Name: 重度卵巣機能障害患者における不妊治療の保存 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶ、薬剤を使用しないin vitro activation（IVA）法による卵巣濾胞の活性化と、重度の卵巣機能障害を持つ患者における採卵数増加の手法。この革新的な生殖医療技術は、低予備卵巣患者の不妊治療と生殖能力保存に新たな可能性を提供する。

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薬を含まないIVA処置を支援してくれた伊華達司、栗本佐知子、高橋和子、吉沢由紀、嵐正生、藤田健太郎、九藤恵奈、栗本由佳、若槻真由子氏に感謝します。また、英語のナレーションを挿入してくれたレベッカ・トルーマンとグレゴリー・トルーマンに感謝します。本研究は、日本学術振興会(JSPS)、科学研究B(19H03801)、チャレンジング探索研究(18K19624)によって支援されました。

書面によるインフォームド・コンセントは、薬物を含まないIVA治療に登録した卵巣予備軍の減少を伴う各POR患者から得られた。本研究は国際保健福祉大学倫理委員会(第17-S-21)によって承認されました。臨床試験は、番号UMIN000034464の下で登録され、世界医師会の倫理規定(ヘルシンキ宣言)に従って行われました。
1. 卵巣皮質抽出
<ol><li>卵巣皮質の一部(10 x 10mm、2〜3mm厚)を、前述の腹腔鏡手術を通じて全身麻酔下の一方または両方の卵巣から取り除く。</li>
	<li>37°Cで10mLの修飾HTF(mHTF)を含む無菌容器に、採取した卵巣コルテックスを入れる。</li>
</ol>2. 卵巣皮質の断片化
注:卵巣皮質の解剖の前に、mHTFを37°Cにウォームアップしてください。 手順を通じて無菌状態を維持します。この手順のすべてのツールは、一覧の一覧を 示します。
<ol><li>収集した卵巣コルテックスを37°CのmHTFを5〜10 mL含むプラスチック皿に入れ、ヒートプレートの上に置いて組織を37°Cに維持する(図2A)。</li>
	<li>患者のバックグラウンドデータをリンクするための次の手順を開始する前に、患者の名前を持つデジタルカメラを使用して各皮質の写真を撮ります。</li>
	<li>mHTFで湿らせた滅菌ガーゼに個々の皮質を置く(図2B)。 注:この手順の間に皮質の表面が乾燥するのを防ぐためにガーゼに使い捨てピペットを使用して追加のmHTFを適用します。</li>
	<li>マイクロハサミを使用してピンク色に見える残留髄組織を除去し、組織の厚さが1〜2mmに達するようにします(図2CおよびD)。 注:初期段階の卵胞は卵巣皮質21の表面から1〜2mm以内に位置しているので、初期段階で卵胞の損失を避けるために、厚さが1mm未満の皮質ストリップを準備しないでください。</li>
	<li>各卵巣皮質ストリップから1mm x 1mm x 5mmの組織片を微細なメスを用いて解剖し、それを組織学的分析に供して、前述の18(図2E)のように残留卵胞の存在を決定する。 注:組織学のための解剖組織はmHTFに浸漬され、固定されるまで4°Cに保つ(図2F、ステップ4を参照)。</li>
	<li>細かいメスを使って皮質を1mm x 1mm x 10mmのストリップに切ります(図2G)。 注:メスを押し下げるよりも、引っ張るよりもカットする方が簡単です。</li>
	<li>これらのティッシュストリップを1 mm x 1 mm x 1 mmの小さい立方体に切る(図2H)。 注:培地の浸透圧の変化を避けるために、組織の自動移植の前に適度にmHTFを加えてください。</li>
</ol>3. 卵巣皮質断片の自動移植
<ol><li>IVAカニューレのパッケージを開き、滅菌ドレープに置きます。</li>
	<li>IVAカニューレの内部をmHTFで数回吸引して排出して、mHTFを使用してリンスします。</li>
	<li>吸引100-200 μLのmHTFは、ローディング中に皮質キューブが乾燥するのを避けるためにIVAカニューレの先端を満たす(図3A)。</li>
	<li>細かいトゥイザーを使用して、皮質キューブをIVAカニューレの先端にロードします(図3B-E)。 注: ローディング用の皮質キューブの数は、移植部位によって異なります。一般的に、20〜30キューブは直交性残りの卵巣に移植することができ、10〜15キューブは卵管のセロサの下のポーチに移植することができる。</li>
	<li>皮質キューブをロードした後、麻酔体を含むカニューレの先端を指で保持し、IVAカニューレを外科医に移します。これにより、立方体の温度が低下するのを避けます。 注:腹腔鏡下手術の下での自己移植手順の詳細は、以前に報告されています 19.卵巣皮質キューブの移植のために、カニューレ形の装置(IVAカニューレ)は、我々の共同研究者である北里株式会社によって開発されました。</li>
</ol>4. 卵巣皮質の組織学的解析
注:残留卵胞の数を数えるために、前に説明した15のように組織学的分析を行います。
<ol><li>サンプル固定の前に、皮質ストリップ表面に組織マーキング染料でマークします。これは、体質学のためのストリップの皮質の側面を示します。</li>
	<li>ブインの溶液を使用して4°Cで一晩組織ストリップを固定します。 注意:食毒卵胞を検出するために、卵母細胞質の収縮を避けるために、固定にパラホルムアルデヒドを使用することはお勧めしません。</li>
	<li>脱水し、パラフィンに組織ストリップを埋め込みます.</li>
	<li>組織試料を含むパラフィンブロックを連続的に切片する。</li>
	<li>各セクションをヘマトキシリンとエオシンを使用して染色し、卵胞を可視化する。</li>
	<li>前述の17のように卵胞を数えます。</li>
</ol>

<ol><li>Liang, T., Motan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+Oocyte+Cryopreservation+for+Fertility+Preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mature Oocyte Cryopreservation for Fertility Preservation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 155-161 (2016).</li>
<li>Yoon, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+births+after+vitrification+of+oocytes+in+a+stimulated+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+program%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program.</a> Fertility and Sterility. 79 (6), 1323-1326 (2003).</li>
<li>Donnez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Livebirth+after+orthotopic+transplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue.</a> Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).</li>
<li>Meirow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnancy+after+transplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+in+a+patient+with+ovarian+failure+after+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy.</a> New England Journal of Medicine. 353 (3), 318-321 (2005).</li>
<li>De Vos, M., Devroey, P., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ovarian+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Primary ovarian insufficiency.</a> Lancet. 376 (9744), 911-921 (2010).</li>
<li>Scott, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle-stimulating+hormone+levels+on+cycle+day+3+are+predictive+of+in+vitro+fertilization+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Follicle-stimulating hormone levels on cycle day 3 are predictive of in vitro fertilization outcome.</a> Fertility and Sterility. 51 (4), 651-654 (1989).</li>
<li>Ferraretti, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+consensus+on+the+definition+of+%27poor+response%27+to+ovarian+stimulation+for+in+vitro+fertilization%3A+the+Bologna+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria.</a> Human Reproduction. 26 (7), 1616-1624 (2011).</li>
<li>Huhtaniemi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+Molecular+Pathophysiology%2C+Genetics%2C+and+Treatment+of+Primary+Ovarian+Insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Advances in the Molecular Pathophysiology, Genetics, and Treatment of Primary Ovarian Insufficiency.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 29 (6), 400-419 (2018).</li>
<li>Męczekalski, B., Maciejewska-Jeske, M., Podfigurna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproduction+in+premature+ovarian+insufficiency+patients+-+from+latest+studies+to+therapeutic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Prz+Menopauzalny%22%5BJournal%5D)">Reproduction in premature ovarian insufficiency patients - from latest studies to therapeutic approach.</a> Prz Menopauzalny. 17 (3), 117-119 (2018).</li>
<li>Baker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+plans+and+family-building+options+for+women+with+primary+ovarian+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Life plans and family-building options for women with primary ovarian insufficiency.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 29 (4), 362-372 (2011).</li>
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<li>Englert, Y., Rodesch, C., Laruelle, C., Govoerts, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+donation%3A+ethical+aspects+related+to+the+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Contraception%2C+Fertilite%2C+Sexualite%22%5BJournal%5D)">Oocyte donation: ethical aspects related to the donor.</a> Contraception, Fertilite, Sexualite. 25 (3), 251-257 (1997).</li>
<li>Storgaard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstetric+and+neonatal+complications+in+pregnancies+conceived+after+oocyte+donation%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BJOG%3A+An+International+Journal+of+Obstetrics+and+Gynaecology%22%5BJournal%5D)">Obstetric and neonatal complications in pregnancies conceived after oocyte donation: a systematic review and meta-analysis.</a> BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 124 (4), 561-572 (2017).</li>
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<li>Domniz, N., Meirow, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+ovarian+insufficiency+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Obstetrics+%26+Gynaecology%22%5BJournal%5D)">Premature ovarian insufficiency and autoimmune diseases.</a> Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 60, 42-55 (2019).</li>
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<li>Kim, S., Lee, Y., Lee, S., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+tissue+cryopreservation+and+transplantation+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Obstetrics+%26+Gynecology+Science%22%5BJournal%5D)">Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in patients with cancer.</a> Obstetrics & Gynecology Science. 61 (4), 431-442 (2018).</li>
<li>Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+tissue+freezing%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Ovarian tissue freezing: current status.</a> Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 27 (3), 222-230 (2015).</li>
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<li>Argyle, C. E., Harper, J. C., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+cryopreservation%3A+where+are+we+now%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Oocyte cryopreservation: where are we now.</a> Human Reproduction Update. 22 (4), 440-449 (2016).</li>
</ol>

著者らは、利益相反がないことを確認した。

本稿では、薬物を含まないIVAの詳細な実験プロトコルを示した。薬物を含まないIVAは、卵巣予備軍を減少させて二次卵胞の成長を促進するPOR患者に対する不妊治療の新しいアプローチであり、卵巣刺激後により成熟した卵母細胞を生み出し、妊娠20に成功した。卵巣予備軍の減少を有する15人のPOR患者において、このアプローチは1つの自発的な妊娠を達成し、体外受精胚移植は4回の出生を可能にし、1つの進行中の妊娠19と共に。
卵巣皮質の移植の準備のために、髄質組織は、厚さ1〜2mmのマイクロハサミを使用して除去した。以前は、原始卵胞、原発性および大部分の二次卵胞が、正常卵巣予備軍21の患者における卵巣皮質の表面から1mmの厚さの範囲内に位置することを実証した。POI患者では、二次卵胞は1mmより深く、卵巣皮質21の表面から2mm以内に位置していることがわかった。アンタル卵胞は髄質組織<sup class="x...

卵巣機能は、加齢の間に徐々に低下し、いくつかの病態生理学的状態は、核型異常、自己免疫疾患、化学および放射線療法、および卵巣手術を含む。不妊治療の保存は、重度の卵巣機能不全を持つ未婚女性が将来の妊娠の可能性を維持するための最良の選択肢の1つです。不妊治療の保存のために、現在、主にオンコ不妊治療分野で2つの方法が利用可能です。卵母細胞凍結保存は、不妊治療の保存のための確立された手順であり、多くの成功した症例が報告されている1,2.一方、卵巣組織凍結保存は、がん患者における不妊治療の保存のためにも確立されたが、まだ実験戦略3、4である。どちらの方法でも、妊娠のためには複数の数の成熟卵母細胞が必要である。一般に、早期卵巣不全(POI)を有する患者は、40歳より前に月経前に、卵巣予備軍が低い中年女性は、成熟卵母細胞5、6、7を生み出すために卵巣刺激に対して貧しい卵巣応答(POR)を示した。さらに、低い数の角根を有する若年患者も、卵巣刺激7に対してPORを示した。これらの患者は、適切な卵巣過剰刺激の後でさえ、取得可能な卵母細胞の数が非常に限られており、したがって、妊娠のための卵母細胞の十分な数を確保するために複数の高価な手順を必要とする。
卵母細胞の寄付に続いて、夫の精子と胚移植(ET)を伴う体外受精(IVF)は、自分の卵母細胞8、9、10を得るのに困難を有するこれらのPOIおよびPOR患者にとって唯一の選択肢である。しかし、卵母細胞の寄付は、倫理的な問題だけでなく、自己免疫および妊娠合併症11、12、13、14によって複雑化しています。これらの問題を解決するために、患者自身の卵母細胞を用いた不妊治療の確立が望まれている。POI患者に対して、我々は、正常な卵胞の成長と成熟卵子の生成を可能にするインビトロ活性化(IVA)アプローチを開発し、多くの妊娠および出産をリードする15。IVAでは、腹腔鏡手術の下で卵巣を除去した後に卵巣コルテックスを断片化し、Akt-刺激薬による卵胞を活性化し、第2回腹腔鏡手術15の下で卵管のセロシの下に作られた人工パウチにヘテロトーブリ移植を行うために2日間培養した。この手順は、卵巣皮質断片化後の原始、一次および二次卵胞の成長を促進し、カバのシグナル伝達破壊を促進する16、続いてAktシグナル伝達刺激装置17を有する2日間培養を行った。
重篤なPOI症例とは対照的に、卵巣予備軍の減少を有するPOR患者は複数の二次卵胞を有する。カバのシグナル伝達破壊だけでも二次卵胞の成長を促進するのに有効であるため、我々は最近、Akt刺激薬の治療なしに皮質断片化および直交性移植を含む薬物のないIVA処置を使用してPOR患者のための成功した妊娠および出産を実証した。薬物を含まないIVAは、卵巣卵胞の初期段階を刺激して、1回の手術後に前骨胞期に発達し、IVF胚移植15,18に対して取得卵母細胞の数を増加させた。薬物を含まないIVAアプローチは、培養中の潜在的な卵胞喪失を回避する1)によって当社の元のIVAと比較していくつかの利点を有し、2)第2の手術の侵襲性とコストを最小限に抑え、3)短期手術後の安静所のみを含む、および4)正体移植による自発的な妊娠の可能性。我々は最近、薬物を含まないIVA19の外科的処置と手術後の卵巣刺激の詳細なプロトコルを示すビデオ記事を公開した20.ここでは、薬物を含まないIVAに必要なラボメソッドの詳細を紹介します。

<table><tbody><tr><td>4.5 ONZ試料容器</td><td>FALCON</td><td>354013</td><td>他の製品も適しているかもしれません</td></tr><tr><td>60mm皿</td><td>FALCON</td><td>351007</td><td>他の製品も適しているかもしれません</td></tr><tr><td>50 x 50 cmの滅菌ドレープ</td><td>HOGY Medical</td><td>SR-823</td><td>任意のタイプの滅菌プロダストも適しているかもしれません</td></tr><tr><td>使い捨てピペット</td><td>FALCON</td><td>357575</td><td>他の製品も適</td></tr><tr><td>しているかもしれません細いハサミ、湾曲した</td><td>WPI</td><td>#14224-G</td><td>他の製品も適しているかもしれませんが、この製品の使用を強くお勧めします</td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>東海ヒット</td><td>TPiE-SP</td><td>移植前に卵巣組織を含む皿の温度を維持するための手術室での使用</td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン溶液</td><td>アーバインサイエンティフィック</td><td>9988</td><td>卵巣組織を取り扱うための培地</td></tr><tr><td>IVAカニューレ</td><td>北里</td><td>446030 IVA-6030E</td><td>組織自家移植用専用カニューレ</td></tr><tr><td>KAI 医療 使い捨てメス</td><td>WPI</td><td>#5 10-A</td><td>他の製品も適しているかもしれませんが、この製品の使用を強くお勧め</td></tr>します <tr><td>マイクロハサミ、湾曲した</td><td>WPI</td><td>#503364</td><td>他の製品も適しているかもしれませんが、この製品の使用を強くお勧め</td></tr>します <tr><td>変更されたHTF Medium-HEPES</td><td>Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>卵巣組織を取り扱うための培地</td></tr><tr><td>滅菌ガーゼ</td><td>大崎メディカル</td><td>15004</td><td>どのような種類の滅菌プロダストも適している場合があります</td></tr><tr><td>スイスピンセット、湾曲した先端</td><td>KAI</td><td>#504505</td><td>他の製品も適しているかもしれませんが、この製品の使用を強くお勧め</td></tr></tbody></table>します

重度卵巣機能障害患者における不妊治療の保存

Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction

卵巣機能は、加齢の間、および核型異常、自己免疫疾患、化学および放射線療法、ならびに卵巣手術を含むいくつかの病態生理学的状態において徐々に低下する。重度の卵巣機能不全を有する未婚女性では、不妊治療の保存は将来の妊娠にとって重要である。卵母細胞凍結保存は出生時の保存のための確立された方法であるが、これらの患者は卵巣過剰刺激後でさえ限られた数の卵母細胞を保存することができ、将来の妊娠を保証するのに十分な卵母細胞を確保するために反復刺激につながった。この問題を解決するために、我々は最近、卵巣卵胞の初期段階を刺激して前根嚢胞段階に発達することを可能にする薬物を含まないインビトロ活性化(IVA)手順を開発しました。これらの前骨葉包は、性腺刺激のユニークなプロトコルに応答することができ、その結果、凍結保存のための卵巣刺激当たりの取得卵母細胞の数が増加する。薬物を含まないIVAは、外科的アプローチおよび卵巣刺激から構成される。腹腔鏡手術を受けた患者から片方または両方の卵巣から皮質の一部を取り除いた。卵巣皮質組織は、カバのシグナル伝達経路を破壊し、初期段階の卵胞の発達を刺激するために小さな立方体に切断された。これらの立方体は、両方の卵管のセロサの下だけでなく、残りの卵巣に正交性に移植された。我々はすでに薬物を含まないIVAの外科的処置及びその後の卵巣刺激のプロトコルを公表しているが、ここでは、薬物を含まないIVAに必要な実験室法の詳細を提示する。

IVAアプローチ15の最初の刊行物では、卵巣皮質キューブを腹腔鏡手術下の移植部位に1つずつ移植した(図1A)。100-150の卵巣キューブが使用されたので、腹腔鏡手術の下で組織移植に3〜4時間かかった。また、いくつかの卵巣キューブは移植前に失われました。IVAカニューレは、一度に20〜30キューブを移植部位に移すことができるので(図1B)、1-2時間に動作時間を短縮することができます。さらに、IVAカニューレは、手術中の卵巣皮質キューブの損失を排除することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62098/62098fig01.jpg"> 図1: IVAカニューレの有効性( A</strong...

重度の卵巣機能障害患者に対する卵巣卵胞の薬物を含まないインビトロ活性化(IVA)の検査手順の詳細を提示する。この方法は、卵巣過剰刺激当たりの取得可能な卵母細胞の数を増加させ、それらの患者の生殖能力の保存に利益をもたらす可能性がある。

Ovarian function progressively declines during aging and in some pathophysiological conditions including karyotype abnormality, autoimmune diseases, ...

この映画の目標は、卵巣機能不全患者に対する新しいアプローチの手順を実証することです。卵巣機能は、加齢の間に徐々に低下し、核型異常、自己免疫疾患、化学療法および放射線療法、卵巣手術を含むいくつかの病態生理学的状態。低卵巣予備軍を有する中年女性のほとんどは、成熟した卵母細胞を生み出すために卵巣刺激に対する卵巣反応が悪い。さらに、多くの角胞を有する若年患者は、卵巣刺激に対する卵巣応答が悪いことも示した。不妊治療の保存は、将来の妊娠のための潜在的なOCSを保存するために重要です。不妊治療の保存のために、卵母細胞凍結保存が確立された。しかし、これらの貧しい卵巣応答患者は、適切な卵巣刺激の後でさえ非常に限られた数の卵母細胞を取り出す可能性があり、1人の赤ちゃんを保証するのに十分な数の卵母細胞を確保するために高価な処置を繰り返す必要がある。これらの問題を解決するために、我々は最近、卵巣卵胞の初期段階を刺激して前の卵胞段階に発達することを可能にするin vitro活性化、IVA手順を開発した。元のIVA手順は、卵巣皮質の断片化によって原始、原発、二次卵胞の成長を促進し、カバのシグナル伝達破壊につながる。その後、Aktシグナル伝達刺激器で2日間培養します。この手順は、少ない残留卵胞を有するPOI患者に適している。しかし、この手順は、複数の二次卵胞を有する患者に対する過剰な治療である。いくつかの残留二次卵胞を有する患者のために、我々は薬物フリーIVAと呼ばれる方法を確立し、カバのシグナル伝達経路を破壊するだけで二次卵胞の成長を促進する可能性を既にテストした。我々はまた、薬物フリーIVAによる出産のいくつかの成功したケースを持っています。我々はすでに薬物フリーIVAの外科的処置および卵巣刺激に続くプロトコルを発表した。本ビデオでは、薬物を含まないIVAに必要なラボメソッドの詳細を紹介します。ボローニャ基準に基づいて、薬物を含まないIVAの患者を募集しました。患者は複数の二次卵胞を有することができる。最初、皮質の一部は腹腔鏡検査によって片方または両方の卵巣から取り除かれた。POR患者は、中型卵巣を有していた患者である。ほとんどの患者では、片方または両側の卵巣から皮質組織の一部のみを抽出した。抽出された重要組織は、HEPESバッファーを含む培養培地を含む培養皿に直ちに移され、カバのシグナル伝達破壊のためにこの小さな組織を小さな立方体に解剖した。手順の詳細は、このビデオで示されます。カバのシグナル伝達経路は、最適な臓器サイズを維持するために不可欠です。この経路は、いくつかの負の成長調節因子で構成されています。カバのシグナル伝達が中断されると、キナーゼカスケードで作用する負の成長調節因子の1つであるYAPのリン酸化レベルが低下し、YAPの核レベルが増加する。YAPはTEAD転写因子と協調して作用し、下流のCCN成長因子を増加させる。一方、球状作用のアクチン重合は、G-アクチン、糸状体に対して、F-アクチン、細胞形状維持および移動にとって重要である。F-アクチン形成の以前に報告された誘導は、カバのシグナル伝達を破壊し、ヒトHeLa細胞の過剰増殖を誘発する。我々は以前に、卵巣断片化がF-アクチン形成を増加させ、YAPのリン酸化レベルの低下をもたらすと報告した。CCN成長因子の発現増加につながる。切断後、これらのキューブは残りの卵巣に移植される。この手順は、残留二次卵胞の成長を促進し、成熟卵母細胞の増加につながることができます。薬物を含まないIVAは、4つのステップで構成されています。我々はすでに薬物フリーIVAの外科的処置を発表した。卵巣皮質抽出と自動移植のためのその文献を参照してください。ここでは、薬物を含まないIVAに必要な実験室法の詳細な手順を示します。ステップ1では、卵巣皮質の断片化がどのように行われるかを示す。ステップ2では、移植のために卵巣皮質キューブを装置にロードする方法を示し、ここでは卵巣皮質の断片化を示します。この研究は、私たちの研究所の倫理委員会によって承認されました, そして、すべての手順は、世界医師会の倫理規定に従って行われました.卵巣皮質の断片化。このステップに必要な次のツール:皿、滅菌ガーゼ、細かいはさみ、細かい鉗子、メス。我々は通常、このタイプの皿および滅菌ガーゼを使用するが、プラスチックペトリ皿、ガラス皿、エトセトラのような他の製品もこの手順に適している可能性があり、滅菌ガーゼの任意のタイプも適している。しかし、私たちは強く鉗子とメスのこの形状の使用をお勧めします。また、組織を含む食器の温度を維持するためにホットプレートを使用無菌ドレープの下に置きます。皮質組織は、mHTFを含む皿にすぐに移される。患者のデータと関連付けるための患者の名前で写真を撮ります。組織の大きさ、厚さ、状態を記録します。残りの髄質組織を除去する。組織の断片化の前に、髄質組織を取り除く。皮質を無菌ガーゼに置きます。ビデオに示すように、ガーゼは培地で湿潤します。この手順の間に、皮質の表面が乾燥する前に使い捨てピペットで培地を適用する。厚さが1~2ミリメートルになるまで、マイクロハサミで残留組織を取り除きます。POR患者では、二次卵胞は皮質表面から1ミリメートルよりも深く位置しているので、組織の厚さは1ミリメートル未満にしないでください。組織学的解析のために各組織の皮質の片側を1つずつ5ミリメートルずつ測定するストリップに切り取り、残留卵胞の存在を決定します。このストリップを培養培地で1.5ミリリットルチューブに入れ、固定するまで摂氏4度に保ちます。卵巣皮質キューブの調製.髄質組織の除去後、卵巣皮質はカバのシグナル伝達破壊のために断片化される。最初は、メスを使って皮質を1つずつ10ミリメートルのストリップに切ります。その後、これらのストリップを1ミリメートル立方体の小さな立方体にカットします。培地では、組織は滑りやすく、切断が困難です。簡単に切断するには、それを引っ張るのではなく、メスを押し下げてストリップをカットします。切断後、立方体の数を数え、自動移植を準備します。培地中の浸透圧の変化を避けるために、組織の自動移植の前に適度に培地を加える。卵巣のオートグラフトのために、カニューレ形の装置の使用は容易な積み込みを可能にする。この手順には、2 つの手順が含まれます。以前は、卵巣断片を腹腔鏡下で鉗子を用いて1つ移植した。しかし、手術が完了するまでに約3〜4時間かかりました。この手順では、内側のシリンジと外気筒でできた角形の装置を使用します。シンプルな形状で軽量です。また、この装置の先端は丸い形状である。移植部位の損傷を避ける鋭い点はありません。このタイプのデバイスを使用すると、一度に20〜30キューブを移植部位に持ち込めます。これは、効率的な移植と手術時間の短縮につながります.卵巣皮質断片をロードする。IVAカニューレの調製。IVAカニューレを準備し、mHTFでこの装置を洗います。吸気と吐出培地を数回繰り返します。約100マイクロリットルの培地を吸引してカヌラの先端を充填する。これは、組織フラグメントのロード中に立方体が引き出されるのを防ぐためです。皮質キューブをロードしています。細かい鉗子で立方体を選び、カヌラの先端に入れます。オートグラフトキューブの数は、移植部位の大きさに依存します。目標の数に達するまで、キューブを 1 つずつ読み込む。キューブをロードした後、外科医にカニューレを慎重に渡します。移植部位が準備ができていない場合、卵巣キューブを含むカヌラの部分は、立方体の温度の低下を避けるために指で保持される。我々はすでに薬物フリーIVAの臨床結果を報告している。臨床結果に関する論文をご参照ください。この実験室の議定書は1人の患者のために30から50分を要求した。平均時間は、卵巣皮質の断片化のための10〜20分、IVAカニューレにこれらの断片をロードするための20〜30分です。これは組織の大きさに依存しますが、ほぼすべての患者はこの平均時間で終了することができます。結論。薬物を含まないIVAは、卵巣予備軍の減少を伴うPOR患者に対する不妊治療の新しいアプローチである。これらの実験室の議定書は、手術に要する時間と移植中の断片の損失の両方の短縮をもたらす。薬物を含まないIVAの実験室技術は、移植せずに成熟した卵母細胞を得るために卵巣組織培養の将来の適用の基礎となり得る。

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