Name: ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぼう、ポリソームプロファイリングを用いてマウス脳の発達におけるmRNA翻訳効率を評価する方法を。シクロヘキシミド処理と超遠心分離により、リボソームサブユニットとポリソームを分離し、神経組織での翻訳制御を解析できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、NSERCディスカバリーグラント(RGPIN/04246-2018からG.Y.)によって資金提供されました。G.Y.はカナダ研究委員長です。S.K.は、ミタックス・グローバリンク大学院フェローシップとACHRI大学院生奨学金によって資金提供されました。

すべての動物の使用はカルガリー大学の動物ケア委員会によって監督されました。実験に用いたCD1マウスは、市販業者から購入した。
1. ソリューションの準備
注: RNA の劣化を防ぐために、RNase 除染ソリューションを使用して、ワークベンチとすべての機器をスプレーします。RNaseフリーのヒントは実験に使用されます。すべてのソリューションは、RNaseフリーの水で調製されます。
<ol><li>DMSOでシクロヘキシミドストック液(100mg/mL)を調製し、-20°Cで保管してください。</li>
	<li>RNaseフリー水に75.3 gのスクロースを加え、体積を100 mL(〜16勾配調製用)に上げて2.2Mスクロースストック溶液を準備します。溶液は長期保存のために-20 °Cで保つことができる。</li>
	<li>10x塩溶液(1 M NaCl;200 mMトリス-HCl、pH 7.5;50 mM MgCl2)を準備する)。</li>
	<li>60%(w/v)スクロースチェイス溶液を調製し、30gのスクロース、5 mLの10倍の塩溶液を含み、RNaseフリー水で最大50mLの体積を上回ります。</li>
	<li>必要に応じて、ブロモフェノールブルーの斑点または1%ブロモフェノールブルーの約5μLをRNaseフリーウォーターに加えて、チェイス溶液に加えます。1.6. 4 °Cでソリューションを保管する</li>
</ol>2. スクロース勾配の調製
注: スクロース勾配の準備における精度は、一貫性のある再現性のある結果を得る上で重要です。
<ol><li>6つの10〜50%のショ糖勾配を調製するために、 表1のように2.2Mスクロース溶液を希釈する。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>スクロース溶液</td>
			<td>10%</td>
			<td>20%</td>
			<td>30%</td>
			<td>40%</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.2 M スクロース</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>6 mL</td>
			<td>8 mL</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10倍の塩溶液</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>1.5 mL</td>
			<td>1.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>シクロヘキシミド</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td>11.5 mL</td>
			<td>9.5 mL</td>
			<td>7.5 mL</td>
			<td>5.5 mL</td>
			<td>3.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>総量</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:ショ糖勾配の調製のためのスクロース希釈液。
注:超遠心の間に重量のバランスを取るために、常に2の倍数のショ糖勾配を準備してください。
<ol start="2"><li>RNase除染液で金属鈍い端の針を拭く。RNaseフリーの水を使用して、超遠心チューブ、チューブ、シリンジを簡単にすすいでください。残りの水がスクロース濃度を変えるため、チューブに水滴が残らないようにチューブを空気乾燥させます。</li>
	<li>クランプホルダーに金属針を、電動ステージに遠心分離チューブを置きます。勾配を一貫して調製するために、超遠心チューブを保持する電動ステージとショ糖溶液を注入する注射器ポンプを含む家庭用組み立てシステムを使用しました(図1、詳細はステップ9を参照)。</li>
	<li>30 mL のシリンジに、10% スクロースの 16 mL (6 つの勾配に十分) を充填し、注射器ポンプに置き、針に接続します。注射器、チューブ、および針に気泡がないことを確認します。針の先端を拭き取り、残留液を取り除きます。</li>
	<li>針の先端が下部のチューブの中心に触れるようなモーターステージを上に移動します。</li>
	<li>2.3 mLの体積に対して、2 mL/minの流量でシリンジポンプをセットします。</li>
	<li>10%のスクロース溶液の2.3 mLを分配した後、電動ステージを下に移動し、6つの勾配すべてについてプロセスを繰り返します。</li>
	<li>ステップ2.4~2.7を繰り返して、チューブの底部に20%のスクロース溶液を添加し、続いて30%、40%、50%のスクロース溶液を同様に添加します。</li>
	<li>勾配の調製後、パラフィンフィルムを用いて超遠心チューブを密封する。</li>
	<li>異なるショ糖層が一緒に拡散して連続勾配を与えるような4°Cでチューブを一晩放置します。</li>
</ol>3. 組織解剖
注:妊娠中のマウスは、5%イオブルランで麻酔が先行する子宮頸部脱臼によって安楽死させた。
<ol><li>胚性12日目にCD1マウス胚を収集し、必要に応じて他のタイムポイントを収集し、氷冷ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を含むØ 10 cmプレートに胚を入れ、細胞の生存率を保持します。</li>
	<li>解剖スコープの下で、1つの胚を氷冷HBSSを含むØ 6 cmプレートに移す。</li>
	<li>21-23 G針を使用して、約45°の角度で目を貫通して頭部の位置を固定し、針がプレートに固定されていることを確認するために力を加える(図2A)。</li>
	<li>皮膚と頭蓋骨を中央から側面に取り除くためにNo.5鉗子を使用してください。</li>
	<li>鉗子を使用して嗅球を切断し、髄膜を取り除いて皮質組織を露出させる.3.6.湾曲した鉗子を使用して皮質組織を氷上の神経基底培地の2〜3mLに切断する(図2B)。必要に応じて異なる胚から皮質組織をプールします。8~10個の胚からの組織は、通常、約200μgの総RNAを与える。</li>
</ol>4. 細胞の起水
<ol><li>組織解剖の日に、 表2に記載されているように新鮮な細胞のライシスバッファーを調製する。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>解決</td>
			<td>最終濃度</td>
			<td>容積</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリス-HCl (pH 7.5)</td>
			<td>20mM</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>100mM</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリトンX-100</td>
			<td>1% (v/v)</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>デオキシコール酸ナトリウム</td>
			<td>0.5% (w/v)</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ジチオスレイトール (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>シクロヘキシミド</td>
			<td>100 μg/mL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNaseフリーウォーター</td>
			<td></td>
			<td>トップ最大5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>トータル</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:ポリソームライシス緩衝液の調製。
注:プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤でリシスバッファーを補います。
<ol start="2"><li>100 μg/mLの最終濃度に解剖した組織を用いた神経基底培地にシクロヘキシミドを加え、37°Cで10分間インキュベートする。シクロヘキシミドは、翻訳伸びをブロックし、したがって、リボソームの流出を防ぎます 15.</li>
	<li>4°Cで5分間500xgで遠心分離機を出し、上清を捨てます。 </li>
	<li>氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で100 μg/mLシクロヘキシミドを加え、組織を2回洗浄します。</li>
	<li>4 μLの RNase 阻害剤を添加した細胞のリシスバッファーを 500 μL 加えます。ピペットは、リシスバッファー内の組織を再中断するために上下.インスリン針を使用して、組織を穏やかに取り付けます。</li>
	<li>氷の上の組織を2〜3分ごとに短い渦で10分間インキュベートします。 注:組織の劣化を防ぐために、組織の分解のすべてのステップが氷の上で行われることを確認してください。</li>
	<li>4°Cで5分間2,000 x g で遠心分離機。</li>
	<li>上清を氷上の新しい遠心管に移します。</li>
	<li>遠心分離機は約13,000xgで5°Cで5分間。 </li>
	<li>上清を氷上の新しい遠心管に移します。</li>
	<li>UV-Vis分光光度計を用いて、組織ライセート中のRNA濃度を測定します。 注:複数のサンプルが実験に含まれている場合は、余分な細胞のリシスバッファーで同じ濃度にサンプルを希釈して、変動を最小限に抑えます。</li>
</ol>5. サンプルローディングと超遠心分離
<ol><li>4°Cで超遠心回転子とスイングバケットを予冷し、超遠心分離機の温度を4°Cに設定します。</li>
	<li>20μLの組織ライセートを全RNA入力として保管します。</li>
	<li>スクロース勾配の上部に、リゼートを超遠心管の壁にゆっくりと分配することで、サンプル(50〜300 μgのRNAと等量のRNA)をロードします。</li>
	<li>超遠心チューブをスイングバケットにそっと入れろ。すべての正反対のバケットがバランスを取っていることを確認します。</li>
	<li>回転子にスイング バケットをロードします。超遠心分離機を4°Cで190,000 x g( 約39,000 rpm)に設定し、90分間設定します。</li>
	<li>遠心後に氷の上に勾配をそっと置きます。</li>
</ol>6. 分数とサンプルコレクション
注: ホームアセンブルされた分画、記録、収集システムは、分析と勾配からのサンプルの収集に使用されます (図 3デバイス コンポーネントを参照)。
<ol><li>チューブピアサーに空の超遠心チューブを置き、下から針でチューブをそっと貫通します。</li>
	<li>UVモニタのスイッチを入れ、デジタル信号記録ソフトウェアを開きます。</li>
	<li>30 mL のシリンジに 25 mL の 60% スクロースチェイス溶液を充填します。チェイス溶液が空のチューブを満たすよう注射器を軽く押し、254 nmのUVモニタを通過して検出基準を設定します。</li>
	<li>UV モニタの自動ゼロを押して、検出用のベースラインを登録します。ソフトウェアの再生を押して録音を開始します。</li>
	<li>ベースラインが確立されたら、ソフトウェアの記録を一時停止し、追跡ソリューションを撤回します。システムに残った追跡溶液が残らないようにします。 注:RNaseフリーの水でシステムをリンスし、以前の実行から残った残りのショ糖溶液を除去してください。</li>
	<li>サンプルチューブをチューブピアサーに1本積み込みます。下から針でチューブをそっと貫通します。</li>
	<li>ソフトウェアでの録画を開始します。シリンジポンプ(体積25mLの場合は流量1mL/分)と分数コレクターを起動して、ポリサム分画を収集します。分数設定を 30 秒に設定します。 注:各実行前に、注射器またはチューブに気泡が入らないように、注射器を軽く押して、追跡液が針を通して連続的に流れるようにします。</li>
	<li>分数コレクターを使用して、1.5 mLチューブ(それぞれ500 μL)に分数を収集します。</li>
	<li>分数は、すぐに処理するか、-80°Cで保存することができます。</li>
	<li>分数の収集後、RNaseフリーの水でシステムをすすいで、残ったスクロースを取り除きます。</li>
</ol>7. RNAの抽出
<ol><li>各画分に、10 ngのルシメラーゼmRNAスパイクインコントロールを加える。</li>
	<li>グアニジウムヒドロコライドベースの市販のRNA分離試薬を各画分に3ボリューム加えます。</li>
	<li>15 sの渦を簡単に。</li>
	<li>7.2で使用されている溶液と互換性のあるRNA抽出キットを使用してRNAを抽出します。</li>
</ol>8. 逆転写とリアルタイム PCR
<ol><li>UV-Vis分光光度計を用いてRNAの濃度を測定します。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って、cDNA合成キットを使用して逆転写にRNAを対象とします。</li>
	<li>定量的リアルタイムPCR(qPCR)を使用して、 例としてgapdh mRNAの多ソーム分布を調べます。qPCRはqPCR検出システムとqPCRマスターミックス試薬を用いて行い、次のサイクリング条件で95°C、15sの95°Cの40サイクル、30sの場合は60°C、40sの場合は72°C、60sの場合は95°Cが続いた。</li>
	<li>増幅プロットからしきい値サイクル(Ct)値を取得し、ΔΔCt法を用いて折り畳み変化の計算に使用します。</li>
</ol>9. スクロース勾配作りシステムアセンブリ
メモ:ショ糖勾配メーカーの各コンポーネントを組み立てる手順に従います(図1)。
<ol><li>ベースのブレッドボード(A1)に2つの垂直ブラケット(A2)を取り付けます。</li>
	<li>2 つのスリムな直角ブラケット (B2) を使用して、リニア ステージ アクチュエータをベースブレッドボード (A1) に取り付けます。</li>
	<li>Ø12.7 mm アルミニウム ポスト(C2)のセットスクリューを使用して、チューブホルダーのスタンドとしてチューブホルダーベースブレッドボード(C1)に固定します。</li>
	<li>ポスト(C2)とミニシリーズ光ポスト(C4)で、直角Ø1/2インチをØ6 mmポストクランプ(C3)に組み立てます。</li>
	<li>小さなVクランプ(C5)をチューブホルダーとして接続するには、光ポスト(C4)のセットスクリューを使用します。</li>
	<li>チューブホルダーに遠心管を入れ、角度を調整して垂直にします。チューブの位置をマークし、ベースブレッドボード(C1)に台座ポストホルダー(C6)を取り付け、チューブを支えます。</li>
	<li>ブレッドボード(A1)の反対側で、Ø12.7 mmアルミニウムポスト(D1)のセットスクリューを使用して固定し、直角Ø1/2"を使用してミニシリーズの光学ポスト(D3)をØ6 mmポストクランプ(D2)に接続します。</li>
	<li>ミニチュア V クランプ (D4) を鈍端の針 (D5) でポスト (D3) に接続します。クランプの角度を調整して針を垂直に設定し、針が遠心管に合致するようにポストの長さを調整します。</li>
	<li>アクチュエータ(B1)をステッパーモータードライバ(E1)に接続し、UNO R3コントローラボードとジョイスティックモジュールをUNOスターターキット(E2)から使用してアクチュエータを制御します。電源アダプタ(例えば、9-24 V AC/DC調整可能なパワーアダプタ)を使用して、モータを個別に駆動できます。</li>
	<li>勾配製造ステーションの隣に注射器ポンプ (F) を置き、注射器を針で接続します。</li>
	<li>ジョイスティックを使用してチューブホルダーステージを上下に制御します。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>アイテム</td>
		</tr>
<tr>
<td>B1</td>
			<td>リニアステージアクチュエータ</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1</td>
			<td>ステッパーモータードライバー</td>
		</tr>
<tr>
<td>E2</td>
			<td>UNOプロジェクトスーパースターターキット</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>ブレッド ボード</td>
		</tr>
<tr>
<td>A2</td>
			<td>垂直ブラケット</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>スリムな直角ブラケット</td>
		</tr>
<tr>
<td>C1</td>
			<td>ミニシリーズブレッドボード</td>
		</tr>
<tr>
<td>C5</td>
			<td>小型Vクランプ</td>
		</tr>
<tr>
<td>D4</td>
			<td>ミニチュアVクランプ</td>
		</tr>
<tr>
<td>C2</td>
			<td>Ø12.7 mmアルミニウムポスト</td>
		</tr>
<tr>
<td>C4, D3</td>
			<td>ミニシリーズ光学ポスト</td>
		</tr>
<tr>
<td>D1</td>
			<td>Ø12.7 mmアルミニウムポスト</td>
		</tr>
<tr>
<td>C3,D2</td>
			<td>直角Ø1/2"Ø6 mmポストクランプ</td>
		</tr>
<tr>
<td>C6</td>
			<td>ミニシリーズ台座ポストホルダーベース</td>
		</tr>
<tr>
<td>D5</td>
			<td>鈍い終わりの針</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘ</td>
			<td>シリンジポンプ</td>
		</tr>
</tbody></table>表3:システムコンポーネントを作るグラデーション
10. システムアセンブリの分画と検出 (図 2)。
<ol><li>チューブピアサーにUVモニターの光学モジュールを取り付けるには、通常の丸い顎のビュレットクランプを使用してください。チューブピアのコネタにチューブの一方の端(長さ1cm、内径0.56mm)を取り付け、もう一方の端を光学モジュールのFluid Inポートに取り付けます。流体アウトポートを分数部に接続します。</li>
	<li>メーカーのマニュアルに従って、光学モジュールをUVモニタの制御ユニットに接続します。</li>
	<li>ブレイクアウトケーブルを使用して、信号出力ソケットをグラウンドおよびアナログ入力接続のデジタルコンバータに接続します(製造元のマニュアルに従います)。</li>
	<li>通常のUSBケーブルを使用してデジタルコンバータをラップトップに接続し、データ収集ソフトウェアを使用して変換されたデジタル信号を記録します。</li>
</ol>

<ol><li>Götz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li>
<li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li>
<li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li>
<li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+neurogenesis%3A+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359(2012).</li>
<li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li>
<li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eIF4E1%2F4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li>
<li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018(2020).</li>
<li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li>
<li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+on+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295(2014).</li>
<li>Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15(2017).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%3A+Official+Journal+of+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455(2014).</li>
</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。

ポリサムプロファイリングは、単一遺伝子およびゲノムワイドレベル14 の両方で翻訳状態を評価する一般的かつ強力な技術である。本レポートでは、開発中のマウス皮質を分析するための、ホームアセンブルプラットフォームとそのアプリケーションを用いたポリソームプロファイリングのプロトコルを紹介する。この費用対効果の高いプラットフォームは、堅牢で再現性の高いショ糖勾配と高感度のポリソームプロファイリングを組み立て、生成することが容易です。
再現可能なポリソームプロファイリング結果17を得るためには、一貫した良質のショ糖勾配の調製が重要であることに注意する価値があります。勾配の準備中に10〜50%のスクロース溶液の体積が変化すると、下流解析でポリソームピークのシフトと結果の不一致が生じる可能性があります。さらに、針の挿入および除去の間に勾配を乱す、勾配準備の矛盾に寄与する可能性がある。他のアプローチや商用デバイスと比較して、当社の自家製グラデーション作りシステムは、準備中の勾配の乱れを軽減するために電動ス...

哺乳類の脳の発達の間に、神経幹細胞は増殖し、分化してニューロンとグリア1、2を生成する。このプロセスの摂動は、脳の構造と機能の変化につながることができます, 多くの神経発達障害に見られるように3,4.神経幹細胞の適切な行動は、特定の遺伝子5の調整された発現を必要とする。これらの遺伝子のエピジェネティックおよび転写制御は鋭意的に研究されているが、最近の知見は、他のレベルでの遺伝子調節が、神経幹細胞増殖と分化6、7、8、9、10の協調にも寄与することを示唆している。このように、翻訳制御プログラムに取り組むことは、神経幹細胞の運命決定と脳の発達の根底にあるメカニズムの理解を大きく進める。
リボソームプロファイリング、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)およびポリソームプロファイリングを含むmRNAの翻訳状態を評価するために、異なる強みを有する3つの主要な技術が広く適用されている。リボソームプロファイリングはRNAシーケンシングを使用してリボソームで保護されたmRNA断片を決定し、各転写物の翻訳リボソームの数と位置をグローバルに分析し、転写量11と比較して間接的に翻訳速度を推測することを可能にする。TRAPはエピトープタグ付きリボソームタンパク質を利用してリボソーム結合mRNA12を捕捉する。タグ付きリボソームタンパク質が遺伝的アプローチを用いて特定の細胞型で発現できることを考えると、TRAPは細胞型特異的な方法で翻訳を分析することを可能にする。これに対して、ポリソームプロファイリングは、ショ糖密度勾配分画を使用して、自由で翻訳不良な部分(軽いモノソーム)をリボソーム(重いポリソーム)によって積極的に翻訳されているものから分離し、mRNA13上のリボソーム密度を直接測定する。この技術が提供する1つの利点は、ゲノム全体の翻訳法解析14と同様に、関心のある特定のmRNAの翻訳を研究するための汎用性である。
本論文では、開発中のマウス大脳皮質を分析するためのポリソームプロファイリングの詳細なプロトコルについて述べている。私たちは、ショ糖密度勾配を準備し、下流のアプリケーションの分数を収集するために、ホームアセンブルシステムを使用しています。ここで提示されるプロトコルは、他のタイプの組織および生物を分析するために容易に適応することができる。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL RNA フリーマイクロチューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm ディッシュ</td><td>Greiner-Bio</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>21-23G ニードル</td><td>BD</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM8640G</td><td></td></tr><tr><td>30 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>鈍い端針</td><td>VWR</td><td>20068-781</td><td></td></tr><tr><td>ブレッドボード</td><td>Thorlabs</td><td>MB2530/M</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Σ</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>CD1 マウス</td><td></td><td>チャールズリバー研究所</td><td></td></tr><tr><td>湾曲先端鉗子</td><td>Sigma</td> <td>#Z168785</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td></td><td>Sigma</td><td>66-81-9</td></tr><tr><td>データ収集ソフトウェアTracerDAQ</td><td>測定コンピューティング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタルコンバータ</td><td></td><td>測定コンピューティング</td><td>USB-1208LS</td></tr><tr><td>ダイレクトゾルRNAミニプレップキット</td><td>Zymo</td><td>R2070</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>バイオベーシック</td><td>12-03-3483</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>バイオショップ</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>デュモン No.5 鉗子</td><td>シグマ</td> <td>#F6521</td><td></td></tr><tr><td>フラクションコレクター</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 2110</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wisent</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>リニアステージアクチュエータ</td><td>Rattmmotor</td><td>CBX1605-100A</td><td></td></tr><tr><td>ルシフェラーゼ制御</td><td>RNA Promega</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>Maxima ファーストストランド cDNA 合成キット</td><td>Themo Fisher</td><td>M1681</td><td></td></tr><tr><td>ミニチュア V クランプ</td><td>Thorlabs</td><td>VH1/M</td><td></td></tr><tr><td>ミニシリーズブレッドボード</td><td>Thorlabs</td><td>MSB7515/M</td><td></td></tr><tr><td>ミニシリーズ光学ポスト</td><td>Thorlabs</td><td>MS2R/M</td><td></td></tr><tr><td>ミニシリーズペデスタルポストホルダーベース</td><td>Thorlabs</td><td>MBA1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>バイオベーシック</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>ニューロベースメディア</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash;12.7 mm アルミニウム ポスト</td><td>Thorlabs</td><td>TRA150/M</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR グリーン fastmix</td><td>Quanta Bio</td><td>CA101414-274</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td> <td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Bioshop</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>直角クランプ</td><td>Thorlabs</td><td>RA90/M</td><td></td></tr><tr><td>直角&Oslash;1/2 "から&Oslash;6 mm ポストクランプ</td><td>Thorlabs</td><td>RA90TR/M</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>RNase フリーチップ</td><td>Frogga Bio</td><td>FT10, FT200, FT1000</td><td></td></tr><tr><td>RNase フリーウォーター</td><td>Wisent</td><td>809-115-CL</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>スリム直角ブラケット</td><td>Thorlabs</td><td>AB90B/M</td><td></td></tr><tr><td>小さいVクランプ</td><td>Thorlabs</td><td>VC1/M</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムのデオキシコール酸塩</td><td>のシグマ</td><td>302-95-4</td><td></td></tr><tr><td>のステッピング モーター ドライバー</td><td>SongHe</td><td>TB6600</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Bioshop</td><td>57501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Tiの回転子</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ ポンプ</td><td>ハーバードの装置</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ</td><td>ハーバード装置</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>バイオベーシック</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>チューブピアサー</td><td>ブランデル</td><td>BR-184</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td></td><td>ベックマン・コールター</td><td>L8-70M</td></tr><tr><td>超遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>UNOプロジェクトスーパースターターキット</td><td>Elegoo</td><td>EL-KIT-003</td><td></td></tr><tr><td>UVモニター</td><td>Bio-Rad</td><td>EM-1 Econo</td><td></td></tr><tr><td>Vertical bracket</td><td>Thorlabs</td><td>VB01A/M</td><td></td></tr></tbody></table>

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

哺乳類の脳の適切な発達は、神経幹細胞増殖と異なる神経細胞タイプへの分化の細かいバランスに依存しています。このバランスは、転写、転写後、翻訳など、複数のレベルで微調整された遺伝子発現によって厳しく制御されます。この点で、証拠の成長体は、神経幹細胞の運命決定を調整する際の翻訳調節の重要な役割を強調しています。ポリサム分画は、グローバルおよび個々の遺伝子レベルの両方でmRNA翻訳状態を評価するための強力なツールです。ここでは、開発中のマウス大脳皮質からの細胞の翻訳効率を評価するための社内ポリソームプロファイリングパイプラインを提示する。我々は、sucrose勾配調製、組織ライシス、超遠心分離及び分画ベースのmRNA翻訳状態の分析のためのプロトコルを記述する。

デモンストレーションとして、75μg RNA(8胚からプール)を含む皮質リセートを、スクロース勾配によって12画分に分離した。254 nmにおけるUV吸光度のピークは、40Sサブユニット、60Sサブユニット、80Sモノソームおよびポリソームを含む画分を同定した(図4A)。大きいリボソームサブユニットのウェスタンブロットによる分画の分析は、Rpl10は60Sサブユニット(画分3)、単数(画分4)およびポリソーム(画分5〜12)におけるその存在を示した(図4B)。対照的に、細胞質タンパク質GapdhとCsde1はリボソームと関連していなかったが、遊離RNAを含む分画(画分1)で濃縮された(図4B)。異なる画分におけるタンパク質の分離と一致して、我々は、gapdhとsox2 mRNAが重いポリソーム(画分7-12の3つ以上のリボソーム)を含む画分において非常に富化していることを発見し、ガプドおよびsox2...

哺乳類の脳の発達には、翻訳のレベルでの遺伝子発現の適切な制御が必要です。ここでは、発達中の脳におけるmRNAの翻訳状態を評価するための、組み立て易いショ糖勾配および分画プラットフォームを備えたポリソームプロファイリングシステムについて説明する。

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

トランスレーショナルレギュレーションは脳の発達に重要な役割を果たしています。ポリソームプロファイリングは、mRNAの翻訳状態を評価するための有用かつ強力なツールを提供し、脳の発達中に翻訳制御機能を調べることができます。この方法は、スクロース勾配を作成し、ポリソーム分画を評価するための簡単で低コストのアプローチです。このプロトコルでは、開発中のマウス皮質を分析するために使用されます。しかし、他のシステムを研究するために容易に適応させることができる。2.2モルショ糖を希釈して6つの10〜50%のショ糖勾配を調製します。30ミリリットルのシリンジに約16ミリリットルの10%スクロースを充填し、シリンジポンプに置き、針に接続します。注射器、チューブ、または針に気泡がないことを確認し、針の先端を拭いて残留液を取り除きます。針の先端が下部のチューブの中央に触れるようなモーターステージを上に移動します。シリンジポンプを1分あたり2ミリリットルの流量に設定し、体積は2.3ミリリットルです。10%スクロース溶液の2.3ミリリットルを分配した後、電動ステージを下に移動し、6つの勾配すべてについてプロセスを繰り返します。その後、チューブの下部に20%スクロース溶液を加え、次いで胚12日目にCD1マウス胚を30、4、50%収集し、氷冷HBSSを含む10センチメートルのプレートに氷の上に置きます。解剖範囲の下で、1つの胚を氷冷HBSSを含む6センチメートルのプレートに移す。21~23本のゲージ針を使用して、45度の角度で目を貫通して頭部の位置を固定し、針がプレートに固定されていることを確認するために力を加えます。5番の鉗子を使用して、皮膚と頭蓋骨を中央から側面に取り除き、嗅球を切り、髄液を取り除いて皮質組織を露出させます。湾曲した鉗子を使用して、皮質組織を氷上の神経基底培地の2〜3ミリリットルに切断する。必要に応じて異なる胚から組織を引っ張ります。8~10個の胚の組織は、通常、総RNAの約200マイクログラムを与える。解剖した組織を含む神経基底培地にサイクロヘキシミドを加え、1ミリリットル当たり100マイクログラムの最終濃度にし、摂氏37度で10分間インキュベートする。500 x g で 5 分間摂氏 4 度で組織を遠心分離し、上清を捨てます。氷冷PBSで2回、ミリリットルシクロヘキシミドあたり100マイクログラムを加えた組織を洗浄します。500マイクロリットルの細胞ライシスバッファーを加え、4マイクロリットルのRNase阻害剤とピペットを上下に添加して組織を再中断します。インスリン針を使用して、組織を穏やかに取り付けます。その後、2〜3分ごとに短い渦で10分間氷の上でインキュベートします。インキュベーション後、2000 x gでリセートを摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を氷上の新しい遠心分離管に移します。このプロセスを13,000 x gでもう一度遠心分離を繰り返します。上清を氷上の新しい遠心管に移した後、UV-Vis分光光度計を用いて組織ライセート中のRNA濃度を測定する。スクロースの勾配の上にサンプルをロードし、ゆっくりと超遠心チューブの壁にライゼートを分配します。バケツにスクロースの勾配をそっと入れ、サンプルを190、000 x g、摂氏4度で90分間超遠心分離します。チューブピアサーに空の超遠心チューブを置き、下から針でチューブをそっと貫通します。60%スクロースチェイス溶液の25ミリリットルで30ミリリットルのシリンジを充填します。次に、チェイス溶液が空のチューブを満たし、254ナノメートルのUVモニタを通過して検出用のベースラインを設定するように、注射器を静かに押します。UV モニタの auto 0 キーを押して検出用のベースラインを登録し、ソフトウェアの再生を押して録音を開始します。システムがベースラインを確立したら、ソフトウェアの記録を一時停止し、追跡ソリューションを撤回し、システムに残った追跡ソリューションが残らないようにします。チューブピアサーにサンプルチューブを1つロードし、下から針でチューブをそっと貫通します。ソフトウェアでの録音を開始し、ラインに気泡がないことを確認してください。次に、シリンジポンプと分数コレクターを起動して、ポリサム分画を収集し、分数を30秒に設定します。1.5ミリリットルのチューブに分数を収集します。8個の胚から引き出されたRNAを含む皮質リセートを、スクロース勾配によって12画分に分離した。254ナノメートルのUV吸光度のピークは、40Sサブユニット60Sサブユニットと80Sモノソームとポリソームを含む画分を同定した。大きいリボソームサブユニットRpl10のウェスタンブロットによる分画の分析は、60Sサブユニット単数体およびポリソームにおけるその存在を示した。対照的に、細胞質タンパク質、GapdhおよびCsde1は、リボソームと関連していなかったが、遊離RNAを含む画分で濃縮された。異なる画分におけるタンパク質の分離と一致して、Gapdhとsox2 mRNAは重いポリソームを含む画分において高度に濃縮され、これらのmRNAが現像皮質で効率的に翻訳されることを示唆している。対照的に、rpl7およびrpl35 mRNAは単数を含む分数で濃縮され、抑圧された翻訳を示唆した。再現性のある結果を得るためには、ショ糖勾配の作成において一貫性を保つ事が重要です。シリンジポンプは、スクロースを排出するために使用する必要があります。分画およびサンプル採取の間に、RNaseフリーの水でシステムを洗浄することが重要である。これにより、前のサンプルから残っている残りのスクロースが減少します。この方法は、様々な組織におけるmRNAの翻訳ステータスを評価するために使用することができる。このプラットフォームを使用すると、ポリサムプロファイリング用の一貫した勾配を取得できるため、この古典的で便利な手法に対する低コストのソリューションが提供されます。

analysis-translation-developing-mouse-brain-using-polysome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、ストレス条件に応答する真核細胞のmRNA翻訳の開始の変化を分析するための方法を記載している。このメソッドは、非翻訳リボソームからリボソームを翻訳するショ糖勾配に速度の分離に基づいています。...

ポリソームプロファイリングによってストレス状態の間に翻訳開始の分析

このプロトコルは、in vivoでのCNSサンプルのtranslatomeを研究するためにポリリボソーム分画の本質的な変更を示している。これは、結合したRNA画分をリボソームへの全RNAの単離と比較を通じて翻訳と転写制御の全体的な評価が可能になります。...

ポリリボソーム画によって中枢神経系Translatomeの生体尋問中

リボソームはタンパク質合成の中心的な役割を果たしている。ショ糖密度勾配遠心分離によりポリリボソーム（ポリソーム）分画は、ゲノムワイドな規模での個々のmRNAの翻訳効率の直接測定を可能にする。さらに、この方法は、シャペロンおよびシグナル伝達分子としてのリボソーム及びポリソーム関連因子の生化学的分析のために使用することができる。...

ゲノム規模で哺乳類Translatomesのソーム分画および分析

細胞がストレスに適応する能力は、彼らの生存にとって非常に重要です。mRNA翻訳の制御は、プロテオームの迅速な制御を可能にする適応戦略の1つです。ここでは、ストレス条件下で選択的に翻訳される特定のmRNAを同定するための標準化されたポリソームプロファイリングプロトコルを提供します。...

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

タンパク質合成制御は主に翻訳開始段階で行われ、その欠陥は多様な障害に関連しています。それらの病因をよりよく理解するために、ここでは、翻訳開始因子eIF4G1の変異体の存在下でmos転写産物の翻訳を評価するXenopus...

アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、 アフリカツメガエル

リボソームの構造は広範囲に特徴付けられていますが、ポリソームの組織化はまだ十分に研究されていません。この知識不足を克服するために、ここでは、空気中および液体中の原子間力顕微鏡(AFM)による哺乳類のポリソームの正確なイメージングのための詳細な準備プロトコルを示します。...

原子間力顕微鏡で脳ポリソームでピアリング

ポリソーム プロファイリング技術の全体的な目標は、タンパク質合成時に個々 の mRNAs のトランスクリプトーム Mrna...

リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

ポリソーム分離灌流マウスの心臓でプロファイリングを実行するためのプロトコルをご紹介します。心の灌流、プロファイリング、ポリソーム Mrna、Mirna、・ ポリソーム...

動的プロテオミクスおよび miRNA 蛍光灌流後分離されたマウス心臓ポリソームの分析

ここでは、リボタグシステムを用いた成人男性マウス生殖細胞の選択集団からリボソームおよび関連RNAの免疫沈降について説明する。戦略的な繁殖と慎重な免疫沈降は、細菌細胞の翻訳を知らせ、変異型のメカニズムに関する洞察を提供するクリーンで再現可能な結果をもたらします。...

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

このプロトコルは、 インビトロ...

単一の卵母細胞レポーターアッセイを用いたインビトロ成熟時の母体母体翻訳プログラムの定義

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。...

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

学ぼう、ポリソームプロファイリングを用いてマウス脳の発達におけるmRNA翻訳効率を評価する方法を。シクロヘキシミド処理と超遠心分離により、リボソームサブユニットとポリソームを分離し、神経組織での翻訳制御を解析できます。

ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析

さらに動画を探す