Name: 精巣上体白色脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶ精巣上体白色脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植法で、生体結合剤や縫合を不要とし、腹腔内に移植した膵島を検出可能にします。技術的に容易に再現でき、糖尿病治療やがんモデル作成など様々な疾患研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究は、文部科学省科学研究費補助金基盤研究(C)(19K09839, NS)の助成を受けて行われました。

次の手順は、3 つの手順で実行されます。第1段階は、レシピエントマウスにおける糖尿病の誘導およびドナー膵島の単離を含む。第二段階は移植前の膵島の準備を含みます。第3工程では、精巣上体脂肪組織への膵島移植と、脂肪組織を用いた膵島の被覆を行う。その後、治療効果を評価した。本研究で実施したマウスの取り扱いおよび実験手順は、「実験動物管理の原則」(実験動物の管理と使用に関するガイド、国立衛生研究所発行第8版、2011年)に準拠しており、実験プロトコルは福岡大学動物管理使用委員会によって承認されました(承認番号: 186018).
1.手術の準備
<ol><li>糖尿病の誘発:0.1Mクエン酸緩衝液(180 mg / kg体重)に調製した18 mg / mLストレプトトシン溶液を静脈内注射することにより、体重20〜25 g、8〜12週齢のレシピエントオスマウスに糖尿病を誘発します。.血糖値が400 mg / dLを超えるマウスは糖尿病と見なされます。糖尿病誘発後1週間以内に膵島を覆うために精巣上体白色脂肪組織の過度の萎縮の前に糖尿病マウスを使用する。</li>
	<li>膵島分離:後藤の膵島分離法27 に従って、移植の1日前にマウス膵島分離を行います。</li>
	<li>簡単に説明すると、コラゲナーゼ溶液を用いて膵臓組織を消化する。適切な細胞分離溶液を用いた密度勾配遠心分離により膵島を単離する。その後、22°Cおよび5%CO2のインキュベーター内で膵島を一晩培養した(<37°Cでの培養は膵島死を予防することが報告されている28、29、30、31)。 注意: 精製された膵島培養物は安全キャビネットで取り扱ってください。膵島の分離と培養に使用するすべての溶液を0.22 μmのフィルターを使用してフィルター滅菌します。</li>
</ol>2.移植用膵島の準備
<ol><li>図1Aに示すように、適切な機器と材料を収集します。</li>
	<li>アミラーゼやリパーゼなどの消化酵素は、単離および移植された膵島に損傷を与える可能性があり、培養皿内の汚染された線維組織に閉じ込められることで膵島が失われる可能性があるため、移植前に、鉗子を使用して、腺房組織や線維組織を含む膵臓から余分な膵島成分を手で摘み取ります(図1B)。 解剖顕微鏡下。ピッキング後、セルストレーナーを使用して単一の腺房細胞をろ過します。</li>
	<li>ろ過した膵島を、プラスチックへの膵島付着を防ぐためにウシ血清またはアルブミンを添加した適切な培地または緩衝液(低グルコースを含むDMEM、RPMI1640、CMRL1066、またはHBSSなど)を含む新しい培養皿に移し、皿を旋回させて膵島を皿の中央に配置します(図1C)。P200マイクロピペットと顕微鏡を使用して、個々の膵島を適切な収集チューブにピックします(図1D)。</li>
	<li>新しい40 μmのセルストレーナーを50 mLプラスチックチューブの上に置き(図1E左と中央)、フィルターを新しい培地で洗浄します(図1E右)。</li>
	<li>1000 μLのピペットを使用して膵島をストレーナーに加え、膵島と単一の腺房細胞を分離します(図1 F1および図1F2)。 注:セルストレーナーの精製された膵島は、約100%純粋です。</li>
	<li>鉗子を使用して、培養培地またはウシ血清またはアルブミンを添加した適切な緩衝液を含む新しい60mmまたは100mmサイズの未処理培養皿でストレーナーを反転させます(図1 F3および図1F4)。新鮮な培地/バッファーを使用して、膵島を新しい培養皿に洗い流します。次に、約20 mLの総容量に達するのに十分な培地/バッファーを培養皿に追加します。</li>
	<li>顕微鏡下で膵島を数え、ドナー動物の数に応じて、個々の1.5 mLプラスチック遠心チューブ間で膵島の数を均等に分割します(図1G)。例えば、2匹のマウスからの200個の100〜200μmの膵島当量(IEQ)が2本のチューブのそれぞれに追加されます。</li>
	<li>膵島を室温で1分以内に2,100 x gで遠心分離し、上清を廃棄します。通常、約20〜30μLの残留溶液がチューブ内に残ります(図1H)。</li>
</ol>3.精巣上体脂肪組織への膵島移植と精巣上体白色脂肪組織による被覆
<ol><li>手術の前に、小動物用の麻酔器、実体顕微鏡、光源、200 μLのマイクロピペットチップを備えた50-200 μLのマイクロピペット、綿棒、4-0縫合セット、および消毒された手術器具を収集します(図2A)。クーパーはさみ、眼科用はさみ、ピーン鉗子、ピンセット、および針ホルダーをオートクレーブします。オートクレーブ処理後、装置を1%ポビドンヨード溶液に浸します(図2A)。精巣上体の白色脂肪組織の動員および出血の場合の止血のために綿棒を使用してください。膵島移植には、50〜200μLのチップが付いたマイクロピペットを使用してください。</li>
	<li>吸入麻酔薬(酸素中の2%イソフルラン)を使用して糖尿病レシピエントマウスに麻酔を送達する。眼科用潤滑剤を両眼に塗布し、乾燥を防ぎます。次に、マウスを仰臥位に置き(図2B左)、バリカンや脱毛クリームを使用して感染を防ぐために腹部から毛を取り除きます。少なくとも3ラウンドのポビドンヨード溶液とそれに続く70%エタノールを交互に使用して、腹部と鼠径部を消毒します(図2B右)。手術の前に、つま先のピンチ反射がないことで麻酔の深さを確認します。加熱パッドを使用して術中の熱サポートを提供し、外科用ドレープを使用して無菌手術領域を固定します。</li>
	<li>中央下部の皮膚を切開します(図2C左)。長さ約2cmの皮膚切開をお勧めします。Pean鉗子(非外傷性鉗子または開創器も使用できます)で左腹壁をクランプし、組織をマウスの左側に引っ張って手術野を固定します(図2C右)。開腹後、麻酔維持のためにイソフルランの割合を1.0〜1.5%に減らす。</li>
	<li>綿棒を使用して、小腸と大腸をマウスの右側(つまり、オペレーターの左側)に動員します。腹腔内の左精巣上体白色脂肪組織は左鼠径部に位置する。精巣上体の白色脂肪組織と左精巣を腹部の外側に動員し(図2D左)、組織を伸ばします(2D右)。</li>
	<li>200 μLのピペットチップを備えたP200マイクロピペットを使用して、採取時にチューブ内に膵島が残らないように注意しながら、穏やかなピペットで1.5 mLチューブから膵島の全容量を採取します(図2E左)。採取した膵島を重力によってピペットの先端に沈降させます(図2E右)。</li>
	<li>マイクロピペットチップを膨張した脂肪組織に軽く置きます。先端の培地/バッファーが過度に洗い流されないように注意しながら、膵島を組織に慎重に播種します(図2F左)。播種後、解剖顕微鏡で膵島の正しい配置を確認します(図2F右)。</li>
	<li>精巣上体の白色脂肪組織で膵島を覆います(図2G)。縫合糸または生体結合剤の使用は必要ありません。</li>
	<li>左精巣を精巣上体の白色脂肪組織の下に置き、組織を腹腔に戻します(図2H)。4-0縫合糸を使用して、皮膚を2層(腹膜、次に筋肉、皮膚)で閉じます(ナイロンや吸収性縫合糸などの任意の縫合糸を使用できます)(図2I)。アセチルサリチル酸を注射します(300 mg / kg;SQ)術後鎮痛のための創傷の近く。次に、マウスをヒートランプの下に置き、完全に回復するまで監視します。</li>
</ol>4. 膵島移植後のモニタリング(概要)
<ol><li>血糖値、耐糖能試験、および術後(POD)の組織学的評価を監視することにより、膵島移植の治療効果を評価します28。<ol><li>血糖値をモニターし、耐糖能試験での血糖値の測定を含めて、小型のグルコースメーターを使用する。</li>
		<li>尾静脈から血液サンプル(数マイクロリットル)を収集します。組織学的評価では、免疫組織化学により回収した精巣上体脂肪組織の移植膵島からマウスインスリン(生着膵島検出用)とフォンビルブランド因子(血管検出用、膵島生着の証拠)を検出した。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Barton, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+outcomes+of+clinical+islet+transplantation%3A+1999-2010%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010.</a> Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).</li>
<li>Balamurugan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+product+characteristics+and+factors+related+to+successful+human+islet+transplantation+from+the+Collaborative+Islet+Transplant+Registry+%28CITR%29+1999-2010%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010.</a> American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).</li>
<li>Collaborative Islet Transplant Registry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Collaborative+Islet+Transplant+Registry.+Annual+Report%22">Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report</a>. , (2017).</li>
<li>Rajab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+Pancreatectomy+and+Islet+Autotransplantation+Following+Treated+Hepatitis+C+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection.</a> Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).</li>
<li>Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renal+subcapsular+site+offers+better+growth+conditions+for+transplanted+mouse+pancreatic+islet+cells+than+the+liver+or+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen.</a> Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).</li>
<li>Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+deterioration+of+endocrine+function+after+intraportal+but+not+kidney+subcapsular+rat+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation.</a> Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).</li>
<li>Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+site+for+islet+transplantation--a+peritoneal-omental+pouch%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch.</a> Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).</li>
<li>Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+metabolic+function+of+syngeneic+rat+islet+grafts+transplanted+in+the+omental+pouch%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Survival and metabolic function of syngeneic rat islet grafts transplanted in the omental pouch.</a> American Journal of Transplantation. 3 (3), 281-285 (2003).</li>
<li>Kasoju, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+a+pre-vascularized+pouch+for+subsequent+islet+transplantation+using+VEGF-loaded+polylactide+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Bioengineering a pre-vascularized pouch for subsequent islet transplantation using VEGF-loaded polylactide capsules.</a> Biomaterials Science. 8 (2), 631-647 (2020).</li>
<li>Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+Adipose+Tissue+as+a+Site+for+Islet+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantology%22%5BJournal%5D)">White Adipose Tissue as a Site for Islet Transplantation.</a> Transplantology. 1 (2), 55-70 (2020).</li>
<li>Osama Gaber, A., Chamsuddin, A., Fraga, D., Fisher, J., Lo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+independence+achieved+using+the+transmesenteric+approach+to+the+portal+vein+for+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Insulin independence achieved using the transmesenteric approach to the portal vein for islet transplantation.</a> Transplantation. 77 (2), 309-311 (2004).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+of+endoscopic+biopsy+of+islet+allografts+transplanted+into+the+gastric+submucosal+space+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Technique of endoscopic biopsy of islet allografts transplanted into the gastric submucosal space in pigs.</a> Cell Transplantation. 22 (12), 2335-2344 (2013).</li>
<li>Sakata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+clinical+setting+in+intramuscular+and+subcutaneous+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2FMetabolism+Research+and+Reviews%22%5BJournal%5D)">Strategy for clinical setting in intramuscular and subcutaneous islet transplantation.</a> Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 30 (1), 1-10 (2014).</li>
<li>Cantarelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplant+Site+Influences+the+Immune+Response+After+Islet+Transplantation%3A+Bone+Marrow+Versus+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transplant Site Influences the Immune Response After Islet Transplantation: Bone Marrow Versus Liver.</a> Transplantation. 101 (5), 1046-1055 (2017).</li>
<li>White, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+risks+of+total+pancreatectomy+and+splenic+islet+autotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation.</a> Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).</li>
<li>Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spleen+Is+an+Ideal+Site+for+Inducing+Transplanted+Islet+Graft+Expansion+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice.</a> PLoS One. 12 (1), 0170899(2017).</li>
<li>Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spleen+as+an+Optimal+Site+for+Islet+Transplantation+and+a+Source+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).</li>
<li>Sakata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+rat-to-mouse+bioartificial+pancreas+xenotransplantation+on+diabetic+renal+damage+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival.</a> Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).</li>
<li>Nagaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+bioengineered+islet+cell+sheets+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus.</a> Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).</li>
<li>Weaver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+hydrogel+enhances+islet+survival%2C+engraftment%2C+and+function+in+leading+extrahepatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites.</a> Science Advances. 3 (6), 1700184(2017).</li>
<li>Dufour, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ectopic+site+for+islet+transplantation%2C+using+biodegradable+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds.</a> Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epididymal+fat+pad+as+a+transplant+site+for+minimal+islet+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass.</a> Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).</li>
<li>Sakata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Transplanted+Islet+Engraftment+in+Visceral+White+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue.</a> Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).</li>
<li>Navarro-Requena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+hydrogel+containing+calcium-releasing+particles+and+mesenchymal+stromal+cells+promote+vessel+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation.</a> Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).</li>
<li>Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+bio-synthetic+hydrogel+for+enhancement+of+pancreatic+islet+engraftment+and+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes.</a> Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).</li>
<li>Manzoli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoisolation+of+murine+islet+allografts+in+vascularized+sites+through+conformal+coating+with+polyethylene+glycol%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol.</a> American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).</li>
<li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li>
<li>Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival%2C+morphology+and+in+vitro+function+of+isolated+pig+islets+under+different+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Long-term survival, morphology and in vitro function of isolated pig islets under different culture conditions.</a> Transplantation. 67 (12), 1533-1541 (1999).</li>
<li>Noguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+preservation+of+isolated+islets+is+superior+to+conventional+islet+culture+before+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Low-temperature preservation of isolated islets is superior to conventional islet culture before islet transplantation.</a> Transplantation. 89 (1), 47-54 (2010).</li>
<li>Itoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+temperature+condition+prevents+hypoxia-induced+islet+cell+damage+and+HMGB1+release+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Low temperature condition prevents hypoxia-induced islet cell damage and HMGB1 release in a mouse model.</a> Cell Transplantation. 21 (7), 1361-1370 (2012).</li>
<li>Komatsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Temperature+and+Oxygen+Supports+Long-term+Culture+of+Human+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimizing Temperature and Oxygen Supports Long-term Culture of Human Islets.</a> Transplantation. 103 (2), 299-306 (2019).</li>
<li>Unger, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+overload+and+overflow%3A+metabolic+trauma+and+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology%2C+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome.</a> Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).</li>
<li>Mao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macroporous+heparin-releasing+silk+fibroin+scaffold+improves+islet+transplantation+outcome+by+promoting+islet+revascularisation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival.</a> Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).</li>
<li>Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-supported+Transplantation+of+Islets+in+the+Epididymal+Fat+Pad+of+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e54995(2017).</li>
<li>Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bilaminated+decellularized+scaffold+for+islet+transplantation%3A+Structure%2C+properties+and+functions+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice.</a> Biomaterials. 138, 80-90 (2017).</li>
<li>Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mold-casted+non-degradable%2C+islet+macro-encapsulating+hydrogel+devices+for+restoration+of+normoglycemia+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).</li>
</ol>

利益相反はありません。

脂肪で覆われた膵島移植法は、腹腔内膵島移植と脂肪内組織膵島移植の2つの異なる移植技術の技術を取り入れています。精巣上体白色脂肪組織の表面膜は腹膜で覆われ、精巣上体に付着している白色脂肪組織であると考えられることから、脂肪で覆われた膵島移植法は腹腔内膵島移植の一種として解剖学的に分類することができる。しかしながら、膵島がレシピエント動物に送達される技術は、脂肪内組織膵島移植において利用されるものとより類似している。我々のデータは、脂肪で覆われた膵島移植法の治療効果が腹腔内膵島移植の治療効果よりも優れていることを示しています。また、本手法の移植効果は、移植効果が最も高い膵島移植法である腎嚢下膵島移植とほぼ同等であることが示された23。この方法の有用性は、白色脂肪組織およびアディポサイトカイン内に存在し、膵島生着に寄与すると考えられている接着分子に起因する可能性があると推測されています10,23。
精巣上体白色脂肪組織の大き...

膵島移植は、重度の糖尿病患者に対する細胞補充療法です。最近の報告によると、移植後3年後のインスリン非依存性の割合は最大44%1に改善し、 合計60万を超える膵島を投与されたレシピエントの約80%がインスリン非依存性を達成しています2。さらに、最新の共同膵島移植レジストリレポートでは、膵島移植のみを受けた患者の70%以上で、空腹時血糖値が5年間にわたって60〜140 mg / dLに維持されていることが明らかになりました。この研究では、膵島移植単独または腎臓移植後に膵島移植を受けた患者の約90%が、5年以上にわたって重度の低血糖イベントを発症しなかったことも判明しました3。
この治療の臨床成績は改善していますが、最適な移植部位を確立する必要性など、いくつかの制限に対処する必要があります。肝臓は、大量の膵島を収容できる最大の臓器であるため、臨床膵島移植の典型的な移植部位です。ただし、一部の患者では、肝臓が利用できないため(例:.、門脈圧亢進症、肝炎、および/または肝硬変4)、したがって、腎嚢下腔5,6、大網袋7,8,9,10、腸間膜11、胃腸管12、骨格筋13、皮下組織13、骨髄14、および脾臓15を含む他の部位,16,17は、代替移植部位として考えられている。
局所麻酔下で腹腔内移植が容易に行えるため、腹腔内腔は臨床膵島移植の魅力部位であるが、移植時には膵島が腹腔全体に分散するため、膵島生着の検出や生着確認の成功が困難である。したがって、腹腔内腔は理想的な臨床移植部位として広く認識されていません。代わりに、移植されたカプセル化された18 およびバイオエンジニアリングされた膵島19の有効性を調査するための前臨床試験の対照モデルとして頻繁に利用される。しかし、バイオエンジニアリングされた膵島と対照膵島の正確な比較は、正確な生着評価を行う上での課題のために達成することは困難です。
対照的に、大網ポーチ8、腸間膜、およびその他の肝外位置における腹腔内白色脂肪組織の使用は十分に報告されており10、20、21、22、23、および白色脂肪組織を使用して移植されたバイオエンジニアリングされた膵島の機能を調査する多くの研究は、有望な治療結果を報告することができました20、24、25、26.精巣上体脂肪組織を用いることで移植膵島の検出が容易になるため、腹腔内移植の限界を克服するために精巣上体脂肪組織を利用した「脂肪被覆膵島移植法」が開発されました。本稿では、精巣上体脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植について述べる。

<table><tbody><tr><td>4-0 ナイロン</td><td>アルフレッサ</td><td>ER2004NA45-KF2</td><td>閉鎖腹部</td></tr><tr><td>アレクサ 488-標識ロバ 抗モルモット</td><td>ジャクソン イムノットリサーチ</td><td>706-546-148</td><td>インスリン抗体の二次抗体</td></tr><tr><td>アレクサ 647-標識ロバ 抗ウサギ</td><td>ジャクソン イムノリサーチ</td><td>711-606-152</td><td>フォン・ヴィレブランド因子抗体</td></tr><tr><td>DMEM、低グルコース、ピルビン酸</td><td>二次抗体サーモフィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ック<td>11885084 膵島培養、移植膵島</td></tr><tr><td>エオシン</td><td>富士フイルム 和光ケミカルズ</td><td>051-06515</td><td>エオシンによる組織染色に使用</td></tr><tr><td>エッペンドルフ セーフロックチューブ 1.5mL</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td>30120086</td><td>収集膵島&nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL コニカル遠心分離チューブ</td><td>Corning</td><td>352095</td><td>Collecting islets</td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro;m セルストレーナー</td><td>ファルコン</td><td>352340</td><td>膵島を他の膵臓組織から分離するために使用</td></tr><tr><td>ファルコン 50mL コニカル遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>352070</td><td>過剰な培地/緩衝</td></tr>液の廃棄 <tr><td>モルモット 抗インスリン</td><td>アジレント・テクノロジーズ・ジャパン株式会社 (Dako)</td><td>IR002</td><td>マウスインスリン用一次抗体</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>武藤純薬(株)</td><td>30002</td><td>ヘマトキシリン</td></tr><tr><td>イソジン溶液10%</td><td>塩野義製薬(株)</td>による組織染色に使用<td>カタログ番号なし</td> 消毒<td>用イ</td></tr><tr><td>ソフルラン</td><td>富士フイルム 和光ケミカル</td>ズ <td>095-06573</td><td>麻酔用</td></tr><tr><td>使用 Labcon 1000 & micro;L ZapSilkの低保持のピペット先端</td><td>Labcon</td><td>1177-965-008</td><td>他の膵臓のティッシュからの膵島を分離するために使用</td></tr><tr><td>Labcon 200 &micro;L ZapSilk ローリテンションピペットチップ</td><td>Labcon</td><td>1179-965-008</td><td>膵島を精巣上体白色脂肪組織に播種するために使用</td></tr><tr><td>Mintsensor</td><td>三和化学研究所</td> <td>8AEB02E</td><td>血糖値モニタリングに使用</td></tr><tr><td>ピペットマン P-1000</td><td>ギルソン</td><td>F123602</td><td>他の膵臓組織から膵島を分離するために使用</td></tr><tr><td>ピペットマン P-200</td><td>ギルソン</td><td>F123601</td><td>精巣上体白色脂肪組織への膵島播種に使用</td></tr><tr><td>ウサギ抗vWF</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td>マウスフォンヴィレブランド因子の一次抗体</td></tr></tbody></table>

精巣上体白色脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植

Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

膵島移植は、重度の糖尿病の細胞補充療法です。腹腔内腔は、典型的には、この手順の移植部位である。しかし、腹腔内膵島移植には、移植効果が低い、移植片の検出能力が難しい、移植後分析のための移植片切除能力の欠如など、いくつかの制限があります。本論文では、精巣上体の白色脂肪組織を利用した腹腔内膵島移植法「脂肪で覆われた膵島移植」を用いて、バイオエンジニアリングされた膵島の治療効果を評価します。この方法の単純さは、精巣上体の白色脂肪組織に膵島を播種し、その組織を使用して膵島を覆うことにあります。この方法は腹腔内膵島移植技術に分類できるが、脂肪内組織膵島移植と特徴がある。脂肪で覆われた膵島移植法は、脂肪内組織膵島移植よりも強力な治療効果を示しますが、血糖値と血漿インスリン値の改善、移植片除去の可能性などが含まれます。白色脂肪組織への膵島生着のメカニズムとバイオエンジニアリングされた膵島の治療効果を評価するために、この方法の採用をお勧めします。

脂肪で覆われた膵島移植と腹腔内膵島移植後の移植効果を比較するために、対照レシピエント糖尿病動物の左傍結腸腔の腹膜に同数の膵島を移植した。脂肪で覆われた膵島移植マウスの血糖値は、腹腔内膵島移植マウスと比較して徐々に有意に低下することが観察されました(p = 0.0023; 図3A)。移植後1ヶ月で、脂肪で覆われた膵島移植マウスの血糖値は、腹腔内ブドウ糖負荷試験によって評価された腹腔内膵島移植マウスで観察されたものよりも低いレベルに維持されました(p = 0.0046; 図3B)。さらに、以前に報告したように、脂肪で覆われた膵島移植後に血漿インスリンレベルも改善したことを報告しました。血糖値の再上昇も確認された。これらのデータは、200個のIEQを使用した腹腔内脂肪で覆われた膵島移植がレシピエントマウスの糖尿病状態を大幅に改善できることを示しています。
精巣上体白色脂肪組織への膵島生着を評価するために組織学的検査も行った。脂肪で覆われた膵島移植レシピエント動物では、ヘ...

この脂肪で覆われた膵島移植法は、腹腔内に生着した膵島の検出に適しています。特に、それは生体結合剤の使用または縫合を必要としない。

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...

このプロトコルは、白色脂肪組織への膵島生着のメカニズムを評価することを可能にする。この脂肪で覆われた膵島移植法の主な利点は、技術的に複製が容易であることです。この方法は、他の疾患モデルにも適用することができる。例えば、癌のマウスモデルを作成するために使用することができる。手順のデモンストレーションは、福岡大学の坂田直明准教授です。解剖顕微鏡下で、P 200マイクロピペットを使用して、腺房組織や線維組織を含む膵臓消化物から余分な膵島成分を除去します。次に、セルストレーナーを使用して、単一の腺房細胞をろ過します。ろ過した膵島を、ウシ血清またはアルブミンを添加した適切な培養液または緩衝液を含む新しい培養皿に移し、皿を旋回させて膵島を中央に配置します。P 200マイクロピペットを使用して、個々の膵島を適切な収集チューブにピッキングします。新しい40マイクロメートルのセルストレーナーを50ミリリットルのプラスチックチューブの上に置きます。1000マイクロリットルのピペットを使用して膵島をストレーナーに追加し、膵島と単一の腺房細胞を分離します。鉗子を使用して、ウシ血清またはアルブミンを添加した培養培地または適切な緩衝液を含む新しい60または100ミリリットルサイズの未処理培養皿にストレーナーを反転させます。新鮮な培地またはバッファーを使用して膵島を新しい培養皿に洗い流し、次に培養皿に十分な培地または緩衝液を加えて、総容量が約20ミリリットルになるようにします。顕微鏡下で膵島を数え、ドナー動物の数に応じて、個々の1.5ミリリットルのプラスチック遠心管間で膵島の数を均等に分割します。膵島を2, 100 Gで室温で1分間遠心分離し、上清を廃棄します。通常、約20〜30マイクロリットルの残留溶液がチューブに残ります。感染を防ぐために腹部から毛を取り除いた後、マウスを仰臥位に置きます。腹部と鼠径部を消毒した後、中央下部の皮膚を切開し、長さ約2センチの皮膚切開を行います。左腹壁を鉗子または開創器で固定し、組織をマウスの左側に引っ張って手術野を固定します。綿棒を使用して、小腸と大腸をマウスの右側に動員します。腹腔内の左表皮白色脂肪組織は左鼠径部に位置する。表皮の白い脂肪組織と左の精巣を腹部の外側に動員し、組織を伸ばします。P 200マイクロピペットを使用して、1.5ミリリットルのチューブから膵島の全容量を採取し、採取時にチューブ内に膵島が残らないように注意します。集めた膵島を重力によってピペットの先端に沈降させます。マイクロピペットチップを膨張した脂肪組織に軽く置き、チップ内の培地またはバッファーが過度に洗い流されないように注意します。膵島を組織に慎重に播種します。播種後、解剖顕微鏡で膵島の正しい配置を確認します。膵島を表皮白色脂肪組織で覆い、次に左精巣を上体白色脂肪組織の下に置き、組織を腹腔内腔に戻す。4-o縫合糸を使用して皮膚を2層に閉じます。終了したら、マウスをヒートランプの下に置き、完全に回復するまで監視します。脂肪で覆われた膵島移植と腹腔内膵島移植後の移植効果を比較するため、対照レシピエント糖尿病動物の左傍結腸腔の腹膜に同数の膵島を移植した。脂肪で覆われた膵島移植マウスの血糖値は、腹腔内膵島移植マウスと比較して徐々に有意に低下することが観察された。腹腔内ブドウ糖負荷試験は移植後1ヶ月で行った。脂肪で覆われた膵島移植マウスの血糖値は、腹腔内膵島移植マウスで観察されたものよりも低いレベルに維持されました。組織学的検査は、表皮白色脂肪組織への膵島生着を評価するために使用されました。脂肪で覆われた膵島移植レシピエント動物において、ヘマトキシリン始新世染色により、表皮白色脂肪組織内に膵島の存在が明らかになった。さらに、インスリン陽性膵島の蛍光標識抗体染色は、すべてのレシピエントマウスの表皮白色脂肪組織内のフォンビルブランド因子陽性微小血管の検出を容易にした。この手順を成功させるには、膵島がピペットの先端に完全に定着し、こぼさずに脂肪組織に播種してください。

fat-covered-islet-transplantation-using-epididymal-white-adipose

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

我々のプロトコルは、きれいに、簡単にマウスの腎被膜下膵島または細胞を提供するために開発されました。細胞は、腎臓の被膜下に細胞を移植に使用される最終的なチューブのペレットに集中している。このテクニックの使いやすさは、細胞とマウスへのストレスを軽減。...

糖尿病マウスの腎臓のカプセルに膵島の移植

分離された膵島の移植は1型糖尿病の治療薬であることが提案されている。ここでは、マウスの膵臓から膵島を分離し、腎臓の被膜下のスペースにそれらを移植する方法を説明します。...

マウス膵島の単離と被膜下腎移植のための方法

このプロトコルは、マウス島の単離および脱細胞化された骨格上への播種を実証する。足場支持膵島を、ストレプトゾトシン（STZ）誘発糖尿病マウスの精巣上体脂肪パッドに移植した。島は移植部位で生存し、高血糖状態を逆転させた。...

糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植

大網移植マウスの島のための方法を紹介します。膵島は、ハイドロゲルと混合され、混合物は糖尿病マウスの大網のポーチに配置されます。血糖値を監視し、免疫組織化学的解析を行っています。...

マウスで大網に膵島移植法

マウス モデルにおける膵島の門脈内移植

ここでは、ハイドロゲルを用いた細胞療法、膵島移植の例の生体内での検証のためのプロトコルを提案する.h 大網マトリックス アイレット (ホーミング)...

内大網膵島移植を用いた h 大網マトリックス アイレット充填 (ホーミング)

このプロトコルでは、マウスの小口分離および、皮下白色脂肪組織への移植の方法が記載されている。単離された同系マウス島は、基質膜ヒドロゲルを用いてマウスレシピエントに移植される。レシピエントの血糖値をモニターし、そして、血小移植片のヒストロジー分析を行う。...

マウス島の口内皮下白色脂肪組織(ISWAT)移植モデル

ここでは、マウスにおける門脈内膵島移植(臨床的には関連性はあるが技術的に困難な外科的処置)を成功裏に実施するための洗練された外科的処置を提示する。...

マウスの肝内膵島移植中の注入後門脈静脈出血の最小化

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

組織工学心臓弁における新組織形成および狭窄の開発の基礎となる細胞および分子メカニズムを理解するためには、異所性心臓弁移植のマウスモデルを開発した。肺動脈心臓弁は異所心臓移植技術を用いてレシピエントに移植した。...

異心臓移植のマウスモデルを用いた肺動脈弁の移植

学ぶ精巣上体白色脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植法で、生体結合剤や縫合を不要とし、腹腔内に移植した膵島を検出可能にします。技術的に容易に再現でき、糖尿病治療やがんモデル作成など様々な疾患研究に応用できます。

精巣上体白色脂肪組織を用いた脂肪被覆膵島移植

さらに動画を探す