Name: 標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ 標準化腸ループモデルを用いてマウスの腸透過性と好中球経上皮移動を定量的に評価する方法。JAM-Aタンパク質の役割を解明し、炎症性腸疾患の病態メカニズムを生理学的条件下で研究する強力なツールです。

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著者らは、ヴュルツブルク大学のスヴェン・フレミング博士が、近位大腸ループモデルの確立に貢献した、マウスコロニーの管理にショーン・ワトソン、iLoopモデルの写真の入手を支援してくれたチトラ・K・ムラリードハランに感謝する。この研究は、ドイツ研究財団/DFG(BO 5776/2-1)からKB、R01DK079392、R01DK072564、R01DK061379からC.A.P.に支援されました。

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著者らは開示するものは何もない。

IBDなどの病理的条件下での腸バリア機能の調節障害や免疫細胞の形成を担う機構は不完全に理解されている。ここでは、腸管または近位結腸の血管化された外形性腸セグメントを採用し、腸の透過性、好中球移動研究、ならびに他の用途の評価を可能にする、堅牢なin vivoマウスモデルについて詳述する。
iLoopは生きている動物に対して行われる非回復手術である。麻酔は実験の過程で継続的に監視する必要があり、沈下深度の評価は必須です。最も重要なステップは、(1)iLoopの単離、(2)切り端の結紮、(3)試薬溶液のイントラミラル注入によるiLoopのインフレーションを含む。これらの各ステップでは、出血が起こり、iLoopの血液供給が損なわれ、結果の精度に影響を与える。注意すべきは、PMN TEpMアッセイ中のイントラミン性出血のまれな例では、ここで提示されるフローサイトメトリー測定戦略は、血流から直接発生するPMN(非移行PMN)から移行したPMNを区別するのに役立ちます。iLoopルーメンに集められたトランスマイグレートPMNは、循環PMNと比較して高</sup...

腸粘膜は、単層の柱状腸上皮細胞(IEC)、下層の層の層の下層の下層のプロプリア免疫細胞および筋性粘膜を包含する。栄養素の吸収におけるその役割に加えて、腸上皮は、発光コメンサル細菌、病原体、および食事抗原から身体内部を保護する物理的な障壁である。また、IECとラミネラプロプリア免疫細胞は、コンテキストおよび刺激に応じて耐性または応答のいずれかを誘導する免疫応答を調整します。上皮バリアの破壊は、病的粘膜炎症の発症に先行し、潰瘍性大腸炎およびクローン病1、2、3、4、5、6、7の両方を包含する炎症性腸疾患(IBD)に寄与することが報告されている。潰瘍性大腸炎を有する個体は、多形核好中球(PMN)の過剰な経上皮移行(TEpM)を形成し、陰窩膿瘍を形成し、疾患8、9の重症度に関連していた知見である。侵害された上皮バリア機能と過剰な免疫応答はIBDの特徴であるが、腸粘膜への腸透過性および免疫細胞の配置の定量的評価を行う実験的インビボアッセイが不足している。
腸上皮透過性およびPMN TEpMを研究するために用いられる最も一般的な方法は、半透過性多孔膜挿入物10、11、12に培養されたIEC単層を用いたex vivoチャンバーベースのアプローチを採用する。上皮バリア完全性は、エピテリア電気抵抗(TEER)またはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識デキストランの経上皮電気抵抗(TEER)の測定値のいずれかによって監視される。同様に、PMN TEpMは、典型的には、下のチャンバ16に添加される化学誘引剤に応答して研究される。PMNは上部チャンバに置かれ、インキュベーション期間の後、基底コンパートメントに移行したPMNが収集され、定量化される。これらの方法は便利で、実行しやすく、非常に再現性がありますが、明らかに還元的なアプローチであり、必ずしもin vivo条件の正確な反映を表すものではありません。
マウスにおいて、腸内細胞透過性を研究する一般的なアッセイは、FITC-デキストランの経口ギャバジおよびその後の血清中のFITC-デキストランの外観の測定による、13、17である。このアッセイの欠点は、地域の腸管の寄与ではなく、消化管の全体的なバリア完全性の評価を表していることである。また、エバンブルーは、生体内18における血管漏れを評価するために一般的に使用され、また、マウスおよびラット19、20、21における腸粘膜透過性を評価するために採用されている。腸粘膜におけるエバンスブルーの定量化は、一晩ホルムアミドでインキュベーションを採用する組織からの抽出を必要とする。したがって、同じ組織を使用して腸内皮透過性および好中球浸潤を研究することはできない。
ここでは、生体内での大腸粘膜透過性および白血球経上皮移動に関する再現性データを収集するために必要な動物の数を減らす簡単なプロトコルを強調する。したがって、さらなる分析のために収穫できる腸ループの完全性を損なうことなく、血清中で容易に検出できるFITC-dextransの使用をお勧めします。なお、腸連結ループは、細菌感染(サルモネラ菌、リステリア単球遺伝子および大腸菌など)を研究するために様々な種(マウス、ラット、ウサギ、子牛を含む)で使用されてきた22、23、24、25、腸透過性26;しかし、我々の知る限りでは、IBDに一般的に関与する腸内の特定の領域(イリウムや結腸など)におけるPMN TEpMのメカニズムを調査する研究は行っていません。
ここでは、イラミウムまたは近位結腸の良好な血管化および外形化された腸セグメントを採用した堅牢で信頼性の高いマイクロサージカルin vivo法であるマウス腸管ループ(iLoop)モデルについて説明する。iLoopモデルは生理学的に関連しており、麻酔下で生きているマウスの腸バリア完全性およびPMN TEpMの評価を可能にする。2つの用途を実証する:1)iLoop2におけるイントラミン投与後の4kDa FITC-dextranの血清レベルの定量化)強力な基調剤ロイコトリエンB4(LTB4)27の内環注入後のiLoopルーメン中のトランスマイグレーションPMNの定量化。さらに、ILoopモデルを利用して、JAM-a-nullマウスまたはIEC上でJAM-Aの選択的損失を有するマウス(Villin-cre;Jam-a fl/fl)は、コントロールマウスと比較して、腸透過性および好中球の転化15、28、29、30、31に対する緊密な接合関連タンパク質JAM-Aに対する主要な寄与を報告した以前の研究を裏付けることができる。
iLoopモデルは、体外アッセイを裏付ける高機能・生理学的方法です。さらに、これは、ケモカイン、サイトカイン、細菌病原体、毒素、抗体および治療薬を含むループ内腔に注入することができる様々な試薬の研究を可能にする多目的な実験モデルである。

<table><tbody><tr><td>機器と材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BDアルコール綿棒</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BDプレシジョングライドニードル、25G X 5/8 "</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BDプレシジョングライドニードル、30G X 1/2"</td> <td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>BD 1mlチューベルクリン注射器ニードルなし</td><td></td>BD <td>309659</td><td></td></tr><tr><td>15ml遠心分離機チューブ</td><td>コーニング</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>コーニング96ウェルソリッドブラックポリスチレンマイクロプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-592</td><td></td></tr>コー<tr><td>ニング未処理培養皿、10cm</td><td>ミリポアシグマ</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター(綿棒)、6インチ、滅菌フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>25806 2WC</td><td></td></tr><tr><td>ダイナレックスコットン充填ガーゼスポンジ、非滅菌、2インチ x 2インチ</td> <td>Medex</td><td>3249-1</td><td></td></tr><tr><td>EZ-7000 麻酔気化器 (クラシックシステム、加熱ユニットを含む)</td><td>E-Z システム</td><td>EZ-7000</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン遠心分離チューブ 50ml&nbsp;</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランドカラーラベリングテープフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>ハルゼーニードルホルダー(ニードルホルダー)&nbsp;</td><td>FST</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ、小 (ティッシュワイプ)</td><td>FisherScientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>1.7ml 微量遠心チューブ&nbsp;</td><td>トーマス・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>c2170</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ1.3mlZ(血清凝固活性化チューブ)</td><td>ザルシュテット&nbsp;</td><td>41.1501.105</td><td></td></tr><tr><td>モリアファインはさみ</td><td>FST</td><td>14370-22</td><td></td></tr><tr><td>5mlポリスチレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ付き(35 & マイクロ;mナイロンメッシュ)</td><td>ファルコン</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Puralube獣医軟膏、滅菌眼潤滑剤</td><td>Dechra</td><td>12920060</td><td></td></tr><tr><td>リング鉗子(鈍的組織鉗子)</td><td>FST</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Roboz Surgical 4-0シルクブラック編組、100 YD</td><td>FisherScientific</td><td>NC9452680</td><td></td></tr><tr><td>Semken鉗子(解剖学的鉗子)</td><td>FST</td><td>1108-13</td><td></td></tr><tr><td>Sofsilk非吸収性コーティングブラック縫合糸編組シルクサイズ3-0、18 "、針19mm長さ3/8円逆切断&nbsp;</td><td>HenrySchein</td><td>SS694</td><td></td></tr><tr><td>学生用ファインフォーセプス、角度付き</td><td>FST</td><td>91110-10</td><td></td></tr><tr><td>10mlシリンジPP / PE針なし</td>ミリ<td>ポアシグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>Z248029</tr><tr><td>96ウェル細胞培養プレート</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>げっ歯類用黄色の栄養チューブ 20G x 30 mm</td><td>Instech</td><td>FTP-20-30</td><td></td></tr><tr><td>Solutions and Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accugene 0.5M EDTA</td><td>Lonza</td><td>51201</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td><td>BioWhittaker</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液</td><td>Corning</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 カルシウムおよびマグネシウムなし</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G 抗体 (1A8)</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>CD11b モノクローナル抗体, PE, eBioscience (M1/70)</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>Dithiotreitol</td><td>FisherScientific</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td><td>R&D Systems</td><td>511550</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン イソチオシアネート-デキストラン、平均分子量 4.000</td><td>Σ</td><td>60842-46-8</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ハロカーボン</td><td>12164-002-25</td><td></td></tr><tr><td>ロイコトリエン B4</td><td>Millipore Σ</td><td>71160-24-2</td><td></td></tr><tr><td>PerCP ラット 抗マウス CD45 (30-F11)</td><td>BD Pharmingen</td><td>557235</td><td></td></tr><tr><td>精製ラット抗マウスCD16/CD32(マウスBD FCブロック)</td><td>BD Bioscience</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse IFN-&gamma;</td><td>Peprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス TNF-&alpha;</td><td>ペプロテック</td><td>315-01A</td><td></td></tr></tbody></table>

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

腸粘膜は、単一の上皮細胞層が並び、光細菌や外因性物質の通過を防ぎながら、栄養素や水の超細胞輸送を可能にする動的バリアを形成する。この層の違反は、発光内容物への透過性の増加と免疫細胞の募集をもたらし、どちらも炎症性腸疾患(IBD)を含む腸内の病理学的状態の特徴である。 
多形核好中球(PMN)の上皮バリア機能と経上皮移行(TEpM)を調節するメカニズムは、定量的分析を可能にするインビボ法の実験不足のために不完全に理解されている。ここでは、腸管または近位結腸の外形化された腸管セグメントを採用した堅牢なマウス実験モデルについて説明する。外装された腸ループ(iLoop)は完全に血管化され、上皮細胞単層間の透過性およびPMNの移動を研究するために一般的に使用されるex vivoチャンバーベースのアプローチよりも生理学的な利点を提供する。
我々は、このモデルの2つの用途を詳細に示す:(1)内環注入後の血清中の蛍光標識デックストランスの検出による腸透過性の定量測定、(2)化学誘引剤の侵入導入後に腸上皮を越えて腸内腔に移行したPMNの定量的評価。我々は、このモデルの実現可能性を実証し、コントロールと比較して上皮タイト接合関連タンパク質JAM-Aを欠くマウスにおけるiLoopを利用した結果を提供する。JAM-Aは、炎症反応中に上皮バリア機能とPMN TEpMを調節することが示されている。iLoopを用いた我々の結果は、これまでの研究を裏付け、恒常性および疾患の間に腸透過性およびPMN TEpM in vivoの調節におけるJAM-Aの重要性を強調する。 
iLoopモデルは、腸内恒常性および炎症の研究において再現性の高い標準化された方法を提供し、IBDなどの疾患における腸バリア機能および粘膜炎症の理解を著しく高める。

イレラル ループモデルと pcLoop モデルの概略図を図1と図 2にそれぞれ示します。解剖学的写真は、腸管セグメントの外装を含む手順の重要なステップを示す(図1Bおよび図2B)、血液供給の妨害を最小限に抑える結紮の適切な位置の同定(図1Cおよび図2C)、洗浄後に試薬溶液で満たすことができるiLoopの切り口の結紮(図1Dおよび図2D))。重要なことに、iLoopモデルは、重要な血液供給を維持し、F...

調節不整合な腸上皮バリア機能および免疫応答は、生理学的モデルの欠如のために十分に調査されていない炎症性腸疾患の特徴である。ここでは、生体内での粘膜透過性および白血球の採用を研究するために、十分に血管化され、外装された腸セグメントを採用したマウス腸管ループモデルについて述べている。

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

腸モデルは、腸の漏れや、マウスの腸内での白血球の移動方法を測定するための広く適応可能で生理学的な方法です。この方法は、腸透過性および病理腸炎症の増加の根底にあるメカニズムをよりよく理解するのに役立つ。この技術は、潰瘍性大腸炎およびクローン病に見られるように、腸バリア機能の基礎となるメカニズム、および病理学的炎症を理解するのに役立つ。このモデルは、マウスにおける腸バリア機能または免疫細胞の形成の検査のために、回腸または近位結腸のいずれかである、十分に血管化された外形化された腸セグメントを採用する。この広範な適用によって、腸ループモデルは漏れがある腸の障壁および炎症性応答から生じる病気の洞察力を提供できる。闘争は、外科的ステップを練習することによって克服することができます。完全に血管化された腸管セグメントを外装し、出血を避けるために結紮のための適切な場所を選択することが非常に重要です。腸ループモデルは、マイクロ外科的手法であり、従って、他の外科手術と同様に、それは、視覚的なデモンストレーションと方法のステップバイステップの提示から大いに利益を得る。麻酔の外科面を達成した後、アルコール綿棒または70%エタノールを浸したガーゼスポンジで腹部中線の毛皮をスクラブすることから始めます。低体温症を防ぐために、アルコールで毛皮の広い範囲を濡らないでください。はさみを使用して、中線の腹腔切多を行います。腹部の真ん中に水平切開を行い、腹膜を露出させ、腹腔内臓器を傷付けないように注意する。露出した腹腔の上にプレカットウェットコットンガーゼを置きます。濡れた綿棒を使用して、セカムを動員して外装し、湿った綿のガーゼの上に慎重に置きます。その後、回腸を動員し、穏やかに外装します。腸間膜血管と血液供給を中断することなく、湿った綿ガーゼに少なくとも6センチメートルの末端回腸を展開します。露出した組織は、常に暖かいHBSSで湿った状態に保ちます。盲腸に近い腸間腸内の回腸を供給する主要な動脈を特定する。次に、重要な血管のない腸間腸内の2つのライゲーション部位を見つける。鈍いティッシュ鉗子で末端の回腸をつかみ、細かい先端鉗子を使用して腸間質をフェンレス化し、血管を避ける。穿穿片を横切ってシルク縫合糸を配置し、外科結び目を結んで最初の結紮を作成します。ルーラーを使用して、最初の合字から 4 センチ離れた位置を測定し、2 番目の合字を作成します。細かいはさみで各ライゲーションの隣に慎重にカットして、4センチメートルの回腸を分離し、血液供給と腸間膜をそのまま維持します。10ミリリットルのシリンジに取り付けられた柔軟な黄色の給餌管を使用して、暖かいHBSSでイレラルループセグメントの内容を静かに洗い流します。手術部位を清潔に保つために、明るい内容物を腹腔から洗い流してください。シルク縫合糸でフラッシュされたイレラルループの2つのカットエンドをリゲートします。30ゲージ針を持つ1ミリリットルの注射器を使用して、FITC-デックストランスやケモカインなどの250マイクロリットルの試薬を腸内腔にゆっくりと注入します。回腸ループが膨張し、粘膜の適度な膨張を引き起こす。逆切断針で、針ホルダー、解剖鉗子、および3.0非吸収性シルク縫合糸を使用して腹壁を閉じます。低体温を防ぐために動物を乾燥させた後、インキュベーション期間の温度調節麻酔室に置く。手術のためにマウスを準備し、前に示したようにセカムを外装します。湿った綿棒を使用して、回腸全体を外装し、湿った綿のガーゼの上に置きます。近位結腸とメソコロンに位置する血液供給を特定します。近位コロンを動員し、セカムから約0.5センチメートル遠位でメソコロンの血管のない領域に最初の合字を作成します。最初の合字から2センチメートルを測定し、メソコロンの血液供給のない領域で2番目の合字を作成します。細かいはさみを使用して、慎重に2センチメートルの長さのpcLoopを分離するために各ライゲーションの隣にカットします。10ミリリットルのシリンジに取り付けられた柔軟な黄色の給餌チューブを使用して、pcLoopを温かいHBSSで静かに洗い流し、便を除去します。手術部位を清潔に保つために、明るい内容物を腹腔から洗い流してください。次に、シルク縫合糸を使用して、フラッシュされたpcLoopの2つのカット端をリゲートします。30ゲージ針を持つ1ミリリットルの注射器を使用して、FITC-dextranやケモカインなどの試薬を腸内腔にゆっくりと200マイクロリットル注入します。pcLoopが膨張し、粘膜の適度な膨張を引き起こす。湿った綿棒を使用して、結紮されたpcLoop、ileum、および盲腸をそっと戻します。逆切断針で、針ホルダー、解剖鉗子、および3.0非吸収性シルク縫合糸を使用して腹壁を閉じます。インキュベーション期間の後、麻酔マウスを安楽死させ、分析のために組織を収集する。腸透過性の評価のためのIループモデルの精度を検証するために、FITC-dextran pcLoopアッセイを実施し、生体内の腸バリア機能の調節における緊密な結合関連タンパク質Jam-aの役割を評価した。pcLoopモデルでは、対照と比較して、FITC-デキストラン血清レベルの2.5倍の増加がジャム-aヌルマウスで定量化されました。同様の結果は、腸上皮細胞上のJam-aの選択的損失を有するマウスで得られた。pcLoopモデルは、多形核好中球(PMN)、腸粘膜への採用およびその後の生体内での経上皮移動を研究するために使用された。pcLoopの発光含有量におけるPMNの数をフローサイトメトリー解析により定量した。近位結腸のセグメントに存在するPMNの数は生理学的条件下で少なかった。手術前に、炎症性サイトカイン、TNFアルファおよびIFN γによる前処理は、pcLoopルーメンに募集されたPMNの増強された数をもたらした。PMNケモ誘引LTB4の投与は、PMN数の劇的な増加につながった。大腸粘膜におけるPMNの免疫ヒストレカル染色は、サイトカインおよびLTB4による刺激後のPMNの上昇の募集を裏付ける。PMN経上皮移動に対するジャム-aの寄与を、腸上皮細胞上のJam-aの選択的喪失を有するマウス上のpcLoopモデルを用いて検討した。上皮ジャムaの喪失は、ゴミ捨て制御と比較して大腸内腔中の転生PMNの数を減少させた。この技術の重要な側面は、手術を行うときに外装された腸管セグメントへの血液供給を維持することを忘れさせておいてください。このプロトコルに従って、腸透過性アッセイや好中球性経上皮移行アッセイなどの他の方法を行い、生体内のバリア完全性および腸炎症の喪失を調査することができる。

functional-assessment-intestinal-permeability-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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このビデオでは、マウスモデルで腸の透過性を研究するための回腸ループモデルの生成を示しています。この方法は、上皮バリア機能とそれに伴う免疫応答を理解するためのライブモデルを提供します。...

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フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランを用いたマウスの腸バリア完全性の評価

学ぶ 標準化腸ループモデルを用いてマウスの腸透過性と好中球経上皮移動を定量的に評価する方法。JAM-Aタンパク質の役割を解明し、炎症性腸疾患の病態メカニズムを生理学的条件下で研究する強力なツールです。

標準化腸ループモデルを用いたマウスにおける腸透過性と好中球経上皮移動の機能評価

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