Name: オゾンとLPS誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: 学ぶマウス急性肺損傷モデルにおけるオゾンとLPS誘発の肺細胞適応機構。好中球を中心とした細胞死と免疫応答の変化を蛍光顕微鏡法で解析し、炎症修復メカニズムを解明する方法です。

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実施された研究は、大統領のNSERC助成金とシルビア・フェドーク・カナダ原子力イノベーションセンターからのスタートアップ資金によって資金提供されています。シルビア・フェドールク・カナダ原子力イノベーションセンターは、イノベーション・サスカチュワン州が資金を提供しています。蛍光イメージングは、NSERCが資金を提供するWCVMイメージングセンターで行われました。ジェシカ・ブロコス(MScスチューデント)とマンプリート・カウル(MScスチューデント)は、シルビア・フェドーク・カナディアン・イノベーション・センターのスタートアップ資金によって資金提供されました。

<ol><li>Bhattacharya, J., Matthay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+repair+of+the+alveolar-capillary+barrier+in+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury.</a> Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).</li>
<li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+lung%3A+%22the+first+responders%22%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the lung: "the first responders".</a> Cell Tissue Research. , (2017).</li>
<li>Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+inhibits+acute+lung+injury+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).</li>
<li>Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+9+partially+regulates+lung+inflammation+induced+following+exposure+to+chicken+barn+air%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+Medicine+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).</li>
<li>Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+mediates+the+late+phase+of+neutrophil+recruitment+to+the+lung+in+murine+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).</li>
<li>Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+inhibits+activation+and+migration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils.</a> Cell Tissue Research. , (2013).</li>
<li>Cakmak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+long-term+PM2.5+and+ozone+exposure+and+mortality+in+the+Canadian+Census+Health+and+Environment+Cohort+%28CANCHEC%29%2C+by+spatial+synoptic+classification+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone.</a> Environment International. 111, 200-211 (2018).</li>
<li>Dauchet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+exposure+to+air+pollution%3A+Associations+with+lung+function+and+inflammatory+markers+in+non-smoking%2C+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+International%22%5BJournal%5D)">Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults.</a> Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).</li>
<li>Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+air+pollution+on+emergency+room+visits+for+respiratory+illnesses+in+Montreal%2C+Quebec%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).</li>
<li>Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ozone+on+leukocyte+function+in+exposed+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects.</a> Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).</li>
<li>Rush, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+chronic+exposure+to+air+pollution+and+mortality+in+the+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome.</a> Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).</li>
<li>Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Chronic+Ozone+and+Particulate+Air+Pollution+on+Mortality+in+Patients+With+Sepsis+Across+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States.</a> Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).</li>
<li>Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+ozone+and+asthma+emergency+department+visits+in+Saint+John%2C+New+Brunswick%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada.</a> Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).</li>
<li>Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozone+modifies+the+metabolic+and+endocrine+response+to+glucose%3A+Reproduction+of+effects+with+the+stress+hormone+corticosterone%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).</li>
<li>Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+low-dose+ozone-induced+murine+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury.</a> Physiological Reports. 8 (11), 14463(2020).</li>
<li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+regional+murine+ozone-induced+lung+inflammation+using+%5B18F%5DF-FDG+microPET%2FCT+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging.</a> Scientific Reports. 10 (1), 15699(2020).</li>
<li>Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+responses+to+secondary+endotoxin+challenge+in+rats+exposed+to+pig+barn+air%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+Medicine+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air.</a> Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24(2008).</li>
<li>Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+pulmonary+damage+induced+by+lipopolysaccharide+via+intranasal+instillation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation.</a> Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).</li>
<li>Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+intranasal+instillations+in+mice%3A+effects+of+volume%2C+time%2C+body+position%2C+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).</li>
<li>Aulakh, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+CD34+produces+defects+in+platelets%2C+microparticles%2C+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation.</a> Cell Tissue Research. , (2020).</li>
<li>Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+and+recovery+of+the+alveolar+macrophage+phagocytic+system+during+continuous+exposure+to+0.5+ppm+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Lung+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone.</a> Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).</li>
<li>Yipp, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lung+is+a+Host+Defense+Niche+for+Immediate+Neutrophil-Mediated+Vascular+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection.</a> Science Immunology. 2 (10), (2017).</li>
<li>Lee, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiostatin+regulates+the+expression+of+antiangiogenic+and+proapoptotic+pathways+via+targeted+inhibition+of+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins.</a> Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).</li>
<li>Hawkins, C. L., Davies, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+identification%2C+and+quantification+of+oxidative+protein+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).</li>
<li>Hemming, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Pollutant+Ozone+Causes+Damage+to+Lung+Surfactant+Protein+B+%28SP-B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B).</a> Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).</li>
<li>Oosting, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+surfactant+protein+A+to+ozone+in+vitro+and+in+vivo+impairs+its+interactions+with+alveolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells.</a> American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+necrotic+neutrophils+release+interleukin-16C+and+macrophage+migration+inhibitory+factor+from+stores+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Discovery%22%5BJournal%5D)">Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol.</a> Cell Death & Discovery. 1, 15056(2015).</li>
<li>Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CXCR4+in+Normal+and+Abnormal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development.</a> Cells. 8 (2), (2019).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrapulmonary+manifestations+of+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Extrapulmonary manifestations of COVID-19.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).</li>
<li>Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAulakh%2C+GK+%222017+IEEE+Nuclear+Science+Symposium+and+Medical+Imaging+Conference+%28NSS%2FMIC%29%22">2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC)</a>. , 1-2 (2017).</li>
<li>Aulakh, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+image+x-radiography+for+functional+lung+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple image x-radiography for functional lung imaging.</a> Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009(2018).</li>
</ol>

著者は、利益相反や開示を行う必要はありません。

現在の研究で提示された方法は、肺の炎症中に複数の細胞事象を研究するための複数のコンパートメント分析の有用性を強調する。我々は、その結果を表2にまとめた。私たちおよび多くの研究室は、肺中球の急速な採用によって特徴付けられた鼻内LPS点眼に対するマウス応答を広範囲に研究してきました。そして最近、サブ臨床O3(2時間0.05ppm)単独で、肺血管区画内の好中球の分離によって特徴付けられたC57BL/6NJサブストレイン15に重大な肺損傷を誘発し、BALでは損傷したマクロファージおよび破片が観察され、O3の炎症性の可能性を示す。そのモデルでは、肺胞マクロファージによる肺胞上皮損傷および貪食の結果として、肺胞コンパートメント内の好中球の存在を観察した。O3モデルで細胞外DNAと破片を観察しただけでなく、BALマクロファージは高いIL-16レベルと相関する異形性であり、通常は死にかけている好中球によって放出される警報である。したがって、これらのサブ臨床O3レベ...

急性肺損傷(ALI)は、血液凝固、線維性および自然免疫系の同時活性化によって特徴付けされる感染性または他の有害な刺激に対する肺の重要な病理学的応答である1。好中球は、トール様受容体(TLR)ファミリー2、3、4を介して微生物と細胞内損傷パターンを速やかに感知する。好中球は、前形サイトカインおよび細胞傷害性顆粒内容物を放出し、その後、副次組織損傷を引き起こす可能性がある。続く歯槽の損傷は、アデノシン三リン酸(ATP)5などの分子の放出をもたらす二次細胞死と結婚し、免疫調節不全の悪循環に陥る。
ALIの理解における未解決の問題は、歯槽膜内で傷害がどのように開始されるかという問題に関連する。電子輸送複合体V、F1F0 ATP合成酵素は、炎症時に細胞(内皮、白血球、上皮を含む)の細胞上で、遍在的に発現することが知られているミトコンドリアタンパク質である。アクチンとチューブリンで構成される細胞骨格は、ミトコンドリアタンパク質と同様に、多くの細胞形状および機能調節を収容する。我々は最近、内因性分子によるATP合成酵素の遮断が、アンジオスタチン、無音性好中球の募集、活性化およびリポ多糖(LPS)が肺炎症を誘発したことを示した。したがって、生化学的(ATP合成酵素)と免疫(TLR4)の両方のメカニズムは、肺の炎症時に歯槽バリアを調節する可能性があります。
オゾン(O3)への暴露は、環境汚染物質、肺機能の低下、肺機能の低下、肺感染症への感受性の増大、およびO3曝露の短い低レベルは、基礎となる心呼吸状態7、8、9、10、11、12、13、14の死亡率のリスクを高める。従って、O3の生理学的に関連する濃度への暴露は、炎症7、8の基本的なメカニズムを研究するALIの有意義なモデルを提供する。私たちの研究室は最近、低用量O3誘導ALI15のマウスモデルを確立しました。低O3濃度に対して用量および時間応答を行った後、我々は、2時間の0.05 ppmO3への曝露が、LPSモデルと同様の肺ATPシンターゼ複合体Vサブユニットβ(ATPβ)およびアンジオスタチン発現によって特徴付けられた急性肺損傷を誘発することを観察した。インビタル肺イメージングは肺の損傷を示す肺胞アクチンマイクロフィラメントの解体を明らかにした、 そして、肺胞中隔反応性酸素種(ROS)レベルのアブレーション(ベースライン細胞シグナル伝達の省略を示す)およびミトコンドリア膜電位(急性細胞死を示す)を2時間暴露した後、異種肺18FDG保持16と相関した0.05 ppm O315に曝露し、好中球のリクルートおよびサイトカイン放出、最もILDF-16と16の放出を伴わない。私たちの最近の研究からの持ち帰りメッセージは、O3が人間の暴露のために8時間(1日あたり)にわたって0.063 ppmの許容限界を下回る濃度で暴露されると指数関数的に高い毒性を生み出すということです。重要なことに、これらのサブ臨床O3曝露が細菌内毒素17などによってTLR4媒介機構を調節できるかどうかについては、明確な理解は存在しない。そこで、デュアルヒットO3およびLPS曝露モデルを研究し、免疫および非免疫細胞適応を観察した。
各種肺および全身体区画、すなわち気管支肺胞洗浄液(すなわち、 BAL)肺胞空間をサンプリングするBAL)、肺血管穿孔体(すなわち、LVP)が肺血管構造および肺胞中隔間質を凝視し、内皮障壁が損なわれた場合に、左肺凍結管、ラビン肺組織に残された常駐の腹膜および付着性白血球を調べた。、循環性白血球を表す末梢血および胸骨および大腿骨骨髄は、それぞれ炎症時に造血細胞動員の近位および遠位部位をサンプリングする。

<table><tbody><tr><td>33-plex Bioplex ケモカインパネル</td><td>Biorad</td><td>12002231</td><td></td></tr><tr><td>63X oil (NA 1.4-0.6) 顕微鏡対物レンズ</td><td>Leica</td><td>HCX PL APO CS (11506188)</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 350 抱合ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 抱合ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 抱合ファロイジン</td><td>Invitrogen</td><td>A12370</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 conjugated mouse anti-&alpha; tubulin clone DM1A</td><td>Millipore</td><td>05-829X-555</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21112</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>アルメニアハムスター抗CD61(クローン2C9.G2) IgG1 κ</td><td>BD Pharmingen</td><td>553343</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 J Mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td>64</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>ライ</td><td>カ ライカ TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4&prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>aliquot in 2 & micro;l在庫と-20°Cで保管。C</td></tr><tr><td>倒立型蛍光広視野顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン (ナルケタン)</td><td>ベトキノール</td><td>100 mg/ml</td><td>10 mg/ml 10 mg/ml 希釈して 10 mg/ml ストックにする</td></tr><tr><td>生 (calcein)/死 (Ethidium homodimer-1) 細胞毒性キット</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗 ATP5A1 IgG2b (クローン 7H10BD4F9)</td><td>Invitrogen</td><td>459240</td><td></td></tr><tr><td>マウス抗ATP5&β;IgG2b (clone 3D5AB1)</td><td>Invitrogen</td><td>A-21351</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136)</td><td>Invitrogen</td><td>16-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm protein assay</td><td>Thermoscientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG</td><td>Abcam</td><td>ab2904</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)</td><td>Invitrogen</td><td>14-6093-81</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗Ki-67 (クローン SolA15) IgG2a κ</td><td>Invitrogen</td><td>14-5698-82</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗 Ly6G IgG2a κ (クローン 1A8)</td><td>Invitrogen</td><td>16-9668-82</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗 Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b κ (クローン RB6-8C5)</td><td>Invitrogen</td><td>53-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>ラット抗マウス CD16/CD32 Fc ブロック (クローン 2.4G2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Reduced mitotrackerオレンジ</td><td>Invitrogen</td><td>M7511</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン (ロンプン)</td><td>バイエル</td><td>20 mg/ml 20 mg/ml</td> 2 <td>倍に希釈して 10 mg/ml ストックを作る</td></tr></tbody></table>

オゾンとlps誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

肺は、無菌(粒子または反応性毒素)および感染性(細菌、ウイルスまたは真菌)の炎症状態の形で直接的および間接的な侮辱に絶えず直面している。圧倒的な宿主応答は、呼吸の低下および急性肺損傷をもたらし、これは病理論理的宿主免疫、凝固および組織改修応答の結果として肺好中球の募集によって特徴付けられる。マウス肺の細胞適応を可視化し定量化する敏感な顕微鏡的方法は、低用量(0.05ppm)オゾンに応答して、細菌リポ多糖と組み合わせた強力な環境汚染物質、TLR4アゴニストであり、宿主の炎症および修復メカニズムを理解するために極めて重要である。各種肺および全身体区画、すなわち気管支肺胞洗浄液、肺血管透過液、左肺凍結切片、および胸骨骨髄透過液の包括的な蛍光顕微鏡分析について述べています。我々は、肺胞マクロファージ、好中球、肺の核組織、ならびに骨髄細胞と、分析された区画内の離散ケモカイン勾配によって特徴付けられた遅延(最大36〜72時間)の免疫応答と相関する骨髄細胞の損傷を示す。また、肺外細胞マトリックスおよび細胞細胞細胞骨格相互作用(アクチン、チューブリン)、ミトコンドリアおよび活性酸素種、抗凝固性プラスミノーゲン、抗血管新生ペプチド断片アンジオスタチン、ミトコンドリアATPシンターゼ複合体Vサブユニット、αおよびβを提示する。これらの代理マーカーは、 生体外 細胞ベースのアッセイおよび 生体内 動物イメージング技術(生体内顕微鏡など)を十分に補えば、新しい免疫調節剤に対する肺応答を理解するための重要な情報を提供できる。

O3およびLPS曝露を組み合わせることで、72時間で全身性炎症および骨髄動員が発生する:異なるコンパートメントにおける細胞数は、末梢血の有意な変化を明らかにし、大腿骨骨髄総細胞数はO3およびLPSを合わせた。O3とLPSを合わせた露光は総BAL(図1A)またはLVP(図1B)の細胞数に変化を起こさなかったが、多形核細胞は24(図1F、補足図1)、36及び72時間で主要な細胞型として提示された。24時間BALサイトスピン画像で多形核細胞にSiglec-fおよびCX3CR1染色がないことに注意してください(図1F)。BALサイトスピンのトリプルDAPI/CD11b/Gr1染色は、0hのマク...

オゾンと細菌性内毒素を組み合わせたマウスは、好中球を含む広域細胞死を示す。細胞骨格ラメリポディアの破壊、気管支-肺胞洗浄における複雑なV ATPシンターゼサブユニットβおよびアンジオスタチンの細胞発現の増加、肺免疫応答の抑制および好中球の遅れなど細胞適応を観察した。

オゾンとLPS誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

こんにちは、私の名前はグルプレットです。私たちの研究室では、肺の炎症と修復のメカニズムを調査しています。こんにちは、私の名前はジェシカと私は蛍光顕微鏡法を使用してオゾン誘発ラボラットアルベオリを調査します。こんにちは皆さん、私の名前はマンプリートです。そして、私は動物のイメージング方法で肺の炎症を研究します。肺は、オゾンなどの無菌、細菌性リポ多糖類またはLPSなどの微生物成分に起因する直接的および間接的な侮辱に絶えず直面している。圧倒的な宿主応答は、無秩序な宿主免疫、凝固性、組織改修により、肺好中球の募集によって特徴づけられる呼吸障害および急性肺損傷をもたらす可能性がある。我々は、様々なコンパートメント、すなわち気管支肺胞洗浄液、すなわちBAL、肺血管パーズート、すなわちLVP、左肺クライオ切片、末梢血および胸骨および大腿骨骨髄の包括的な分析を記述する。オゾン暴露の場合、マウスをカスタム誘導ボックスにそっと入れ、マウスを0.05 PPMのオゾンに2時間連続的に曝します。LPS曝露の場合、軽い腹腔内ケタミンとキシラジンミックスの下でマウスを麻酔する。LPS溶液から50マイクロリットルをマウスの外部ナレスに植え付けるようになりました。50マイクロリットルの滅菌生理食塩水を含むマウスを植え付ける。指定された時点で、ケタミンとキシラジンミックスの全用量でマウスを麻酔する。次に、マウスを消毒し、後肢の数字のいずれかをつまむペダル反射をチェックし、四肢の引き込みを観察します。反射なしは深い麻酔を意味しない。今、胸骨の下にカットを行い、心臓を露出します。ヘパリン化された注射器に取り付けられた25本のゲージ針を右心室に入れ、心臓穿刺で血液を引き出す。ヘパリン化された注射器で血液を収集し、さらなる処理のためにマイクロフュージチューブに排水します。ピンセットまたは鈍い鉗子を慎重に使用して、上の組織から気管領域を取り除きます。今、肺を露出させるために肋骨ケージをカットします。気管の下に綿の合字を渡し、当分の間はそのままにしておきます。気管を切り取り、気管切開のために肺からその長さの約3分の1の間隔で配置する。気管に28ゲージのポリエチレンカニューレを挿入します。綿の合字をしっかりと結び、カニューレを所定の位置に保持します。カニューレを折りたたまないで下ろしてください。今徐々に1 mL注射器の助けを借りてカニューレにPBSの0.5 mlを注入します。吸引に抵抗しない限り、PBS吸引注射器を注入した後。標識されたマイクロファージチューブに吸気液を採取し、この手順をさらに2回繰り返します。肺灌流中のバックアップを避けるために、胸部と腹部の半分の間の位置で下降胸部大動脈を切断します。切り取られた大オルタの端の近くの空洞を血を流さないで。次に、肺に0.5MLの室温ヘパリン化生理満腹を浸透させ、右心室から注入する。下降胸部大動脈の切り取り端部の空洞から血管透過液を収集する。右気管支を結紮した後、左肺を0.5MLのパラホルムアルデヒドで5分間膨らませます。今腹部部分を消毒します。腹部部分を切り、骨盤の骨から机を下さい。骨盤の骨を収集し、氷の上に保たれた生理食音で大腿骨と右大腿骨の骨を分離します。腹側リブケージと胸骨を生理食動物で満たされたペトリ皿に集め、氷の上にも保管します。1 MLシリンジに十分にフィットした針を使用して、生理音の0.5 MLで骨のカット端を4回浸透させる。各骨の分数をラベル付きファルコンチューブに集め、フィルターを取り付け、氷の上に置きます。遠心分離機は3000 RPMで10分間すべてのサンプルを。上清を収集し、フラッシュはそれらを凍結します。最低200マイクロリットルのPBSで細胞を再構成する。白血球の総カウントを実行します。カルセイングリーンと赤エチジウムホモジマー1染色の混合物でBALの別の液体を染色する。ケモカインと総タンパク質濃度の上清を分析します。細胞を遠心分離し、各スライドに2つのサイトスピンを調製し、生化学的および免疫タンパク質に対する染色を行います。すべてのグループの肺の凍結切片に修正されたHおよびE染色を行う。マージしたイメージパネルで、150 ~ 200 個のセルのアウトラインを手動で作成します。すべてのチャンネルに、アウトライン化された領域をコピーします。すべてのチャンネルのプリセットパラメータを測定します。染色された分子の蛍光強度をDAPIまたはCD61の蛍光強度で割ります。これらは、DAPIまたはCD61正規化蛍光強度比と呼ばれる。次に、パラメータをプロットして、露光後の変更を評価します。結合された暴露はBAL、LVPまたは胸骨骨髄細胞の総数に何の変化も誘発しなかったが、マウスは全身白血球増加症を24時間表示し、その後、暴露後72時間で白血球減少症が続いた。これらは末梢血細胞数に表示されます。大腿骨骨髄細胞数は、すべての時間ポイントと比較した場合、72時間で遅いスパイクを示しています。BAL細胞スピンの画像では、24時間で多形核細胞にSiglec-F染色とCX3CRI染色がないことにご注意ください。BALおよびLVP細胞スピンは、ゼロ時間で大きなCD11bおよびGR1陽性単核細胞の存在を示した。多形核細胞は、曝露後全ての区画において優勢な細胞型として提示される。BAL総タンパク質含量は、併用暴露後36時間で最も高かった。しかし、LVPタンパク質は曝露後に変化はなかった。エオタキシン-2およびインターロイキン-2のレベルは、LVPの4時間で最も高かった。これらのケモカインはBAL画分で減少した。興味深いことに、好中球の驚くべきIL-16および多くの先天的なケモカインはLVPで改変されたが、BALの分率は変化しなかった。ベースラインでは、BAL細胞の95%以上が皮質アクチン、ラメリポディア、ストレスおよびチューブリン繊維を示す単核であり、ミトトラッカー染色の減少に対して強く陽性であった。4時間で、アクチンを失った円形BAL細胞を観察したが、赤と低い減少したミトトラッカー染色に示すように微小管ネットワークが広がっていることを示した。結合された暴露の早い段階で、BAL細胞はカルセインとエチジウムホモジマー-1に対して二重陽性に見え、これは部分的に損なわれた細胞を示す。36時間で、BAL細胞は主に緑色で生存可能であった。BAL肺胞マクロファージおよび好中球における離散ATPアルファおよびLy6G染色を観察した。DAPI正規化ATP αの減少と細胞内Ly6Gタンパク質の含有量の増加を観察した。この結合された曝露は、バル、ナチュラルキラー細胞およびK1.1、好中球ATP、サブユニットPETA、増殖因子、Ki-67および好中球GR1、血小板CX3CRIおよび抗血管新生アンジオスタチンタンパク質の持続的な表現を曝露後のBAL細胞において誘導した。気管支および歯槽中隔損傷が予想されたが、曝露後36時間で大血管の細胞凝集を観察することは驚くべきことであった。最後に、この表にサマライザの結果があります。私たちのマウスモデルは、侵襲的な細胞死と感染症のメカニズムを研究するためのレベル2の封じ込めラボで再現できる容易にアクセス可能なプロトタイプとして機能することを願っています。ありがとうございました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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直接気管内リポ多糖刺激によるマウスの急性肺損傷の誘導

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一方的気管支内酸インスティレーションによる自己限定急性肺損傷のモデル

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オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価

本プロトコルは、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)を模倣するためにオレイン酸を使用するマウスの肺損傷モデルについて記述する。このモデルは、浮腫の炎症性メディエーターを増加させ、肺コンプライアンスを低下させます。オレイン酸は、この生理学的形態が塞栓症のリスクを回避するため、塩の形態(オレイン酸)で使用されます。...

オレイン酸誘発性急性呼吸窮迫症候群モデルマウス

生体内蛍光顕微鏡は、白血球 -...

真空安定化イメージングシステムを用いた実験的急性肺損傷における肺微小循環の生体内広視野蛍光顕微鏡

換気を維持し、低酸素症を回避しながら左肺虚血再灌流(IR)損傷を引き起こすマウス手術モデル。...

口腔気管挿管と人工肺虚血再灌流手術のマウスモデル

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齧歯類の急性肺損傷を誘発するための非侵襲的気管内リポ多糖投与

学ぶマウス急性肺損傷モデルにおけるオゾンとLPS誘発の肺細胞適応機構。好中球を中心とした細胞死と免疫応答の変化を蛍光顕微鏡法で解析し、炎症修復メカニズムを解明する方法です。

オゾンとLPS誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化

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