Name: 哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶ光遺伝学的遺伝子回路の構築と哺乳類細胞における特性評価の標準化プロトコル。光による遺伝子発現の時空間制御とノイズ低減を実現し、がん生物学や組織分化研究に応用可能です。

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Balázsi研究室のコメントと提案、最初のLPAの構築を支援してくれたKarl P. Gerhardt博士とJeffrey J. Tabor博士、LOV2-degronプラスミドを共有してくれたWilfried Weber博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所[R35 GM122561およびT32 GM008444]によって支援された。物理的および定量的生物学のためのローファーセンター;国防理工学大学院(NDSEG)フェローシップ。オープンアクセス料金の資金調達:NIH [R35 GM122561]。
著者の貢献:M.T.G.とG.B.がプロジェクトを考案しました。M.T.G.、D.、およびL.G.は、実験を行.Cた。M.T.G.、D.G.、L.G.、およびG..C.は、データを分析し、原稿を準備した.B。G..B.とM.T.G.がプロジェクトを監督した。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この記事の読者は、1)遺伝子回路の設計、構築、および検証を含む、光遺伝学的遺伝子回路(および他の遺伝子発現システム)を特徴付けるために不可欠なステップについての洞察を得ることができます。2)遺伝子回路を安定な細胞株に導入するための細胞工学(例えば、Flp-FRT組換え);3)LPAなどの光ベースのプラットフォームによる操作された細胞の誘導;4)蛍光顕微鏡による光誘導アッセイの初期特性評価;5)フローサイトメトリー、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)、または免疫蛍光アッセイを含む様々なアッセイによる最終的な遺伝子発現特性評価。
さらに、上記で概説した方法は、関心のある遺伝子を発現する本質的にあらゆる遺伝子回路アーキテクチャに対して高度にモジュール化されており、回路構築ステップおよび実施されるアッセイにおいて、主な潜在的なプロトコル変更を伴う。遺伝子回路構築の場合、分子クローニングの柔軟性により、プライマー設計またはアセンブリプロトコルに若干の変更を加えた蛍光マーカーで目的の遺伝子を交換または共発現させることができます。さらに、ここで概説する手順は、主に正確な(低ノイズの)遺伝...

他の工学分野と同様に、合成生物学はプロトコルを標準化し、再現性の高い機能を持つツールを生物学的システムに関連する質問の探求に利用できるようにすることを目指しています1,2。多くの制御システムが構築されてきた合成生物学の1つの領域は、遺伝子発現調節の領域です3,4。遺伝子発現制御は、生理学的および病理学的細胞状態におけるそれらの役割のために重要な細胞特性であるタンパク質レベルおよび変動性(ノイズまたは変動係数、CV = σ/μ、平均に対する標準偏差として測定)の両方を標的とすることができる5,6,7,8。タンパク質レベルとノイズを制御できる多くの合成システム4,9,10,11,12が設計されており、ツール間でプロトコルを標準化する機会を生み出しています。
最近出現した遺伝子ネットワークを制御できる新しいツールセットの1つは光遺伝学であり、光を使用して遺伝子発現を制御することを可能にします13,14,15,16,17。それらの化学的前任者と同様に、光遺伝学的遺伝子回路は、細菌から哺乳動物に至るまで、あらゆる細胞型に導入することができ、目的の任意の下流遺伝子の発現を可能にする18,19。しかしながら、新規な光遺伝学的ツールの急速な生成により、遺伝子回路アーキテクチャ、発現機構(例えば、プラスミドベース対ウイルス統合)、および光供給制御装置において変化する多くのシステムが出現している11、16、20、21、22、23、24、25.そのため、遺伝子回路の構築や最適化、システム利用方法(統合と一過性発現など)、誘導に用いる実験ツール、結果解析など、光遺伝学的特徴の標準化の余地が残されています。
哺乳動物細胞における光遺伝学的プロトコルの標準化を進めるために、このプロトコルは、HEK293細胞(ヒト胚性腎臓細胞株)に組み込まれた負帰還(NF)遺伝子回路を用いて哺乳動物細胞における光遺伝学的システムを工学的にエンジニアリングする実験パイプラインを例に記述している。NFは、本質的に非常に豊富であるため、標準化を実証するのに理想的なシステムです26,27,28、タンパク質レベルを調整し、ノイズを最小限に抑えることができます。要するに、NFは、リプレッサーがそれ自身の発現を十分に速く減少させることによって正確な遺伝子発現制御を可能にし、それによって定常状態から離れるあらゆる変化を制限する。定常状態は、リプレッサーを不活性化または排除するインデューサーによって変更され、各インデューサー濃度に対して新しい定常状態に達するまで、より多くのタンパク質生産を可能にすることができる。最近、遺伝子発現の広い動的応答を生成し、低ノイズを維持し、空間的遺伝子発現制御の可能性を可能にする光刺激に応答することができる、操作されたNF光遺伝学的システムが作成された11。光誘導チューナー(LITers)として知られるこれらのツールは、生細胞における遺伝子発現制御を可能にする以前のシステムに触発され4、10、29、30、およびヒト細胞株に安定して統合され、長期的な遺伝子発現制御を確実にした。
ここでは、LITerを例にとり、光応答性遺伝子回路を作成し、ライトプレート装置(LPA、光遺伝学的誘導ハードウェア)31を用いて遺伝子発現を誘導し、操作された光遺伝学的に制御可能な細胞株のカスタム光刺激に対する応答を分析するためのプロトコルを概説する。このプロトコルにより、ユーザーはLITerツールを利用して、探索したい機能遺伝子を使用することができます。また、以下に概説する方法および光遺伝学的装置を統合することによって、多様な回路アーキテクチャ(例えば、正帰還、負調節など)を有する他の光遺伝学的システムに適合させることもできる。他の合成生物学プロトコルと同様に、ここで概説するビデオ録画および光遺伝学的プロトコルは、癌生物学、胚発生、および組織分化を含むがこれらに限定されない、多様な分野の単一細胞研究に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL PCRチューブ</td><td>Eppendorf</td><td>951010006</td><td>PCRを実施するための試薬</td></tr><tr><td>0.25% トリプシンEDTA 1X</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MT25053CI</td><td>哺乳類細胞の分裂と収穫のための</td></tr>試薬 <tr><td>0.5-10 &mu;L 容量調整式ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000020</td><td>ピペッティング反応に使用されるツール</td></tr><tr><td>100-1000 &mu;L 容量調整式ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000039</td><td>ピペッティング反応に使用されるツール</td></tr><tr><td>20-200 &mu;L 容量調整式ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000055</td><td>ピペッティング反応に使用されるツール</td></tr><tr><td>2-20 &mu;L 容量調整式ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000039</td><td>ピペッティング反応に使用するツール</td></tr><tr><td>5 mL ポリスチエン丸底チューブ(セルストレーナーキャップ付き</td>) <td>コーニング</td><td>フローサイトメトリー用</td><td>352235試薬</td></tr><tr><td>5702R 遠心分離機、4 x 100ローター、15 mLおよび50 mLアダプター、120 V</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td>22628113哺</td><td>乳類培養作業用機器</td></tr><tr><td>アガロー</td>ス<td>デンビルサイエンティフィック</td><td>GR140-500</td><td>ゲル電気泳動用試薬</td></tr><tr><td>96ウェルプレート用アルミホイル</td><td>VWR&reg;</td><td>60941-126</td><td>光誘導実験でプレートを覆うために使用されるツール</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td>正しいプラスミドを持つ細菌を選択するための試薬</td></tr><tr><td>アナログボルテックスミキサー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>02215365PR</td><td>PCR、形質転換、またはゲル抽出反応を運ぶためのツール</td></tr><tr><td>バクト脱水寒天培地</td>フィ<td>ッシャー サイエンティフィック DF0140010</td><td></td><td>試薬成長細菌</td></tr><tr><td>BD LSRAria</td><td>BD</td><td>656700</td><td>遺伝子操作細胞株をモノクローナル集団に選別するためのツール</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD</td><td>649225</td><td>遺伝子操作細胞株</td></tr><tr><td>BSA、ウシ血清アルブミン</td><td>政府 科学ソース</td><td>SIGA4919-1G</td><td>IFインキュベーションバッファー</td></tr><tr><td>用試薬細胞培養プレート 12ウェル、透明、平底、蓋付き、ポリスチレン、非発熱性、標準TC</td><td>コーニング</td><td>353043</td><td>プレート モノクローナル細胞の成長に使用</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>機VWR</td><td>哺乳類細胞培養用</td><td>22628113</td>装置</tr><tr><td>化学ヒュームフード</td><td>N/A</td><td>N/A IF</td><td>反応を実施するための機器</td></tr><tr><td>クリア細胞培養プレート 24ウェル平底、蓋付き</td><td>BD</td><td>353047</td><td>モノクローナル細胞の増殖に使用されるプレート</td></tr><tr><td>CytoOne T25 フィルターキャップ TCフラスコ</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-4825</td><td>哺乳類細胞の成長用容器</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP231-100</td><td>遺伝子操作された哺乳類細胞の凍結に使用される試薬</td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ゲル電気泳動</td><td></td></tr><tr><td>用試薬 15-585-011Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC処理培養マイクロプレート、蓋付き</td><td>選別モノクローナル細胞の増殖用</td><td>コーニング</td><td>353072</td>容器</tr><tr><td>FCS Express</td><td>De Novo ソフトウェア:</td><td>N/A</td><td>フローサイトメトリーデータの特性評価用ソフトウェア</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清、レギュラー、USDA 500 mL</td><td>哺乳類細胞</td><td></td><td></td></tr><tr><td>の増殖用Corning 35-010-CV試薬透明な蓋付きのフィッシャーブランドのペトリ皿 - 隆起した尾根。100 x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>バクテリア増殖用機器</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp;DMEM, High Glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-965-092</td><td>reagent for growing mammalian cells</td></tr><tr><td>Hs00932330_m1 KRAS isoform a Taqman Gene Expression Assay</td><td>Life Technologies</td><td>4331182</td><td>qPCR Probe</td></tr><tr><td>Hygromycin B (50 mg/mL), 20 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10687-010</td><td>reagent for selecting cells with proper gene circuit integration</td></tr><tr><td>iScript Reverse Transcription Supermix</td><td>バイオ・ラッド ラボラトリ</td>ーズ <td>1708890</td><td>試薬 RNAをcDNAに変換する試薬</td></tr><tr><td>ラボラトリーフリーザー -20 &deg;C</td><td>VWR</td><td>76210-392</td>実験<td>試薬を保管するための機器</td></tr><tr><td>実験室用冷凍庫-80>C</td><td>パナソニック</td><td>MDF-U74VC</td><td>実験用試薬保管装置</td></tr><tr><td>実験用冷蔵庫 +4 >C</td><td>VWR</td><td>76359-220</td><td>実験試薬保存装置</td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox) , 1 kg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td>reagent for growing bacteria</td></tr><tr><td>LIPOFECTAMINE 3000</td><td>Life Technologies</td><td>L3000008</td><td>reagemt for transfecting gene circuit into mammalian cells</td></tr><tr><td>MATLAB 2019</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>software for analyzing experimental data</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Acros Organics</td><td>413775000免疫</td><td>蛍光反応用試薬</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ、ポリプロピレン 1.7 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>プラスチック製品容器</td></tr><tr><td>Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression Assay</td><td>Life Technologies</td><td>4331182</td><td>qPCR Probe</td></tr><tr><td>MultiTherm Shaker</td><td>Benchmark 細菌</td>用<td>科学 H5000-HC</td><td>装置変換</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite 分光光度計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-NDL-US-CAN</td><td>DNA/RNA濃度測定装置</td></tr><tr><td>NEB Q5 ハイフィデリティDNAポリメラーゼ 2x マスターミックス</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>遺伝子回路断片のPCR用試薬</td></tr><tr><td>NEB10-β コンピテント大腸菌 (高効率)</td> <td>ニューイングランドバイオラボ (NEB)</td><td>C3019H</td><td>遺伝子回路を増幅するための細菌細胞興味深い</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNAアセンブリ マスターミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ(NEB)</td><td>E2621L</td><td>遺伝子回路の断片を組み合わせる試薬</td></tr><tr><td>ニコンエクリプスTi-E倒立顕微鏡とDS-Qi2カメラ</td><td>ニコンインスツルメンツ株式会社</td><td>N/A</td><td>遺伝子発現定量装置</td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>ニコンインスツルメンツ株式会社</td><td>蛍光顕微鏡データの特性評価用</td><td>N/A</td>ソフトウェア</tr><tr><td>オリゴヌクレオチド</td><td>IDT 遺伝子回路成分のPCRに用いる</td><td></td><td>N/A</td>試薬</tr><tr><td>パナソニック MCO-170 AICUVHL-PA cellIQシリーズ CO2 UVおよびH<サブ>2</サブ>オ<サブ>2</サブ>インキュベーター コントロール</td><td>パナソニック</td><td>MCO-170AICUVHL-PA</td><td>哺乳類細胞</td></tr><tr><td>増殖用機器パラホルムアルデヒド、16% 電子顕微鏡グレード</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td>試薬</td></tr><tr><td>PBS、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS) (1x)</td><td></td><td>哺乳類細胞培養用 Invitrogen 14190144試薬、IF インキュベーションバッファー</td><td></td></tr><tr><td>用 ペニシリン-ストレプトマイシン試薬 (10,000 U/mL)、100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>哺乳動物細胞</td></tr><tr><td>増殖用試薬一次ERK抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4370S</td><td>一次ERK抗体 免疫蛍光</td></tr><tr><td>一次KRAS抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0003845M1</td><td>一次KRAS抗体 免疫蛍光</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>reagent kit for purifying gene circuit plasmids</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>遺伝子回路断片を精製するための試薬キット</td></tr><tr><td>QuantStudio 3 リアルタイムPCRシステム</td><td>Eppendorf</td><td>A28137</td><td>qRT-PCR用機器</td></tr><tr><td>相対定量アプリ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>RNA/cDNAを定量するためのソフトウェア アンプリフィカイトン</td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>人工哺乳類細胞のRNAを抽出するための</td></tr>キット <tr><td>二次ERK抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8889S</td><td>二次 ERK 抗体 免疫蛍光</td></tr><tr><td>二次 KRAS 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td>二次 KRAS 抗体</td></tr><tr><td>免疫蛍光 血清学的ピペット 5.0 mL</td><td>オリンパス プラスチック</td><td>12-102</td><td>試薬 さまざまな化学反応のセットアップに使用</td></tr><tr><td>SmartView Pro イメージャー システム</td><td>メジャー サイエンス</td><td>UVCI-1200</td><td>正しいPCRバンドをイメージングするためのツール</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer(無料)またはSnapGene</td><td>SnapGene</td><td>N/A</td><td>ソフトウェア DNA配列の設計と解析</td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーター</td><td>Tokai Hit</td><td>INU-TIZ</td><td>ツール PCR、形質転換、またはゲル抽出反応を運ぶためのツール</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444557</td><td>reagent for PCR of gene circuit fragments</td></tr><tr><td>TaqMan Human GAPD (GAPDH) 内因性コントロール (VIC/MGB プローブ)、プライマー限定、2500 rxn</td><td>Life Technologies</td><td>4326317E</td><td>qPCR プローブ</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td>1851148</td><td>PCR、形質転換、またはゲル抽出反応を運ぶためのツール</td></tr><tr><td>VisiPlate-24 ブラック、ブラック 24 ウェル マイクロプレート、クリアボトム、滅菌および組織培養処理済み</td> 光誘導に使用される <td>PerkinElmer</td><td>1450-605</td><td>プレート実験</td></tr><tr><td>VWR 使い捨てパスツールピペット、ガラス、ホウケイ酸ガラスピペット、ショートチップ、容量=2 mL、全長=14.6 cm</td><td>哺乳類細胞培養用</td><td>VWR</td><td>14673-010</td>試薬</tr><tr><td>VWR Mini 水平電気泳動システム、Mini10 ゲルシステム</td><td>VWR</td><td>89032-290</td><td>DNAゲル電気泳動用機器</td></tr><tr><td>Flp-In 293</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R75007</td><td>FRT付き人工細胞株敷地</td></tr></tbody></table>

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

Reliably Engineering and Controlling Stable Optogenetic Gene Circuits in Mammalian Cells

哺乳動物細胞における信頼性の高い遺伝子発現制御には、使用される方法に関係なく、高いフォールド変化、低ノイズ、および決定された入力-出力伝達関数を備えたツールが必要です。この目標に向けて、哺乳類細胞におけるタンパク質レベルの時空間制御のために、光遺伝学的遺伝子発現系が過去10年間に多くの注目を集めてきた。しかし、光誘導遺伝子発現を制御する既存の回路のほとんどは、構造が異なり、プラスミドから発現され、可変光遺伝学的装置を利用するため、安定した細胞株における光遺伝学的構成要素の特性評価および標準化を検討する必要性が生じている。ここで、本研究は、事例例としてネガティブフィードバック光遺伝学回路を使用して、哺乳動物細胞における光誘導性遺伝子発現を制御するための信頼性の高い遺伝子回路構築、統合、および特性評価の実験パイプラインを提供する。また、これらのプロトコルは、光遺伝学的装置と光レジームを標準化することで、遺伝子発現ノイズやタンパク質発現の大きさなどの遺伝子回路の特徴を確実に明らかにする方法も示しています。最後に、この論文は、光遺伝学に不慣れな研究室で、そのような技術を採用したいと考えている人にとっては役に立つかもしれません。ここで説明するパイプラインは、哺乳動物細胞における他の光遺伝学的回路に適用され、哺乳動物細胞における転写、プロテオミクス、そして最終的には表現型レベルでの遺伝子発現のより信頼性が高く、詳細な特徴付けおよび制御を可能にするべきである。

この記事内の遺伝子回路アセンブリおよび安定な細胞株生成は、転写活性で単一の安定FRT部位を含む市販の改変HEK-293細胞に基づいていた(図1)。遺伝子回路は、プラスミド内にFRT部位を有するベクターに構築され、HEK−293細胞ゲノムへのFlp−FRTの統合を可能にした。このアプローチはFlp-In細胞に限定されず、FRT部位はCRISPR/Cas950などのDNA編集技術を使用してゲノム内の任意の目的の細胞株に添加することができる。
適切な細胞株が構築され、正しい挿入について検証されると、LPAおよびIRISソフトウェアを、遺伝子発現の光誘導のための標準化されたプロトコルとして選択した31、51。LPAシステムにより、光強度、パルス持続時間、デューティサイクルに応じて、複数の実験条件で哺乳動物細胞を誘導するように24ウェルをプログラムすることができます(<...

光応答性哺乳動物細胞を確実に制御するには、光遺伝学的方法の標準化が必要です。この目標に向けて、本研究では、ネガティブフィードバック光遺伝学遺伝子回路を用いた光誘導遺伝子発現の研究を標準化するための遺伝子回路構築、細胞工学、光遺伝学的装置操作、検証アッセイのパイプラインをケーススタディとして概説する。

Reliable gene expression control in mammalian cells requires tools with high fold change, low noise, and determined input-to-output transfer functions, ...

標準化された光遺伝学的プロトコルは、操作された哺乳類細胞系における細胞特性を制御するための刺激として光を使用することに関心のあるラボ向けに設計されています。このプロトコルは、光遺伝学に精通していないラボで簡単に実装でき、操作された生物学的システムの正確な空間的時間制御のための方法を提供します。この方法は、がん生物学、システム生物学、組織分化など、時空間情報が重要な特定の研究分野で幅広く応用されています。まず、結合する遺伝子成分を選択して、単一の遺伝子回路またはプラスミドに結合する。例えば、哺乳動物DNA組み込み部位、光応答性エレメント、又は機能遺伝子が挙げられる。開始コドン、調節配列、翻訳配列などの必要なすべての特徴を組み立てて調べた後、遺伝子工学および分子クローニングソフトウェアを使用し、DNA配列に注釈を付けて保存し、後で使用するために、また参照として保存します。配列アライメントなどの組み込みの分子クローニングソフトウェア機能を使用して、プラスミド構築のためのプライマーを計算的に検証します。安定な細胞株を生成するために、遺伝子回路DNAと適切なリコンビナーゼとのリポソーム混合物を用いて、設計遺伝子回路および所望の細胞をトランスフェクトする。細胞が 80 ~ 100% コンフルエントになったら、45% 古い培地、45% の新鮮な培地、および 10% DMSO を組み合わせて細胞を凍結します。残りの細胞を滅菌チューブに移し、単一細胞選別を行い、モノクローナル細胞を96ウェルプレートに単離する。モノクローナル選別から約2~3週間後、96ウェルプレート内のウェルは病巣を有するはずである。50~60%のコンフルエンシーが達成されたら、細胞を12ウェルプレートに分割する。マイクロコントローラプログラマを使用して、組み立てられたLPA回路にファームウェアを追加します。次に、取り付けプレート、回路基板、LEDスペーサー、プレートアダプター、24ウェルプレート、プレート蓋、取り付けボルト、ウィングナット、および積層コンポーネントを使用して、組み立てられた回路基板に3Dプリント部品を結合します。光遺伝学的実験を開始するには、Tabor Lab の Web サイトで入手できる Iris ソフトウェアを使用して、LPA 用の SD カードをプログラムし、適切な光条件を調べます。次に、所望の実験アウトラインの技術反復とともに強度値を入力します。500マイクロリットルの総容量の24ウェルの黒いプレートに1ウェルあたり約75,000個の細胞を加え、次いで細胞を5%二酸化炭素で加湿されたインキュベーターに入れて、それらが2〜6時間沈降するようにする。インキュベーションの最後に組織培養フード内の細胞を移した後、プラスチック製の蓋を外し、プレートの上部に接着箔ストリップを追加して、ウェル間の光移動を最小限に抑え、ウェルの下部にあるLEDからのみ光が入るようにします。LPA の取り付けられた 3D パーツにプレートを置き、各コーナーのデバイス ネジに収まる 3D プリントされた LPA ふたでプレートを覆います。デバイスを電源に接続し、LPA デバイスのリセット ボタンを押して、更新された LPA 実験設定が適用され、細胞をインキュベートすることを確認します。インキュベーション後、組織培養フードの内部で、プレートからホイルストリップを取り出し、プレートを1〜2分間座らせて、プラスチック製の蓋に結露が形成されないようにします。次に、元のプラスチック製の蓋をプレートに戻し、適切な位相コントラストまたは蛍光顕微鏡で細胞を画像化する。誘導後24〜72時間後、続いてトリプシン処理を行い、約500マイクロリットルの各ウェルの内容物全体をセルストレーナーを備えた標識チューブに移す。次いで、適切なフローサイトメトリー装置ソフトウェアを使用して、破片および細胞凝集塊を排除するために適切なサイズおよび粒度の単一細胞を捕捉する順方向および側方散乱ゲートを作成する。ゲートがセットされたら、適切なゲートで約10,000個のセルを捕捉し、必要なセルデータの量に応じてセル数を調整し、各チューブ内の実験細胞のキャプチャを繰り返します。誘導およびトリプシン処理後、約500マイクロリットルの各ウェルの内容物全体を標識チューブに移す。細胞を400倍G.で5分間遠心分離し、上清を捨てた後、サンプルを化学ヒュームフードに移す。PBSで希釈した750〜1,000マイクロリットルの4%PFAで細胞を再懸濁し、数回ピペットを上下させて細胞凝集塊を切断する。15分間のインキュベーション後、750〜1,000マイクロリットルのPBSおよび再度ピペットを数回上下させ、次いで室温で400倍Gで5分間細胞をペレットダウンする。上清を捨てた後、サンプルを化学ヒュームフードに移動し、実証されたように750〜1,000マイクロリットルの氷冷メタノールに細胞を再懸濁し、細胞をマイナス20°Cの冷凍庫に30分間座らせる。インキュベーション後、750〜1,000マイクロリットルのPBSを数回上下にピペッティングしながら加える。次いで細胞を400倍Gで5分間遠心分離した後、上清を捨て、試料を化学ヒュームフードに移した。標識一次抗体およびピペットの100マイクロリットルまたは他の適切な希釈液で細胞を6〜8回上下に再懸濁し、次いで室温で1時間インキュベートする。次に、750〜1,000マイクロリットルのインキュベーションバッファーおよびピペット溶液を数回上下に添加し、次いで細胞を400倍G.Nextで5分間遠心分離し、細胞を500マイクロリットルのPBSに再懸濁し、数回上下にピペッティングすることによって凝集塊を壊す。各チューブの内容物全体を細胞ストレーナーで標識したチューブに移す。細胞を正しい波長のレーザーで適切なフローサイトメトリー機器に持って行きます。装置について光学較正を行った。取得した画像を用いて、LEDの補正値を計算し、背景信号を減算し、画素強度を推定した。変動係数は96ウェル間で最小であった。キャリブレーションソフトウェアは、場所ごとのLEDの変化を実証し、各LEDが同じ強度に正規化されるようにグレースケール調整を作成しました。遺伝子発現は、LPA上の異なる光パルス持続時間で蛍光顕微鏡を介して操作されたより軽い細胞において誘導され、細胞はブライトフィールドおよびGFP発現のために画像化された。フローサイトメトリーを用いて、細胞を異なるパルス長値で誘導し、非誘導状態からの4倍以上の変化の集団レベルで定量化された遺伝子発現の用量応答を示した。負のフィードバックは、より軽いシステムと鮮やかなまたは明るいシステムのさまざまな光強度値を比較することによって示されるように、5倍以上の遺伝子発現ノイズ低減を達成した。qPCR分析では、操作された軽量細胞が、誘導されていない状態から10倍以上の誘導を伴う用量応答性でRNAレベルを発現し、フローサイトメトリー定量と一致することが示されました。操作されたより軽い遺伝子回路は、KRASタンパク質レベルおよびリン酸化ERKレベルの増加をもたらした青色光の増加量を示した。増殖、細胞運動性、創傷治癒、増殖、または浸潤アッセイを含むいくつかの機能的アッセイが実施され得る。これらの方法は、がん生物学、組織分化、または薬剤耐性のメカニズムに関する特定の洞察を提供する可能性がある。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。...

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

私たちは、光遺伝学的アプローチを使用して前脳回路の機能的トポグラフィーとシナプス特性を特徴付ける方法を記述し、in...

光遺伝学的に標的とした前脳回路のレーザー走査型光刺激

Optogeneticsは、行動神経科学の実験で使用するための強力なツールとなっています。このプロトコルは、レーザーシステムの設計とセットアップのステップバイステップガイドを提供し、ほとんどのげっ歯類の行動試験パラダイムと互換性のある複数の同時in...

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

このプロトコルは、光遺伝学的機能的磁気共鳴画像法(ofMRI)を成功させるために必要なステップとデータ分析を説明しています。ofMRIは、高磁場fMRIの読み出しと光遺伝学的刺激を組み合わせた新しい技術であり、機能的な神経回路とそのダイナミクスを生きた脳全体にわたって細胞タイプ特異的にマッピングすることを可能にします。...

光遺伝学機能MRI

このプロトコルは、細胞分化およびアフリカツメガエル胚発生の間にマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）活性を調節するための光発生戦略を記載する。この方法は、哺乳動物細胞培養物およびアフリカツメガエル胚のような多細胞生きている生物において、高い空間的および時間的分解能を有するMAPKシグナル伝達経路の可逆的活性化を可能にする。...

細胞分化中のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路の光媒介可逆的調節<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚発生

ここでは、振動情報の光遺伝学的制御による細胞間伝達を分析および遺伝子発現のモニタリング...

制御、細胞間相互作用における遺伝子発現パターンを分析して光遺伝学的方法

ここでは、マウスの光遺伝学を用いた場所優先パラダイムに関する2つの簡単なステップバイステッププロトコルを紹介します。これら 2...

マウスの腹骨テグメンタル領域内の光遺伝学を用いた2つの異なるリアルタイムプレイス優先パラダイム

特定の神経集団や脳領域の光遺伝学的操作により、自由に動く動物の高い時間的および空間的分解能で行動を修正することができる。慢性に埋め込まれた光ファイバーと組み合わせて異なる光遺伝学的ツールを使用することにより、さまざまな神経変調および行動検査を行うことができます。...

自由に動くマウスの行動を調節する神経活動の光遺伝学的操作

微生物代謝の光遺伝学的制御は、発酵プロセスに対する柔軟な動的制御を提供する。ここでのプロトコルは、異なる体積スケールでの化学およびタンパク質生産のための青色光調節発酵を設定する方法を示しています。...

微生物化学およびタンパク質生産のための光制御発酵

このプロトコルは、タンパク質活性の可逆的な時空間制御のための設計された青色光活性化アロステリックスイッチ(LightR)ドメインの適用について説明しています。この研究では、Srcチロシンキナーゼをモデルとして利用し、光制御Src(LightR-Src)を開発および特性評価するための精巧なプロトコルを提供します。これは、酵素クラス間でのこのアプローチの多様性を示しています。...

光遺伝学的アロステリック制御によるタンパク質活性の時空間制御

本研究では、3DプリントされたLEDアレイを用いたハイスループット実験を行い、HEK293T細胞における光誘導性遺伝子発現を最適化する方法を紹介します。...

哺乳類の遺伝子発現を制御するための光誘導システムの迅速な最適化

学ぶ光遺伝学的遺伝子回路の構築と哺乳類細胞における特性評価の標準化プロトコル。光による遺伝子発現の時空間制御とノイズ低減を実現し、がん生物学や組織分化研究に応用可能です。

哺乳類細胞における安定した光遺伝学的遺伝子回路を確実にエンジニアリングおよび制御

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