Name: 迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学ぶ 鶏絨毛尿膜を用いた転移性調節因子の発見法。遺伝子ライブラリーの導入とハイスループットスクリーニングにより、がん転移を阻害する新規治療標的を迅速に同定できます。

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この研究は、JDLとKSに#702849カナダ癌学会研究所グラントによって支援されました。ルイス博士は、アルバータがん財団が支援する前立腺癌研究のフランクとカーラ・ソジョンキー・チェアを務めています。

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開示するものは何もありません。

ここでは、遺伝または薬剤候補スクリーンなどの重要なアプリケーションに利用できる迅速な蛍光顕微鏡ベースの生体内スクリーニングプロトコルについて説明する。目的の遺伝的ライブラリーを用いて形質転換された癌細胞、または個々の発現構築物にトランスフェクトされた癌細胞は、このひよこCAMモデルを用いて目的の表現型に関して迅速にスクリーニングおよび定量することができる。変換プロトコルまたはトランスフェクションプロトコルはライブラリタイプによって大きく異なるため、この手順には含まれていません。表現型の関連する転移性コロニーは、CAMから切除され、拡張され、DNAが分離され、高スループットシーケンシングが目的の発現構築を同定する。一般に、各遺伝子ライブラリーにはプライマー配列とゲノムDNA精製の推奨方法が装備されています。最高の高スループットシーケンス結果を得るには、ローカル施設ガイドラインを使用することをお勧めします。
スクリーニング前に、ライブラリーおよび細胞株の感染の最適な多重度(M.O.I.)を決定することをお勧めします。理想的には、各細胞(したがって将来の転移性コロニー)は、必ずしも達成可...

転移は、癌患者死亡の主な原因である1、2、3。転移性癌細胞は、転移性カスケードの5つのステップを通して、癌の種類に依存する明確なシグナル伝達経路を利用する:局所浸潤、内空内、循環中の生存、外発性、および遠くの転移部位におけるコロニー拡張。この転移過程の現在の理解は、2つのボトルネックステップがあり、1つは原発性腫瘍からの癌細胞の指向性浸潤であり、第2は遠隔部位転移病変4、5、6の確立であることを示唆している。どちらのステップも、初期浸潤または遠隔転移性病変形成部位において、癌細胞がコラーゲンおよび脈管構造と積極的に相互作用することを要求する。したがって、転移性癌細胞は、細胞に付着し、コラーゲン線維を改造し、血管壁7に沿って方向に侵入することができる必要がある。がん細胞がこれらのステップを完了するのを阻止するために、転移防止治療標的を迅速に同定できるスクリーニングモデルが最も重要である。既存のin vitroスクリーニングモデルは、複雑な生きた組織環境を完全に模倣していません。マウス モデルはコストがかかり、時間がかかります。そのため、複雑な生体組織環境と標的の迅速な同定を提供する生体内スクリーニングプラットフォームが急務です。
過去10年の間に、鶏の胚は、ヒト癌転移8、9、10、11、12の堅牢で費用対効果の高いモデルとして確立された。このチック絨毛膜(CAM)組織は薄く半透明であり、原発性腫瘍および/または転移部位における細胞およびコロニー行動の生体内顕微鏡イメージングに理想的である。複数のヒト癌細胞株からの原発性腫瘍増殖は、CAM組織へのマイクロインジェクション後わずか数日のスパン内で開始および転移することができる。癌細胞は、静脈内、CAM内、またはコラーゲンオンプラントを含むいくつかの方法でCAM組織に投与することができ、この柔軟性は、研究者が癌進行の特定の段階、例えば転移性病変形成、原発性腫瘍または血管新生の侵入に焦点を当てることを可能にする。
ここでは、がん細胞が侵襲的転移性病変を確立する能力を測定するために使用できる定量的スクリーニングプラットフォームについて説明する。発現ライブラリーを用いて導入された癌細胞は、低密度でCAM血管系に静脈内に静脈内注入される。転移性コロニーは4〜5日間形成され、その後、得られたコロニーの浸潤能力と脈管系相互作用が評価される。侵入に失敗した個々のコロニーは、コロニーのコンパクトさと癌細胞血管接触の再注入および定量化によってCAMにおいて切除され、伝播され、その表現型が確認される。単一転移性コロニー変異型を担う発現ライブラリー構築物は、高スループットシーケンシングを介して単離コロニーゲノムDNAから同定される。同じプラットフォームは、遺伝子と観察された表現型との因果関係を検証したり、観察された表現型に関する詳細な機械学的研究を行うためにさらに使用され得る。

<table><tbody><tr><td>1 mLの使い捨てシリンジ</td><td>BD</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>15 mLの円錐形遠心チューブ。</td><td>コーニング</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>18ゲージ×1 1/2&nbsp;BD精密針</td><td>BD</td><td></td><td>BD305196、1.2mm x 40mmを使用し、2.5%トリプシン溶液が好まれれば短い針を使用することが可能です</td></tr>多くの<tr><td></td><td>ソースが利用可能です</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4T1マウス乳がん</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>B16F10マウスメラノーマ細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ遠心分離機。</td><td>多くのソースが利用可能です</td><td></td><td>細胞をスピンダウンするために使用できる任意のTC互換遠心分離機が適しています</td></tr><tr><td>円形カバースリップ、22mm。</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545-101</td><td></td></tr>コ<tr><td>ラゲナーゼ</td><td>シグマ</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td></td><td></td><td>を使用しています 私たちはニコンA1r</td></tr><tr><td>綿棒</td>を使用しています <td>多くのソースが利用可能です</td><td></td><td>使用前に滅菌する必要があります</td></tr><tr><td>使用する細胞株に適した培地</td><td>多くのソースが利用可能です</td><td></td><td>私たちはDMEMでHT1080、HEp3、およびb16細胞株を成長させます、10% FBSメディア</td></tr><tr><td>卵インキュベーター</td><td>多くのソースが利用可能です</td><td></td><td>必要な正確なモデルは、画面の規模によって異なります。利用可能な情報源は、MGF Company Inc.、ジョージア州サバンナ、または&nbsp;Lyon Electric Company Inc.、チュラビスタ、カリフォルニア州</td></tr><tr><td>エッペンドールチューブ、1.5ml</td><td>シグマ</td><td>T4816-250EA</td><td></td></tr><tr><td>受精ホワイトレグホーン卵</td><td>任意のローカル供給者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細かい鉗子</td><td>多くのソースが利用可能です</td><td></td>が、事前に血液計算盤<td>を使用する前に滅菌する必要があります</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>MDH-4N1-50PK</td><td></td></tr><tr><td>HT1080 ヒト線維肉腫細胞株</td><td>ATCC</td><td>CCL-121</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td></td><td></td><td>私たちは、</td></tr><tr><td>フルオレセインまたはローダミンと結合したニコンエレメントレクチンLens Culinary凝集素(LCA)を使用しています。</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>RL-1042、FL-1041</td>希<td>薄ストック(5mg / ml)50-100x顕微鏡の感度によって異なります。</td></tr><tr><td>MDA-MB-468ヒト乳がん</td><td>ATCC</td><td>HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>PBS(1x)</td>のスクリーニングに使用される細胞株の色とは異なる色である必要があります多くの<td>ソースが利用可能です</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック加重皿&nbsp;</td><td>Simport</td><td>CA11006-614</td><td>の寸法は78x78x25mmで、他の多くのソースは小さな</td></tr><tr><td>外科用ハサミが利用可能です&nbsp;</td><td>多くのソースが利用可能です</td><td></td><td>使用前に滅菌する必要があります</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ナトリウムガラス毛細管、外径1.0 mm、内径0.58 mm、長さ10 cm&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-58-10</td><td></td></tr><tr><td>スクエアシャーレ(ウェイトディッシュの蓋として使用)。</td><td>&nbsp;VWR&nbsp;</td><td>CA25378-115&nbsp;</td><td>寸法は100x100x15mmで、他にも多くのソースが利用可能です</td></tr><tr><td>実体蛍光顕微鏡&nbsp;</td><td></td><td></td><td>私たちはツァイスルマーv12</td></tr><tr><td>タイゴンR-3603実験用チューブ</td>を使用しています <td>コールパーマー</td><td>AAC00001</td><td>内径1/32、外径3/32インチ、壁厚1/32インチ</td></tr><tr><td>U-118 MGヒト膠芽腫</td><td>ATCC</td><td>HTB-15</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MGヒト膠芽腫</td><td>ATCC</td><td>HTB-14</td><td></td></tr><tr><td>垂直ピペットプーラー&nbsp;</td><td>多くのソースが利用可能です</td><td></td><td>David Kopf Instruments, Tujunga, CA;モデル720</td></tr></tbody></table>

迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見

Discovery of Metastatic Regulators using a Rapid and Quantitative Intravital Chick Chorioallantoic Membrane Model

最近のがん研究の進歩は、がん転移の非常に複雑な性質を示しています。複数の遺伝子または遺伝子ネットワークは、癌の種類、組織、および個々の患者の特性に依存する癌転移カスケード遺伝子および遺伝子産物を差し見なして調節することに関与していることが分かってきた。これらは、遺伝的治療と個別化された医療アプローチのための潜在的に重要なターゲットを表しています。これらの遺伝的標的の同定には、迅速なスクリーニングプラットフォームの開発が不可欠である。
ひよこ絨毛管内膜(CAM)は、発達中の胚のガス交換を可能にする卵殻の下に位置する高血管化されたコラーゲンリッチ膜である。CAMの位置と血管化により、コラーゲン豊富なマトリックスと血管系との癌細胞相互作用の堅牢なヒト癌細胞異種移植およびリアルタイムイメージングを可能にする生体内ヒト癌転移モデルとして開発しました。 
このモデルを用いて、癌転移の新しいドライバーまたはサプレッサーの同定のために定量的スクリーニングプラットフォームを設計した。我々は、完全なヒトゲノムshRNA遺伝子ライブラリーを有する頭頸部HEp3癌細胞のプールをトランスニューシーにし、その後、低密度で細胞をCAM血管系に注入した。細胞は増殖し、単一腫瘍細胞コロニーを形成した。CAM組織に侵入できなかった個々のコロニーは、コンパクトコロニー表現型として見え、細胞内に存在するトランスデューシングshRNAの同定のために切除された。個々のコロニーの画像は、その侵襲性について評価された。誤検出の割合を減らすには、複数の選択を行いました。目的の遺伝子を発現する個々の、単離された癌細胞クローンまたは新たに設計されたクローンは、原発性腫瘍形成アッセイまたは癌細胞血管系共同選択肢分析を行った。要約すると、我々は、イベントの動的かつ複雑なカスケードの非転移性標的同定およびインビタル分析を可能にする迅速なスクリーニングプラットフォームを提示する。

癌細胞注射は、毛細血管に宿っている細胞の大部分が単一であり、互いに有意な差(〜0.05〜0.1cm)に位置する場合に成功すると考えられるので、5〜6日間の潜伏期間の後にコロニーが重複しない(図3A)。癌細胞の蓄積が毛細血管のほとんどで見ることができるならば、注射は成功しなかった、これを示す胚は廃棄されるべきである(図2E)。かなりの数の注射された癌細胞は、注射の24時間以内に死に、いくつかの胚はすべての癌細胞を拒絶するように見える。がん細胞の生存率は、現地の卵供給業者によって異なります(すなわち、注入される細胞の量は異なる場合があります)、実験を進める前に最適な注射条件(がん細胞濃度対注入期間)を決定することを強くお勧めします。細胞濃度は、0.5 x 10 6~1.0 x 106細胞/mの範囲で推奨します。最適な細胞濃度と注射期間が達成されると、5日目の注射後の導入細胞は、CAM組織に散乱して現れる癌細胞によっ...

これは、抑制剤または癌転移のドライバーをスクリーニングするための効果的な方法です。発現ライブラリーを用いて細胞を導入し、鶏絨毛管内膜血管構造中に注入して転移性コロニーを形成する。浸潤性の減少または増加を有するコロニーは、切除、拡張、再注入して表現型を確認し、最後に、ハイスループットシーケンシングを用いて分析する。

Recent advances in cancer research has illustrated the highly complex nature of cancer metastasis. Multiple genes or genes networks have been found to be ...

当社のプロトコルは、視聴者におけるがんの侵入を阻止する遺伝子または遺伝子の組み合わせを効率的に同定することを可能にします。培養を介してメンテナンスのための高度な動物施設を必要としません。全体として、一般的なライブラリまたは一般的な特別なライブラリは、ビューアで数週間の問題でスクリーニングすることができます。このオーバースクリーニングシステムは、研究者が癌転移を遮断するために使用できる新しい治療遺伝子標的または遺伝子標的の組み合わせを発見するのに役立ちます。IV注射の場合、細胞を1ミリリットル当たり0.5〜100万個の細胞に濃縮し、氷冷1X PBSを使用して細胞を希釈または再懸濁する。10個の胚ごとに約1ミリリットルの細胞懸濁液が必要になると予想されます。注射装置を組み立てるには、注射器に針を取り付け、長さ3~5センチのチューブで注射針を伸ばします。細かい鉗子を使用して、ホウケイ酸針の先端を破ります。50~200マイクロリットルの癌細胞懸濁液を注射器に積み込みます。そして、ホウケイ酸塩の針をチューブに挿入します。針に細胞の詰まりや気泡がないか調べます。毛細血管内で細胞の詰まりが観察された場合は、毛細血管を取り除き、細胞を再中断して新しい毛細血管に置き換えます。任意の気泡を押し出すためにプランジャーを使用してください。カバー蓋を外し、ステレオスコープの下で胚を移します。CAM表面に注入される適切な静脈を特定し、通常はホウケイ酸針先端の直径よりもわずかに広く、胚と計量皿壁の中間に位置する。一般的に静脈分岐に隣接する点で注入する方が簡単です。針の先端を血管壁に押し付け、血流と同じ方向に穏やかな圧力をかける。必要に応じて、綿棒を使用して、注入される容器を固定または安定させます。必要なボリュームが注入されるまで、シリンジプランジャーを2~10秒間静かに押し下げます。注射部位に過剰な出血や透明な液体の蓄積が現れた場合は、胚を捨てる。CAMから針を取り出し、綿棒で注射部位をそっと手を出して血液細胞または過剰な癌細胞を除去します。注入した胚を計量皿に蓋をして蓋をし、インキュベーターに戻します。すべての胚が注入されるまで手順を繰り返します。細菌やカビの汚染や死の胚を視覚的に検査します。そして、実験室の処分手順に従って汚染された胚を捨てる。転移性コロニーは、注射後の最初の1〜3日間の間に均一に見えるようにしてください。そして、4日目から5日目の注射後に侵襲的または非侵襲的な転移性コロニーを同定する。5日目の注射後、インキュベーターから胚を取り除き、転移性コロニー分布のために胚のカラムを検査し、見つける。解剖顕微鏡の下で、目的の転移性コロニーを含むCAM組織を細かい鉗子を使用して上方に優しく引っ張り、外科用ハサミで切断する。CAM組織を空の無菌1.5ミリリットルチューブに移し、チュ

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Cancer Research

がん研究

ニワトリ漿尿膜（CAM）は、血管新生と腫瘍形成を研究するユニークな、自然に免疫不全支える文化環境です。このビデオの記事では、ニワトリの異なるステップを示しています...

チック EX卵文化と EX卵 CAMアッセイ：それが実際にどのように動く

定量的PCRを用いて、我々は十分に確立されたニワトリCAMモデルは定量的に遠隔臓器へのヒト腫瘍細胞の転移を分析するために使用できる方法を示します。...

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ニワトリ絨毛尿膜血管系への癌細胞の静脈内注射:癌の浸潤と転移を研究するための絨毛膜膜癌モデルを確立する手順

このビデオでは、殻なし卵培養物を使用して、ニワトリ絨毛尿膜(CAM)からの転移性がん細胞コロニーの分離について説明します。...

ニワトリCAMからの転移性がん細胞コロニーの単離:殻なし卵培養物からがん細胞を単離する手順

ザ<em&gt;卵で</em肉腫のためXenograftmodelとして&gt; CAMアッセイ

ペリニューラル侵来は、頭頸部扁平上皮癌および他の腫瘍に対する積極的な表現型である。ひよこ絨毛膜モデルは、血管新生、癌の侵入、転移の研究に使用されています。ここでは、このモデルを生体内のペリニューラル侵入を評価するためにどのように利用できるかを示します。...

頭頸部癌のペリオラル侵食を評価する生体内モデルにおけるひよこチョリオアラントIC膜

転移性透明細胞腎細胞癌は、徹底的な前臨床調査のための包括的な動物モデルのない疾患である。このプロトコルは、この疾患の2つの新しい動物モデルを示している:異所的に移植されたマウスモデルと鶏絨毛アラント膜モデルは、いずれも臨床症例に似た肺転移を示す。...

マウス腎臓と鶏絨毛性膜に確立された転移性透明細胞腎細胞癌モデルの比較

我々は、婦人科および泌尿器科癌細胞株および患者由来腫瘍の生着のための代替、移植可能なインビボモデルとして鶏絨毛アラント膜モデルを提示する。...

生体内における鶏絨毛性膜モデルを用いて婦人科癌と泌尿器科癌を研究する

癌細胞の転移能を評価するためのCAM-Delamアッセイは、比較的速く、簡単で、安価である。この方法は、転移形成を調節する分子機構を解明し、薬物スクリーニングに使用することができる。ヒト腫瘍サンプルを分析するための最適化されたアッセイは、パーソナライズされたがん治療のための臨床方法となり得る。...

がん細胞の層間剥離および浸潤能を定量化することによって転移特性をスコアリングするCAM-Delamアッセイ

ここでは、ヒト卵巣組織のニワトリ絨毛膜(CAM)異種移植モデルを開発するためのプロトコルについて説明し、技術の有効性、移植片血行再建術の時間枠、および6日間の移植期間にわたる組織の生存率を示します。...

卵巣組織移植を研究するためのツールとしてのひよこ絨毛膜(CAM)モデル

学ぶ 鶏絨毛尿膜を用いた転移性調節因子の発見法。遺伝子ライブラリーの導入とハイスループットスクリーニングにより、がん転移を阻害する新規治療標的を迅速に同定できます。

迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見

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