ポリソームプロファイリングを用いたマウス脳の発達における翻訳の解析
2021年5月22日
哺乳類の脳の発達には、翻訳のレベルでの遺伝子発現の適切な制御が必要です。ここでは、発達中の脳におけるmRNAの翻訳状態を評価するための、組み立て易いショ糖勾配および分画プラットフォームを備えたポリソームプロファイリングシステムについて説明する。
トランスレーショナルレギュレーションは脳の発達に重要な役割を果たしています。ポリソームプロファイリングは、mRNAの翻訳状態を評価するための有用かつ強力なツールを提供し、脳の発達中に翻訳制御機能を調べることができます。この方法は、スクロース勾配を作成し、ポリソーム分画を評価するための簡単で低コストのアプローチです。
このプロトコルでは、開発中のマウス皮質を分析するために使用されます。しかし、他のシステムを研究するために容易に適応させることができる。2.2モルショ糖を希釈して6つの10〜50%のショ糖勾配を調製します。
30ミリリットルのシリンジに約16ミリリットルの10%スクロースを充填し、シリンジポンプに置き、針に接続します。注射器、チューブ、または針に気泡がないことを確認し、針の先端を拭いて残留液を取り除きます。針の先端が下部のチューブの中央に触れるようなモーターステージを上に移動します。
シリンジポンプを1分あたり2ミリリットルの流量に設定し、体積は2.3ミリリットルです。10%スクロース溶液の2.3ミリリットルを分配した後、電動ステージを下に移動し、6つの勾配すべてについてプロセスを繰り返します。その後、チューブの下部に20%スクロース溶液を加え、次いで胚12日目にCD1マウス胚を30、4、50%収集し、氷冷HBSSを含む10センチメートルのプレートに氷の上に置きます。
解剖範囲の下で、1つの胚を氷冷HBSSを含む6センチメートルのプレートに移す。21~23本のゲージ針を使用して、45度の角度で目を貫通して頭部の位置を固定し、針がプレートに固定されていることを確認するために力を加えます。5番の鉗子を使用して、皮膚と頭蓋骨を中央から側面に取り除き、嗅球を切り、髄液を取り除いて皮質組織を露出させます。
湾曲した鉗子を使用して、皮質組織を氷上の神経基底培地の2〜3ミリリットルに切断する。必要に応じて異なる胚から組織を引っ張ります。8~10個の胚の組織は、通常、総RNAの約200マイクログラムを与える。
解剖した組織を含む神経基底培地にサイクロヘキシミドを加え、1ミリリットル当たり100マイクログラムの最終濃度にし、摂氏37度で10分間インキュベートする。500 x g で 5 分間摂氏 4 度で組織を遠心分離し、上清を捨てます。氷冷PBSで2回、ミリリットルシクロヘキシミドあたり100マイクログラムを加えた組織を洗浄します。
500マイクロリットルの細胞ライシスバッファーを加え、4マイクロリットルのRNase阻害剤とピペットを上下に添加して組織を再中断します。インスリン針を使用して、組織を穏やかに取り付けます。その後、2〜3分ごとに短い渦で10分間氷の上でインキュベートします。
インキュベーション後、2000 x gでリセートを摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を氷上の新しい遠心分離管に移します。このプロセスを13,000 x gでもう一度遠心分離を繰り返します。上清を氷上の新しい遠心管に移した後、UV-Vis分光光度計を用いて組織ライセート中のRNA濃度を測定する。
スクロースの勾配の上にサンプルをロードし、ゆっくりと超遠心チューブの壁にライゼートを分配します。バケツにスクロースの勾配をそっと入れ、サンプルを190、000 x g、摂氏4度で90分間超遠心分離します。チューブピアサーに空の超遠心チューブを置き、下から針でチューブをそっと貫通します。
60%スクロースチェイス溶液の25ミリリットルで30ミリリットルのシリンジを充填します。次に、チェイス溶液が空のチューブを満たし、254ナノメートルのUVモニタを通過して検出用のベースラインを設定するように、注射器を静かに押します。UV モニタの auto 0 キーを押して検出用のベースラインを登録し、ソフトウェアの再生を押して録音を開始します。
システムがベースラインを確立したら、ソフトウェアの記録を一時停止し、追跡ソリューションを撤回し、システムに残った追跡ソリューションが残らないようにします。チューブピアサーにサンプルチューブを1つロードし、下から針でチューブをそっと貫通します。ソフトウェアでの録音を開始し、ラインに気泡がないことを確認してください。
次に、シリンジポンプと分数コレクターを起動して、ポリサム分画を収集し、分数を30秒に設定します。1.5ミリリットルのチューブに分数を収集します。8個の胚から引き出されたRNAを含む皮質リセートを、スクロース勾配によって12画分に分離した。
254ナノメートルのUV吸光度のピークは、40Sサブユニット60Sサブユニットと80Sモノソームとポリソームを含む画分を同定した。大きいリボソームサブユニットRpl10のウェスタンブロットによる分画の分析は、60Sサブユニット単数体およびポリソームにおけるその存在を示した。対照的に、細胞質タンパク質、GapdhおよびCsde1は、リボソームと関連していなかったが、遊離RNAを含む画分で濃縮された。
異なる画分におけるタンパク質の分離と一致して、Gapdhとsox2 mRNAは重いポリソームを含む画分において高度に濃縮され、これらのmRNAが現像皮質で効率的に翻訳されることを示唆している。対照的に、rpl7およびrpl35 mRNAは単数を含む分数で濃縮され、抑圧された翻訳を示唆した。再現性のある結果を得るためには、ショ糖勾配の作成において一貫性を保つ事が重要です。
シリンジポンプは、スクロースを排出するために使用する必要があります。分画およびサンプル採取の間に、RNaseフリーの水でシステムを洗浄することが重要である。これにより、前のサンプルから残っている残りのスクロースが減少します。
この方法は、様々な組織におけるmRNAの翻訳ステータスを評価するために使用することができる。このプラットフォームを使用すると、ポリサムプロファイリング用の一貫した勾配を取得できるため、この古典的で便利な手法に対する低コストのソリューションが提供されます。
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概要
この研究は、発達中の哺乳類の脳におけるmRNAの翻訳状態を評価することを目的としたポリソームプロファイリングシステムを提示します。この方法は、容易に組み立てられるスクロース勾配製造および分画プラットフォームを使用して、発達中のマウスの皮質における翻訳制御機能を分析します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 遺伝子発現
- 発生生物学
背景
- 翻訳制御は脳の発達に重要です。
- ポリソームプロファイリングはmRNAの翻訳を調べるための効果的な技術です。
- この方法は低コストの実験を可能にし、様々なシステムに適応できます。
研究の目的
- mRNAの翻訳状態を評価するためのプラットフォームを開発すること。
- 発達中の脳における翻訳制御の役割を調査すること。
- この分野の研究者向けにアクセスしやすいプロトコルを提供すること。
使用された方法
- この研究では、スクロース勾配製造および分画プラットフォームを使用しています。
- 生物学モデルには発達中のマウス皮質が含まれ、特に皮質組織を分析します。
- 重要なタイムラインには、様々なスクロース勾配の調製とその後の遠心分離ステップが含まれます。
- 追加の重要なステップには、組織の解剖、RNA測定、UVモニタリングが含まれます。
主な結果
- この方法は翻訳状態に基づいてmRNAを分離することに成功し、異なるリボソームサブユニットとポリソームを特定しました。
- 特定のmRNAは重いポリソームと関連し、活発な翻訳を示す一方で、他のmRNAはモノソームフラクションに豊富に存在し、抑制された翻訳を示唆しました。
- ウエスタンブロッティング分析により、特定されたフラクションに特定のリボソームタンパク質の存在が確認されました。
結論
- この研究は脳の発達中のmRNA翻訳を調べるための再現可能なアプローチを可能にします。
- この方法の適応性により、様々な組織で評価が可能となり、神経メカニズムの理解に貢献します。
- 翻訳制御に関する洞察は、神経可塑性と発達に関する将来の研究に情報を提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Translational regulation is a critical inflection point in neurodevelopmental target validation and mechanistic de-risking for CNS drug discovery. Polysome profiling enables direct measurement of mRNA translation efficiency, providing predictive confidence in gene expression control during neural differentiation. This capability supports risk-adjusted portfolio decisions by clarifying translational bottlenecks in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of translational control mechanisms underlying neural stem cell fate decisions.
- Supports functional target validation by distinguishing actively translated mRNAs from repressed transcripts.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping translational outputs to specific gene targets.
- Improves predictive confidence in pathway modulation strategies for neurodevelopmental disorders.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neural tissue systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of mRNA translation status across gene targets.
- Enables assay standardization and platform reuse for translational efficiency measurements.
- Supports reliable evaluation of candidate molecules impacting translational regulation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns translational biomarker discovery with disease-relevant neural models.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical validation of translational control points.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by clarifying translational bottlenecks.
- Provides mechanistic insight into gene expression regulation in developing brain tissue.
Pipeline & Workflow Integration
Polysome profiling integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, enabling direct assessment of translational regulation in neural tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying translation of specific mRNAs.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers UV absorbance and Western blot readouts to compare translational status across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant neural systems for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable platform for translational studies across diverse tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental target validation.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable translational profiling workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and advancement of CNS discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissection and RNA handling.
- Needs access to ultracentrifugation and UV absorbance instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization of gradient preparation and sample processing.
- Adaptable to various tissue types and developmental stages with protocol optimization.
- Reproducibility depends on consistent gradient formation and RNase-free conditions.
