Name: 造影剤増強超音波イメージングおよびマイクロバブル媒介薬物送達研究のためのin vivoモデルとしてのニワトリEx Ovo胚および絨毛尿膜血管の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶ 造影剤増強超音波イメージングとマイクロバブル媒介薬物送達のためのニワトリEx Ovo胚および絨毛尿膜血管の調製法。5〜8日齢胚を用いたin vivoモデルで血流イメージングや新規超音波造影剤の研究に応用可能です。

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この作業は、NWOの一部である応用工学科学(TTW)(Vidiプロジェクト17543)によってサポートされました。著者らは、オランダのエラスムスMC大学医療センターロッテルダムの技術支援について、生物医学工学科のRobert Beurskens、Luxi Wei、Reza Pakdaman Zangabad、実験医療機器学科のMichiel Manten、Geert Springelingに感謝の意を表します。

著者は開示するものは何もありません。

このプロトコルでは、造影剤増強超音波イメージングとマイクロバブルを介した薬物送達を研究するための in vivoモデルとして、5〜8日齢のニワトリ胚とそのCAMを取得して使用する方法に関する3つの方法について説明しています。5日齢(セクション1.2)および6〜7日齢(セクション1.3)の胚を殻から取り出すための最も重要なステップは次のとおりです:1)卵白を引き出す前に、卵の上部に小さな穴を開けて卵殻全体を気嚢に入れます。2)シェルの大きな開口部に滑らかなエッジを作成します。8日齢の胚を殻から取り出す方法(セクション1.4)にとって最も重要なステップは次のとおりです:1)卵に沿って素敵な亀裂を作るのに十分な数のくぼみを作ります。2)卵をPBSに沈めたままにします。すべての方法で胚の生存率を確保するためには、卵とその内容物を37°Cに保つことが重要です。 また、CAM動脈への注入は避けてください。胚の活力を確保するために、研究中に胚の心拍数を視覚的に監視することをお勧めします。胚の正確な発生段階を確認するには、Hamburger & Hamilton22の表示を使用することができます。
胚、CAM、および卵黄袋への損傷を防ぐことが重要です。この損傷は、胚とCAMの生存率、血流、および視認性に影響を与える可能性があります。さらに、卵黄袋の損傷、ひいては膜の剛性が低いため、CAM容器への注入が不可能になります。5日齢の胚は気嚢が比較的小さいため、卵の内容物を取り除くことができる十分に大きな穴を殻に開けるには、2mLの卵白を引き出す必要があります。その結果、卵殻と胚の間により多くのスペースが作成されます。卵白を引き抜いた後、針が入った穴をテープで塞ぐ必要があります。それでも卵白が漏れる場合は、別のテープを貼ってください。これに加えて、側面の穴にテープを貼ると、卵の内部に真空が発生し、ステップ1.2.2.8で大きな穴が開いたときに卵の内容物が自重で脱落するのを防ぎます。胚またはCAMの損傷は、卵殻の端が鋭すぎる場合、または卵の内容物を計量ボートに厳密に落としすぎた場合にも発生する可能性があるため、卵殻を計量ボートのすぐ近くに保つ必要があります。開発の5日目と6日目の間に、CAMは卵殻膜32に付着し始める。この付着は、卵殻から卵の内容物を取り出すときに胚とCAMを損傷するリスクを高めます。6〜7日間の孵化卵のために、または8日間の孵化卵について説明したようにPBS充填容器にPBSを注入した後に卵を開くことにより、損傷のリスクが低減される。CAM静脈への注射について:最初の注射が失敗した場合、損傷が軽微な場合、または別のCAM静脈にある場合は、同じ静脈のさらに上流で2回目の注射を行うことができます。卵黄から胚とCAMを分離すると、胚とCAMの血管が光学的に透明になります。結果として、胚はその主要な栄養源を失います33。この栄養素の損失は、まだ卵黄30と接触している6日齢の胚の~190と比較して、観察された心拍数が80bpmと低く、この分離手順後の生存時間が2時間短縮されたことの説明である可能性があります。心拍数と生存時間の低下に影響を与える可能性のある別の要因は、卵黄分離された胚とCAM血管を37°Cに保つという課題です。 顕微鏡ステージインキュベーターは助けになるかもしれません。これに加えて、卵黄からのCAMの剥離は、膜張力が低くなるため、組織の機械的変化につながる可能性があります。膜張力が低いと、内血管のせん断速度が上昇し、心拍数が低下する可能性があります。
ex ovo ニワトリ胚およびCAM血管には、コントラスト増強超音波イメージングおよびマイクロバブル媒介薬物送達研究のための短時間観察のみを含む、in vivoモデルとしていくつかの制限があります。5日目に100±23μL、6日目に171±23μLと血液量が少ないため34、最大容量~5μLを注入することができます。発達の後期(7日目以上)では、血管の剛性が増し、卵黄の弾力性が低下します。これは、古い胚への注射の成功を複雑にする可能性があります。マイクロバブルが注入されると、ニワトリ胚はこの段階では完全に発達した免疫システムを持っていないため、何時間も循環します35。したがって、マイクロバブルはヒトのように~6分以内にクリアされません36,37、非結合標的マイクロバブルがクリアされるまで5〜10分の待機期間を持つ典型的な超音波分子イメージング研究を行う38は実行不可能である。マイクロバブルを標的とするためには、鳥類内皮細胞に結合することができる適切なリガンドを、血管新生マーカー αvβ37について前述したようなものを使用する必要がある。このモデルで考慮すべき他の側面は、古い胚(>8日)で卵黄から胚とCAM血管を分離することの難しさの増加と、ヒトと比較して~20%39のヘマトクリット値が低いことです。後者は、マイクロバブル振動がより粘性のある環境40で減衰することが知られているため、マイクロバブル振動に影響を与え得る。CAM動脈はCAM静脈41,42よりも酸素化が少ない。この違いは、例えば血液酸素化の光音響イメージングを研究するときに考慮に入れるべきである。
ここで説明する方法は、超音波画像化または薬物送達研究の日、典型的にはインキュベーションの5〜8日目に卵殻から卵の内容物を取り出すことを可能にする。これは、3日間のインキュベーション後に卵の内容物を殻から取り出し、exovo培養としてさらに発展させる既存の方法とは異なります18,20,21。利点は、卵殻から取り出し、さらにexovo 1,18培養中の抗生物質の回避と比較して、5日齢で90%、6日間で75%、7日間で50%、7日間で50%、8日齢で60%の生存率が高いことです。 Ex OVO培養用の20および大型滅菌インキュベーター。6〜8日齢の胚の生存率は、CAMが殻21に付着し始め、抽出時にCAM膜が破裂しやすくなるため、低くなります。卵黄のCAM形態による胚の分離は、胚とCAMを光学的に透明にすることも記載されている。
卵の内容物を異なるセットアップに配置することにより、ニワトリ胚とCAMは、IVUS、光音響、2Dおよび3Dの超音波造影剤の有無にかかわらず、多数の超音波画像検査に使用できます。焦点は、新しい超音波パルススキームの開発または新しいトランスデューサのテストにあります。これに加えて、このモデルは、新しい超音波造影剤と、流れている血管内でのそれらの挙動を調査するためにも使用できます。マイクロバブルを介した薬物送達のメカニズムはまだ不明であるため43、in vivo CAMモデルの使用は、細胞応答に関連するマイクロバブルの挙動を研究することにより、メカニズムの解明に役立つ可能性があります。最後に、CAM血管は、異種移植腫瘍移植を調査するのに適したシステムであることが証明されています44。これにより、CAM血管をモデルとして使用して、超音波を使用した腫瘍イメージングを調査したり、CEUSを使用して腫瘍内の血流を調べたりする可能性が生まれます。腫瘍は通常、8日齢または9日齢の胚1,14,45のCAM血管に移植され、そのために胚は孵卵の3日目に卵殻から取り出され、さらにexovoが発達します。このプロトコルに記載されている方法は、腫瘍移植の日まで卵子で胚を成長させるために使用できます。
著者らは、この論文が、造影剤やフロー研究の応用のための in vivoモデルとして、ニワトリ胚とその絨毛尿膜(CAM)を使用したい研究者に役立つと信じています。

Ex ovo ニワトリ胚と血管に富む絨毛尿膜(CAM)は、胚発生、腫瘍学、薬物送達などのさまざまな生物学的および生物医学的プロセスを調査するのに適したモデルであることが証明されています1,2,3,4。超音波は、胚性心臓発達の画像化4,5、および血管薬物送達のためのマイクロバブルなどの注射時のキャビテーション核の活性化に使用されています6,7。ニワトリ胚は、他の動物モデルと比較して安価で、必要なインフラストラクチャと機器が少なく、法律の厳格さも低くなっています8。鶏の胚とCAMの血管は卵を開けた後は簡単にアクセスできますが、これは哺乳類の胚と血管でははるかに困難であることが証明されています。これに加えて、ニワトリ胚とCAM血管は心拍と脈動血流を提供します。CAMは、血管の解剖学的構造において哺乳類との類似性を示し、薬物スクリーニングに使用することができる8,9,10。これらの特性により、CAM血管は、造影剤増強超音波画像診断(CEUS)11,12,13,14,15,16を調査するのに適したモデルであることも証明されています。さらに、このモデルを使用して、超高速カメラを使用した超音波場での超音波造影剤の挙動、および薬物の推進、結合、および血管外漏出に対する音響放射力の影響を光学的に調査することができます7,17,18,19。ニワトリ胚とCAMは長期実験にはあまり適していませんが、短期間のin vivo実験には有益です。
実験中のニワトリ胚およびCAMに対する視認性および制御性を高めるためには、胚およびCAMを含む卵内容物を卵殻18から取り出すことが重要である。超音波造影剤を含む以前のニワトリ胚研究は、5〜6日齢の胚7、11、12、17、19および14〜18日齢の胚13、14、15、16を使用した。卵内容物を殻から取り出すための複数のアプローチが詳細に説明されている18、20、21。しかし、我々の知る限り、以前に発表されたアプローチは、3日間のインキュベーション後に卵殻から卵の内容物を取り出し(すなわち、Hamburger & Hamilton(HH)ステージ19-2022)、そして培養をexovoで継続することに焦点を当てている。この卵外培養アプローチには、卵子増殖と比較して、培養中の死亡リスクの増加(~50%)1,18、抗生物質の使用18,20、および総血管長の減少など、複数の欠点があります23。卵殻内で胚を培養することは最も自然な環境を提供するため、実験当日まで卵殻内で胚をインキュベートするのが最も簡単です。このため、孵卵の5〜8日で卵の内容物を卵殻から取り出すアプローチは、特に5〜8日齢の胚での実験に有益です。
このプロトコルでは、胚が発生の5〜8日目(HH 26-3522)にあるときに卵殻から卵の含有量を取り出す3つの方法を説明し、実験の日まで卵殻内で胚を発達させます。CAM血管のサイズは、8日齢の胚24の小さい毛細血管の直径10〜15μmから、6日齢および8日齢の胚24,25の大きな血管の直径115〜136μmの範囲です。説明されている3つの方法は、基本的なラボツールのみを必要とし、実験を開始する前に合併症のリスクを低減し、それによって不要なコストと労力を削減します。また、胚とCAMを含む膜を卵黄袋から分離し、顕微鏡研究のためにCAMを光学的に透明にする方法についても詳しく説明します。胚とCAMを含む膜は、例えば音響膜を備えたホルダーに固定することができるので、セットアップは音響的に透明にすることもでき26、光路が卵黄の影響を受けるときに顕微鏡検査と超音波研究の組み合わせを可能にする。最後に、超音波またはCEUSイメージングに使用できる他のいくつかの超音波セットアップについて説明します。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>クランプ(コッヘルクランプ)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>音響膜付きリングフィルム</td><td></td><td></td>ホルダー(CLINIcell 25 cm2)MABIO、Tourcoing、フランス CLINIcell25-50-T FER 00106 <td></td></tr><tr><td>デミ水</td><td></td><td></td><td></td></tr>使い捨て<tr><td></td>プラスチックパスツールピペットVWR <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>612-1747</td><td></td></tr><tr><td>Eggs</td><td>Drost Pluimveebedrijf Loenen BV, オランダ</td><td>Freshly fertilized</td><td></td></tr><tr><td>Fridge 15 &deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管針</td><td>ドラモンド</td><td>1-000-1000</td><td>内径: 0.0413 インチ</td></tr><tr><td>加熱プレート 37 >C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿インキュベーター 37 &deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>昆虫標本ピン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>エラスムスMCの実験医療機器によってカスタムメイドされた<td>金属製の卵ホルダー</td><td></td><td></td><td>。図1を参照してください:A、B</td></tr><tr>エラスムスMCの実験医療計装によってカスタムメイドの<td>金属計量ボートホルダー</td><td></td><td></td><td>。図1参照 C,D</td></tr><tr><td>マイクロインジェクションシステム</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Needle, 19 G</td><td>VWR (TERUMO)</td><td>613-5392</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-bufferes saline (PBS), 1x</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dhe , 1 L</td><td></td><td></td><td>Glass</td></tr><tr><td>Petri Dhe Diameter 90 mm</td><td>VWR</td><td>391-0559</td><td></td></tr><tr><td>前臨床動物超音波装置 (Vevo 2100)</td><td>富士フイルム VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プローブ (MS250)</td><td>富士フイルム VisualSonics</td><td></td><td>30 MHz 送信および受信周波数 15 MHz</td></tr><tr><td>プローブ (MS550s)</td><td>富士フイルム VisualSonics</td><td></td><td>送信周波数 40 MHz</td></tr><tr><td>メス</td><td>VWR (SWANN-MORTON)</td><td>233-5363</td><td></td></tr><tr><td>はさみ、小さな</td><td>ファインサイエンスツール(FST)</td><td>14558-09</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、5 mlの</td><td>VWR(TERUMO)</td><td>613-0973</td><td></td></tr><tr><td>テーブルスプーン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>テープ(スコッチマジックテープ)</td><td>スコッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ティッシュペーパー</td><td>トルク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット大&nbsp;</td><td>VWR(USBECK Laborger&auml;te)</td><td>232-0107</td><td>図1E</td></tr>ピン<tr><td>セット小型</td><td>DUMONT Medical、スイス</td><td>0103-5/45</td>図<td>1Fを参照してください</td></tr><tr><td>超音波造影剤(カスタムメイドFタイプ)</td><td></td><td></td><td>記載どおりに製造:Daeichin、V.らイメージングのためのマイクロバブル組成物と調製:In VitroおよびIn Vivo評価。超音波に関するIEEEトランザクション。64 (3), 555&ndash;567(2017年)。</td></tr><tr><td>超音波造影剤(マイクロマーカー)</td><td>富士フイルムビジュアルソニックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波造影剤(Definity)</td><td>Lantheus医用画像、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超音波ゲル</td><td>Aquasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waxiフィルム(パラフィルム)</td><td>パラフィルム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>計量ボート(85回、85回、24 mm)</td><td>VWR</td><td>611-0094</td><td></td></tr></tbody></table>

造影剤増強超音波イメージングおよびマイクロバブル媒介薬物送達研究のためのin vivoモデルとしてのニワトリex ovo胚および絨毛尿膜血管の調製

The Preparation of Chicken Ex Ovo Embryos and Chorioallantoic Membrane Vessels as In Vivo Model for Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging and Microbubble-Mediated Drug Delivery Studies

ニワトリ胚と血管に富む絨毛尿膜(CAM)は、生物医学的プロセス、新しい超音波パルススキーム、または造影剤増強超音波イメージングおよびマイクロバブル媒介薬物送達のための新しいトランスデューサーを調査するための貴重な in vivo モデルです。この理由は、CAMの胚と血管ネットワークのアクセシビリティと、モデルの低コストです。胚とCAM血管にアクセスするための重要なステップは、卵殻から卵の内容物を取り出すことです。このプロトコルでは、孵卵の5日目から8日目の間に卵殻から内容物を取り出すための3つの方法が説明されており、したがって、胚は今日まで卵殻内で発達することを可能にする。記載された方法は、単純な道具と機器のみを必要とし、 卵外 培養胚(~50%)と比較して、5日で90%、6日間で75%、7日齢で50%、8日齢で60%の高い生存成功率をもたらします。このプロトコルでは、マイクロバブルなどのキャビテーション核をCAM血管系に注入する方法、光学的に透明な研究のために胚とCAMを含む膜を残りの卵の内容物から分離する方法、およびさまざまな短期超音波実験で鶏胚とCAMを使用する方法についても説明します。 in vivoニワトリ胚およびCAMモデルは、造影剤増強超音波イメージングのための新しいイメージングプロトコル、超音波造影剤、および超音波パルススキームを調査し、超音波を介した薬物送達のメカニズムを解明するために非常に重要です。

このプロトコルでは、造影剤増強超音波イメージングとマイクロバブル媒介薬物送達を研究するためのin vivoモデルとして、5〜8日齢のニワトリ胚とその絨毛尿膜(CAM)を取得して使用する方法に関する3つの方法について説明しています。

造影剤増強超音波イメージングおよびマイクロバブル媒介薬物送達研究のためのin vivoモデルとしてのニワトリEx Ovo胚および絨毛尿膜血管の調製

The chicken embryo and the blood-vessel rich chorioallantoic membrane (CAM) is a valuable in vivo model to investigate biomedical processes, new ...

このプロトコルは、造影剤増強超音波イメージングおよびマイクロバブル媒介薬物送達研究のためのインキュベーションの5日目から8日目までのニワトリ胚の準備と使用について説明しています。 5日目から8日目に卵殻から内容物を取り出す3つの方法は、殻内での発達を可能にし、基本的なラボツールのみを必要とします。このモデルは、血流イメージング、薬物送達、新しい超音波造影剤やトランスデューサーなど、超音波および血管研究のさまざまな側面を調査するのに適しています。5日齢の胚を準備するには、5日間のインキュベート受精卵を、卵をインキュベーター内と同じ向きにして予熱した卵ホルダーに入れ、ピンセット先端の先のとがったバックエンドを使用して、卵の最上部に小さなくぼみを作ります。ピンセットを使用して卵の側面に卵の長さの約2/3の2番目のくぼみを作り、大きなピンセットを使用して卵の上部のくぼんだ領域から卵殻の小片を取り除き、気嚢が殻を深く浸透させずに周囲の空気と接触するように注意します。19ゲージの針を備えた5ミリリットルの注射器を使用して、針を下に向けて2番目のくぼみを通してシェルを貫通し、約2ミリリットルのアルブミンを引き出します。アルブミンを採取したら、テープを使用して穿刺を密封し、アルブミンを計量ボートに分注します。大きなピンセットを使用して、絨毛尿膜の下の殻を取り除いたり、内膜を貫通したりすることなく、胚と絨毛尿膜が完全に見えるまで卵の上部の小さな開口部を拡大します。十分な開口部が作成されたら、ホルダー内で卵を180度回転させて、卵の上部の開口部が下部を向くようにします。1〜2分後、胚は浮き上がり、下から見えなくなります。胚と絨毛尿膜全体が見えなくなり、卵黄だけが見えたら、側面の開口部からテープをはがします。卵の内側は開口部から膨らんでいるはずです。金属製の計量ボートホルダーの計量ボートの近くに卵の底を保持しながら、小さなピンセットの鋭い先端を使用して、開口部の幅全体にわたって膜に水平方向の引っかき傷をそっとすばやく作り、卵の内容物を計量ボートにそっと落とします。心拍がまだ存在しているかどうかを確認して、胚がまだ生きていること、脈絡膜血管が無傷であること、そして血液や卵黄の漏れがないことを確認します。生存可能な胚を摂氏37度に置き、37マイクロリットルのPBS滴を胚と絨毛尿膜に定期的に投与します。6〜7日齢の胚と絨毛尿膜を収穫するには、5日齢の胚で実証されたように卵を準備し、19ゲージの針を備えた新しい5ミリリットルの注射器を使用して、針を下に向けて2番目のくぼみから殻を貫通し、1回の浸透で5〜6ミリリットルのアルブミンを引き出します。アルブミンを採取したら、採取したアルブミンの代わりに、回収量を超える約1ミリリットルの37°CPBSを約1ミリリットル入れた10ミリリットルの注射器の針を下に向けてシェルの側面に挿入します。次に、隙間をテープですばやく再シールし、示されているように卵の処理を終了します。生後8日の受精卵から胚と絨毛尿膜を採取するには、卵を水平に持ち、大きなピンセットの後端を使用し、卵の長さの約半分に小さなくぼみを作ります。卵殻のスペースの周りに約10ミリメートル離して360度のリングパターンに小さなくぼみを作ります。すべてのくぼみが作成されたら、ピンセットの先のとがった端を使用して、2つのくぼみの間の殻を割って、卵を摂氏37度のPBSに5分間完全に沈めます。孵卵の終わりに、卵をPBSの計量ボートの上に移動し、両方の親指を大きな穴に入れて卵をそっと開き、小さなくぼみに沿って割れます。卵殻の周りに亀裂が形成されたら、卵の内容物が殻から分離するまでゆっくりと前後に動かしながら、両側をそっと引き離し、内容物を計量ボートに落とします。卵の内容物が入った計量ボートをPBSからゆっくりと持ち上げ、ウェイボートを少し傾けて余分なPBSを取り除きます。次に、計量ボートを金属製の計量ボートホルダーに入れます。この段階で、胚に鼓動する心臓が見られます。顕微鏡イメージング用の胚および絨毛尿膜サンプルを調製するには、アガロース層を上に向けて、約500ミリリットルの摂氏37度PBSを含む1リットルのペトリ皿の底に、アガロースを含む音響膜を備えたホルダーを置きます。小さなハサミを使用して、絨毛尿膜全体の周囲に6〜7回のカットでビテルス膜にすばやく切り込み、計量ボートを回転させて精度と速度を向上させます。大さじを使用して、胚と絨毛尿膜を含む切り欠き膜をすくい上げ、スプーンをゆっくりと上げて、胚と絨毛尿膜を含む切り欠き膜がまだ卵黄嚢膜の残りの部分に付着しているかどうかを目視検査できるようにします。スプーンを少し傾けて、ティッシュを乾燥させずにできるだけ多くの卵黄を取り除き、切り取った膜を1リットルのペトリ皿のPBSに沈めます。小さなピンセットを使用して、膜の一方の端をつかんで静かに回転させ、まだ付着している卵黄を取り除き、膜を音響膜のあるホルダーの上に移動します。昆虫標本ピンを使用して、膜をホルダーの反対側の角に固定し、絨毛尿膜血管に穴を開けないようにします。両方の角が固定されたら、ホルダーを持ち上げて少し傾けてPBSの大部分を廃棄し、小さなピンセットを使用してメンブレンを伸ばしてホルダー全体に均等に分散させ、メンブレンの残りの部分をホルダーに平らに固定できるようにします。胚が固定されたら、ホルダーを摂氏37度の顕微鏡セットアップに入れ、サンプルの関心領域上に音響的および光学的に透明な膜を配置して、血管の光学的視覚化を可能にします。この代表的な分析では、5、6、7、および8日齢の胚と脈絡膜が実証されたように除去されました。胚または絨毛尿膜への出血または損傷は観察できず、これらの方法を使用して、胚または絨毛尿膜血管に損傷を与えることなく卵内容物を安全に収穫できることを示しています。抽出中に複数の合併症が発生する可能性があるため、プロトコルに注意深く従い、損傷した組織サンプルを廃棄することが重要です。実証されたように、胚には、例えばマイクロバブルなどの超音波造影剤を注入することができる。送達時に、マイクロバブルは注入された血管の内腔内を循環し、末梢血内を数時間循環するのを観察することができる。マイクロバブル注入前は、Bモードによって胚の心臓の内部でコントラストがすでに観察できますが、高周波超音波サブハーモニックイメージングでは観察できません。マイクロバブルの添加は、両方のタイプの画像における胚のコントラストおよび視認性を増加させる。造影剤注入後に高周波3Dサブハーモニック画像を取得して、胚および絨毛尿膜内の血管ネットワークを視覚化することもできます。ニワトリ胚および絨毛尿膜血管は、超音波媒介薬物送達を調査するためにも使用することができる。この手順を試みるときは、胚とCAMを常に摂氏37度に保ち、乾燥させないことが最も重要です。この手順に続いて、ニワトリ胚を水タンクや顕微鏡などのさまざまなセットアップに配置して、コントラスト増強超音波イメージングまたはマイクロバブルを介した薬物送達研究を実行できます。この方法と調製物は、超音波造影剤の研究に適しており、癌やウイルスの研究にも使用できます。

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