迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見
2021年2月3日
これは、抑制剤または癌転移のドライバーをスクリーニングするための効果的な方法です。発現ライブラリーを用いて細胞を導入し、鶏絨毛管内膜血管構造中に注入して転移性コロニーを形成する。浸潤性の減少または増加を有するコロニーは、切除、拡張、再注入して表現型を確認し、最後に、ハイスループットシーケンシングを用いて分析する。
当社のプロトコルは、視聴者におけるがんの侵入を阻止する遺伝子または遺伝子の組み合わせを効率的に同定することを可能にします。培養を介してメンテナンスのための高度な動物施設を必要としません。全体として、一般的なライブラリまたは一般的な特別なライブラリは、ビューアで数週間の問題でスクリーニングすることができます。
このオーバースクリーニングシステムは、研究者が癌転移を遮断するために使用できる新しい治療遺伝子標的または遺伝子標的の組み合わせを発見するのに役立ちます。IV注射の場合、細胞を1ミリリットル当たり0.5〜100万個の細胞に濃縮し、氷冷1X PBSを使用して細胞を希釈または再懸濁する。10個の胚ごとに約1ミリリットルの細胞懸濁液が必要になると予想されます。
注射装置を組み立てるには、注射器に針を取り付け、長さ3~5センチのチューブで注射針を伸ばします。細かい鉗子を使用して、ホウケイ酸針の先端を破ります。50~200マイクロリットルの癌細胞懸濁液を注射器に積み込みます。
そして、ホウケイ酸塩の針をチューブに挿入します。針に細胞の詰まりや気泡がないか調べます。毛細血管内で細胞の詰まりが観察された場合は、毛細血管を取り除き、細胞を再中断して新しい毛細血管に置き換えます。
任意の気泡を押し出すためにプランジャーを使用してください。カバー蓋を外し、ステレオスコープの下で胚を移します。CAM表面に注入される適切な静脈を特定し、通常はホウケイ酸針先端の直径よりもわずかに広く、胚と計量皿壁の中間に位置する。
一般的に静脈分岐に隣接する点で注入する方が簡単です。針の先端を血管壁に押し付け、血流と同じ方向に穏やかな圧力をかける。必要に応じて、綿棒を使用して、注入される容器を固定または安定させます。
必要なボリュームが注入されるまで、シリンジプランジャーを2~10秒間静かに押し下げます。注射部位に過剰な出血や透明な液体の蓄積が現れた場合は、胚を捨てる。CAMから針を取り出し、綿棒で注射部位をそっと手を出して血液細胞または過剰な癌細胞を除去します。
注入した胚を計量皿に蓋をして蓋をし、インキュベーターに戻します。すべての胚が注入されるまで手順を繰り返します。細菌やカビの汚染や死の胚を視覚的に検査します。
そして、実験室の処分手順に従って汚染された胚を捨てる。転移性コロニーは、注射後の最初の1〜3日間の間に均一に見えるようにしてください。そして、4日目から5日目の注射後に侵襲的または非侵襲的な転移性コロニーを同定する。
5日目の注射後、インキュベーターから胚を取り除き、転移性コロニー分布のために胚のカラムを検査し、見つける。解剖顕微鏡の下で、目的の転移性コロニーを含むCAM組織を細かい鉗子を使用して上方に優しく引っ張り、外科用ハサミで切断する。CAM組織を空の無菌1.5ミリリットルチューブに移し、チューブ蓋を閉めます。
目的のすべてのコロニーが別々のチューブに収集されるまで切除手順を繰り返します。各コロニーに別々の滅菌18ゲージ針を使用して、マイクロ遠心分離管内のCAM組織を穏やかにミンチします。1XコラーゲンA溶液100マイクロリットルを加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。
周囲温度で5分間、細胞とCAM組織を300倍Gでスピンダウンします。コラーゲン-A溶液を吸引し、細胞の不完全な培地を再中断して、対象となる細胞株に対して用いることができる。その後、再び細胞と組織を回転させます。
完全な培地および選択因子の1ミリリットルで細胞および組織片を再中断する。その後、単一の12ウェル組織培養皿によく移します。今後1~3週間、がん細胞の増殖と汚染を毎日監視します。
細胞が70〜80%に達すると、より大きな体積培養皿にそれらを移す。適切ながん細胞数に達するとすぐに、シーケンシングまたは次の選択ラウンドに進みます。注射に失敗したために癌細胞の蓄積を示す胚は、毛細血管の大部分で見ることができる。
最適な細胞濃度と注射期間が達成されると、5日目の注射後トランスデューシング細胞は多種多様なコロニー表現型を産生し、癌細胞によって決定されるコロニーの大部分がCAM組織に散乱して現れる。注意は、コンパクトに見え、彼らは鉗子とはさみとCAM組織の一部で切除することができる近隣のコロニーから十分に離れて位置している転移性コロニーに支払われるべきです。分離された陽性スクリーンヒットは、再注入時にコンパクトコロニー表現型を表示する必要があります。
癌細胞血管接触の測定のために、注意は、血管壁の汚れの明るさに支払われるべきであり、レクチンの適切な量は、血管壁信号のために注入されるべきである。このプロトコルを試みるとき、注射の下または過剰を避け、過度の出血や液体の蓄積を除去します。この技術を用いて、視聴者におけるがん細胞の浸潤を促進しているいくつかの新しい遺伝子が同定されている。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルは、がん転移を阻害する遺伝子または遺伝子組合せを効率的に特定することを可能にします。鶏の胎盤膜血管系を利用することで、研究者はがん転移の抑制因子や促進因子をスクリーニングできます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- がん生物学
- 遺伝子治療
- 転移研究
背景
- がん転移を理解することは、効果的な治療法を開発するために重要です。
- 従来の方法では高度な動物施設が必要になる場合があります。
- この方法を使用することでスクリーニングを迅速化できます。
- 新しい治療標的の特定はがん治療に不可欠です。
研究の目的
- がん転移をブロックできる遺伝子標的を発見すること。
- 効率的な高スループットスクリーニングシステムを利用すること。
- 特定されたコロニーの表現型を確認すること。
使用された方法
- 発現ライブラリーを用いた細胞の導入。
- 鶏の胎盤膜への細胞の注入。
- 転移コロニーの切除と拡張。
- 解析のためのハイスループットシーケンシング。
主な結果
- 侵襲性に変化したコロニーの特定。
- 再注入による表現型の確認。
- 新しい治療遺伝子標的の発見の可能性。
結論
- この方法はがん転移阻害剤をスクリーニングするための迅速なアプローチを提供します。
- 新しい治療戦略の特定につながる可能性があります。
- 鶏のモデルを利用することで、複雑な動物施設の必要性が減少します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The chick chorioallantoic membrane (CAM) model enables rapid, quantitative screening for metastasis regulators in a living, vascularized system without requiring advanced animal facilities. This approach supports early target validation by identifying genes that modulate cancer cell invasion and vascular interactions, providing mechanistic de-risking for therapeutic hypothesis testing. The platform accelerates discovery of anti-metastatic targets, informing portfolio prioritization in oncology drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying genes that suppress or promote cancer cell invasion in a dynamic microenvironment.
- Operational Value: Enables functional validation of targets through colony excision, phenotypic confirmation, and reinjection assays.
- Predictive Value: Supports preclinical de-risking by linking genetic hits to metastatic behavior in a collagen-rich, vascularized tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, image-based readouts of colony invasiveness to distinguish metastatic from non-metastatic phenotypes.
- Operational Value: Standardizes xenografting and selection procedures across embryos, reducing variability in screening outcomes.
- Scalability: Compatible with shRNA library screening, allowing genome-scale interrogation of metastasis regulators in weeks.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase target identification to downstream validation via primary tumor formation and vasculature co-option assays.
- Mechanistic Insight: Enables analysis of cancer cell–blood vessel interactions, informing anti-angiogenic or vascular co-option strategies.
- Predictive Confidence: Multiple selection rounds reduce false positives, increasing confidence in target validity before lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The CAM model fits within the early discovery continuum, supporting target identification and validation prior to lead optimization and preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening for metastasis regulators using genetic libraries and quantitative phenotyping.
- Screening: Delivers standardized, reproducible colony formation and invasion metrics for compound or genetic modulator evaluation.
- Analytics: Provides image-based quantification of invasiveness and vascular contact, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Supports progression from hit identification to functional validation in orthotopic and co-option assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening metastasis modifiers across cancer types and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in metastasis regulation by linking genes to invasive phenotypes in vivo.
- Operational Value: Eliminates need for murine imaging infrastructure, lowering cost and increasing throughput for target validation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative evidence of anti-metastatic activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of targets with validated roles in invasion and vascular interaction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, microinjection, and stereoscopic microscopy.
- Dependent on sterile tissue culture, collagen-A dissociation, and molecular biology tools for shRNA library work.
- Necessitates standardized imaging protocols for consistent colony phenotyping across operators and sessions.
- Adaptation to other cancer models may require optimization of cell concentration, injection volume, and incubation time.
- Limited to avascularized, early-stage metastatic phenotypes; may not capture late-stage colonization or stromal interactions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:41
Intravenous Injection of Cancer Cells for Metastatic Colony Formation
3:06
Embryo Maintenance During the Metastatic Colony Growth and their Isolation
5:26
Results: Metastatic Colony Isolation for Different Steps of the Screening Protocol
6:34
Conclusion
