標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

腸モデルは、腸の漏れや、マウスの腸内での白血球の移動方法を測定するための広く適応可能で生理学的な方法です。この方法は、腸透過性および病理腸炎症の増加の根底にあるメカニズムをよりよく理解するのに役立つ。この技術は、潰瘍性大腸炎およびクローン病に見られるように、腸バリア機能の基礎となるメカニズム、および病理学的炎症を理解するのに役立つ。

このモデルは、マウスにおける腸バリア機能または免疫細胞の形成の検査のために、回腸または近位結腸のいずれかである、十分に血管化された外形化された腸セグメントを採用する。この広範な適用によって、腸ループモデルは漏れがある腸の障壁および炎症性応答から生じる病気の洞察力を提供できる。闘争は、外科的ステップを練習することによって克服することができます。

完全に血管化された腸管セグメントを外装し、出血を避けるために結紮のための適切な場所を選択することが非常に重要です。腸ループモデルは、マイクロ外科的手法であり、従って、他の外科手術と同様に、それは、視覚的なデモンストレーションと方法のステップバイステップの提示から大いに利益を得る。麻酔の外科面を達成した後、アルコール綿棒または70%エタノールを浸したガーゼスポンジで腹部中線の毛皮をスクラブすることから始めます。

低体温症を防ぐために、アルコールで毛皮の広い範囲を濡らないでください。はさみを使用して、中線の腹腔切多を行います。腹部の真ん中に水平切開を行い、腹膜を露出させ、腹腔内臓器を傷付けないように注意する。

露出した腹腔の上にプレカットウェットコットンガーゼを置きます。濡れた綿棒を使用して、セカムを動員して外装し、湿った綿のガーゼの上に慎重に置きます。その後、回腸を動員し、穏やかに外装します。

腸間膜血管と血液供給を中断することなく、湿った綿ガーゼに少なくとも6センチメートルの末端回腸を展開します。露出した組織は、常に暖かいHBSSで湿った状態に保ちます。盲腸に近い腸間腸内の回腸を供給する主要な動脈を特定する。

次に、重要な血管のない腸間腸内の2つのライゲーション部位を見つける。鈍いティッシュ鉗子で末端の回腸をつかみ、細かい先端鉗子を使用して腸間質をフェンレス化し、血管を避ける。穿穿片を横切ってシルク縫合糸を配置し、外科結び目を結んで最初の結紮を作成します。

ルーラーを使用して、最初の合字から 4 センチ離れた位置を測定し、2 番目の合字を作成します。細かいはさみで各ライゲーションの隣に慎重にカットして、4センチメートルの回腸を分離し、血液供給と腸間膜をそのまま維持します。10ミリリットルのシリンジに取り付けられた柔軟な黄色の給餌管を使用して、暖かいHBSSでイレラルループセグメントの内容を静かに洗い流します。

手術部位を清潔に保つために、明るい内容物を腹腔から洗い流してください。シルク縫合糸でフラッシュされたイレラルループの2つのカットエンドをリゲートします。30ゲージ針を持つ1ミリリットルの注射器を使用して、FITC-デックストランスやケモカインなどの250マイクロリットルの試薬を腸内腔にゆっくりと注入します。

回腸ループが膨張し、粘膜の適度な膨張を引き起こす。逆切断針で、針ホルダー、解剖鉗子、および3.0非吸収性シルク縫合糸を使用して腹壁を閉じます。低体温を防ぐために動物を乾燥させた後、インキュベーション期間の温度調節麻酔室に置く。

手術のためにマウスを準備し、前に示したようにセカムを外装します。湿った綿棒を使用して、回腸全体を外装し、湿った綿のガーゼの上に置きます。近位結腸とメソコロンに位置する血液供給を特定します。

近位コロンを動員し、セカムから約0.5センチメートル遠位でメソコロンの血管のない領域に最初の合字を作成します。最初の合字から2センチメートルを測定し、メソコロンの血液供給のない領域で2番目の合字を作成します。細かいはさみを使用して、慎重に2センチメートルの長さのpcLoopを分離するために各ライゲーションの隣にカットします。

10ミリリットルのシリンジに取り付けられた柔軟な黄色の給餌チューブを使用して、pcLoopを温かいHBSSで静かに洗い流し、便を除去します。手術部位を清潔に保つために、明るい内容物を腹腔から洗い流してください。次に、シルク縫合糸を使用して、フラッシュされたpcLoopの2つのカット端をリゲートします。

30ゲージ針を持つ1ミリリットルの注射器を使用して、FITC-dextranやケモカインなどの試薬を腸内腔にゆっくりと200マイクロリットル注入します。pcLoopが膨張し、粘膜の適度な膨張を引き起こす。湿った綿棒を使用して、結紮されたpcLoop、ileum、および盲腸をそっと戻します。

逆切断針で、針ホルダー、解剖鉗子、および3.0非吸収性シルク縫合糸を使用して腹壁を閉じます。インキュベーション期間の後、麻酔マウスを安楽死させ、分析のために組織を収集する。腸透過性の評価のためのIループモデルの精度を検証するために、FITC-dextran pcLoopアッセイを実施し、生体内の腸バリア機能の調節における緊密な結合関連タンパク質Jam-aの役割を評価した。

pcLoopモデルでは、対照と比較して、FITC-デキストラン血清レベルの2.5倍の増加がジャム-aヌルマウスで定量化されました。同様の結果は、腸上皮細胞上のJam-aの選択的損失を有するマウスで得られた。pcLoopモデルは、多形核好中球(PMN)、腸粘膜への採用およびその後の生体内での経上皮移動を研究するために使用された。

pcLoopの発光含有量におけるPMNの数をフローサイトメトリー解析により定量した。近位結腸のセグメントに存在するPMNの数は生理学的条件下で少なかった。手術前に、炎症性サイトカイン、TNFアルファおよびIFN γによる前処理は、pcLoopルーメンに募集されたPMNの増強された数をもたらした。

PMNケモ誘引LTB4の投与は、PMN数の劇的な増加につながった。大腸粘膜におけるPMNの免疫ヒストレカル染色は、サイトカインおよびLTB4による刺激後のPMNの上昇の募集を裏付ける。PMN経上皮移動に対するジャム-aの寄与を、腸上皮細胞上のJam-aの選択的喪失を有するマウス上のpcLoopモデルを用いて検討した。

上皮ジャムaの喪失は、ゴミ捨て制御と比較して大腸内腔中の転生PMNの数を減少させた。この技術の重要な側面は、手術を行うときに外装された腸管セグメントへの血液供給を維持することを忘れさせておいてください。このプロトコルに従って、腸透過性アッセイや好中球性経上皮移行アッセイなどの他の方法を行い、生体内のバリア完全性および腸炎症の喪失を調査することができる。