的なサンプルループ注入、順次列の選択、マルチ波長分析、分割割合溶出コレクションなどの中圧液体クロマトグラフィーシステムを利用しています。...

タンパク質の精製で使用するための自​​動化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの選択

小説や高効率二段アフィニティークロマトグラフィーのプロトコルが開発され、詳細に説明されている。方法は2つの固有の親和性を持つ小型の精製タグに基づいており、異なるプロパティを持つ標的タンパク質の広い範囲に適用可能です。...

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

我々は、液体処理ロボットを用いた組換えタンパク質のアフィニティータグ精製する方法を説明します。この方法は、一般にハイスループットフォーマットで可溶性Hisタグ融合タンパク質の小スケールの精製にも適用可能である。...

アフィニティータグ組換えタンパク質のハイスループット精製

出典: Becker, B., 他リシン毒素A連鎖(RTA)輸送に必要な細胞成分を特定するための簡易蛍光基レポーターアッセイ。 J. Vis. Exp.

 組換え細菌タンパク質の精製のための親和性クロマトグラフィー技術

このビデオでは、クロストリジウム・ディフィシル菌からヒスチジンタグ付きピロホスホキナーゼ酵素を精製するニッケル親和性クロマトグラフィー技術を実演します。...

ニッケルアフィニティークロマトグラフィーベースのタンパク質精製:細菌細胞溶解物からポリヒスチジンタグ付き組換えタンパク質を精製する技術

このビデオでは、抗体産生細胞培養から得られた培養上清からモノクローナル抗体を精製する技術を示しています。このプロセスでは、アガロースビーズと結合したプロテインAを架橋したマトリックスを使用し、上清中の抗体をビーズに固定化することで、汚染物質から効果的に分離することができます。低pHの溶出バッファーを適用することで、タンパク質A-抗体の相互作用が緩和され、抗体含有画分の収集が容易になります。...

モノクローナル抗体の精製のためのアフィニティークロマトグラフィー技術

このビデオでは、アフィニティー液体クロマトグラフィーを使用して、ヒスチジンタグ付き自己組織化タンパク質ナノ粒子またはSAPNを精製する様子を紹介しています。得られた精製されたSAPNフラクションは、ワクチン開発に適しており、潜在的な免疫療法への応用が期待されています。...

アフィニティークロマトグラフィーを用いた自己組織化タンパク質ナノ粒子の精製

このプロトコルは、哺乳動物発現系における治療抗体の産生を記載しています。記載されている方法は、ベクターDNAの調製、安定なトランスフェクションおよびアフィニティークロマトグラフィーを用いた大規模な文化や精製の設定ヒト胚性腎臓293細胞株の無血清適応を含みます。...

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

この記事では、6X-ヒスチジンタグで標識されたヒト組換えタンパク質であるフラップエンドヌクレアーゼ1(FEN1)のアフィニティー精製の手順について説明します。このプロトコルでは、タグ付きタンパク質の精製に2つの異なる固定化金属イオンカラムを使用します。...

Fast Protein Liquid Chromatographyシステムを用いた6X-Hisタグ付きタンパク質のアフィニティー精製(英語) 

このプロトコルは、プラスミドDNA抽出を加速するための費用対効果の高い方法を説明しています。標準的なスイングバケットプレートローターに対応したカスタム3Dプリントラックを使用することで、研究者は最大48本のキャップ付きスピンカラム、または最大116本のスピンカラムを同時に処理でき、手動のマイクロ遠心分離機法と比べて取り扱い時間を大幅に短縮できます。...

24ウェルラックを用いた中スループットカラムDNA抽出

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