Name: 大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶ、大腸菌を用いた遺伝子コード拡張技術によるヒストンH3の特異的アセチル化とモノヌクレオソーム再構成法。この方法はエピゲネティクス研究やタンパク質相互作用解析に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この議定書と彼の貴重な指導の基礎を築いてくれたウェスリー・ワン博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(グランツR01GM127575およびR01GM121584)およびウェルチ財団(グラントA-1715)によって部分的に支援されました。

1. プラスミド建設
<ol><li>まず、ヒストンタンパク質がアセチル化され、どのリジン部位でアセチル化されるか決定します。サイト指向変異誘発を用いて、サイトをアンバーストップコドン(TAG)に変異させる。 注:ヒストンタンパク質の発現に利用される4つの以前に設計されたプラスミドがあります。4つのヒストンタンパク質はすべて、N末端ヒスチジンタグを用いてpETDuet-1ベクターにクローン化された。ヒストンH4はまた、SUMOタグ、約40のコピー数を有する複製 colE1 の起源、アンピシリン耐性、およびT7プロモーターを含む。<ol>
<li>4つのヒストンタンパク質プラスミドの1つで、目的の部位にTAG突然変異を含む前方および逆プライマー(既存のリジンコドンをアンバーストップコドンに置き換える)を設計します。</li>
		<li>プラスミドを含むタグを増幅するために、全プラスミドPCRを使用してください。プライマーに適したアニーリング温度を決定します。一般に、プライマーから5°Cを引いた融解温度(Tm)で十分です。PCR産物の入手が困難な場合、T m~5°C付近の温度勾配を使用して、アニーリング温度を最適化して増幅することができます。 注:この実験では、30 sの94°C(変性)、30秒のアニーリング温度、6分間(またはキロベースペアあたり1分)の72°Cの条件で、30サイクルに対して、社内で表現されたPFUポリメラーゼを使用しました。このタイプの PCR 方法の詳細については、劉とネイスミス7を参照してください。</li>
		<li>メーカーのプロトコルに従って PCR クリーンアップ キットを使用して PCR 製品をクリーンアップします。アガロースゲル電気泳動とそれに続く臭化エチジウム染色によりPCR産物を分析します。</li>
		<li>プラスミドを16°Cで一晩T4リガーゼでインキュベートしてリゲートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>まず、プラスミド(AmpR)を含むTAGを化学的に有能な 大腸菌に変換します。変換から最低4コロニーを選び、プラスミドを浄化します。標準的な方法を使用してグリセロールでそれぞれの細胞ストックを作り、-80°Cで保存します。 必要な TAG 変異を確認するために、シーケンス処理のために送信します。</li>
	<li>配列が確認されたら、TAG含有プラスミド(AmpR)をpEVOL-AckRS(ChlR)と共に化学的に有能なCobB( 大腸菌で知られている唯一のヒストンリシンデアセチラーゼ)をヒートショック法を用いてBL21細胞を欠失させる。pEVOL は、コピー番号が低いコピー番号 p15A 原点に中間コピー番号を持つプラスミドです。 注:プラスミドのpEVOLシリーズは、直交aaaRS/tRNATyr ペアの発現増加を示す以前の研究に基づいて構築され、タンパク質の切り捨てを減少させ、変異タンパク質の全体的な収量を増加させる効果があった8。CobB欠失細胞がアクセスできない場合は、化学的に有能なBL21細胞を使用して進みます。CobBは、サーチュイン様ヒストンリシンデアセチラーゼおよびニコチンアミドをヒストンタンパク質発現中に5mMの最終濃度で添加して、代替アプローチ9としてCobBを阻害することができる。</li>
	<li>セルストックを作り、-80°Cで保管してください。</li>
</ol>2. アセチル化ヒストンタンパク質発現
<ol><li>1 Lのオートクレーブ2YT培地(または選択量)を培養フラスコに調製する。</li>
	<li>2YT培地の20mLを、TAG含有プラスミド(AmpR)およびpEVOL-AckRS(ChlR)を有する共形細胞ストックと共形化した細胞ストックを含む20mLを接種し、37°CでOD=0.6(4-6h)に成長する。</li>
	<li>1 Lのオートクレーブ2YT培地に適切な抗生物質を加え、20 mLスターター培養液で接種します。37°CでOD = 0.6-0.8(2-3 h)に成長します。</li>
	<li>誘導剤およびアセチルリシン(AcK)をIPTG 1 mM、0.2%アラビノース、およびAcK 5 mMの最終濃度に加えます。</li>
	<li>37°Cで6〜8時間培養します。</li>
	<li>ペレット細胞は2,700 x g で15分間用いた。</li>
	<li>細胞ペレットを-80 °Cで一晩保管してください。</li>
	<li>このステップ以降は、常に氷の上にサンプルを保ちます。培養液1L当たりヒストン溶解バッファーの50mLに細胞ペレットを溶解する。</li>
	<li>次のサイクルに従ってソニッケート:1 sオン、1 sオフ、時間通りに合計:60%振幅で3分。</li>
	<li>41,600 x g で45分間ペレット包包体。</li>
	<li>上清を捨て、ヒストンリシスバッファーの30 mLで封入体を再中断します。ペレットインクルージョンは41,600 x g で30分間です。</li>
	<li>上清を捨て、30 mLのペレット洗浄バッファーに封入体を再中断します。ペレット包包体は41,600 x g で30分間です。</li>
	<li>上清を捨て、含包体を6Mグアニジン塩酸塩(GuHCl)緩衝液の25 mLに溶解する。37°Cで1時間撹拌してインキュベートする。 注:必要に応じて、封入体は4°Cで一晩攪拌してインキュベーションすることができます。</li>
	<li>ペレットインクルージョンは41,600 x g で45分間です。上清を1 mLのNi-NTA樹脂で2時間6M GuHClバッファーと平衡化してインキュベートします。</li>
	<li>変性条件下でのNi-NTAの精製を進めます。カラム洗浄バッファーの3桁のボリュームでカラムを洗浄します。溶出緩衝液の10 mLでヒストンタンパク質をアセチル化した。 注:ここでタンパク質を濃縮しようとすることはオプションですが、アセチル化ヒストンは非常に予測不可能であり、容易に沈殿することができます。2mLを超えて総量に集中することはお勧めできません。</li>
	<li>アセチル化ヒストンタンパク質を5%の酢酸緩衝液に対して広範囲に透析し、塩を除去する。4°Cで一度に3時間の透析液を、最低6回の新鮮な緩衝液と交換する。 注:タンパク質の純度を向上させるために、純水に対して透析するオプションがあります。しかし、これは、低収量のアセチル化ヒストンタンパク質にとって望ましくない可能性がある有意な沈殿および収量の低下を引き起こす。</li>
	<li>アリコートと凍結乾燥タンパク質を、-80°Cで無期限に保存する。 野生型ヒストンタンパク質は一般に10〜50mg/Lを生成し、アセチル化ヒストンタンパク質は特定のリジン部位に応じて10mg/L未満の収量を示します。例えば、H3K79Acは5mg/Lの平均値を示す。</li>
</ol>3. 野生型ヒストンタンパク質発現
<ol><li>完全なヌクレオソームを組み立てるには、4つのヒストンタンパク質すべてを発現する。野生型ヒストンを表現して浄化する場合、プロトコルは以下を除いてアセチル化されたヒストンと同じです。<ol>
<li>共変換を実行しないでください。野生型ヒストン表現には pEVOL-AcKRS を使用しないでください。それに応じて抗生物質を調整します。</li>
		<li>細胞の発現の誘導時に、CobB欠失細胞株を使用したり、ニコチンアミド、AcK、またはアラビノースを添加したりしないでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 601DNAの作成
注:以前に設計された最適化されたDNA配列は、ヒストンオクターで組み立てられ、高効率で単核組を生成します。この配列は、601 DNAまたはWidom配列と呼ばれる。この配列は、クロマチンリモデリングアッセイから単一分子測定10までのヌクレオソームのインビトロ研究のための標準的なDNA配列となっている。
<ol><li>ヌクレオソームアセンブリ用に601 DNAのかなりの量を調製するには、pGEM-3z/601をトップ10細胞に変換し、プラスミド増幅および抽出のために10 mLの培養を増殖させます。プラスミド抽出キットを使用し、メーカーの推奨に従ってください。</li>
	<li>この増幅プロトコルには、社内で表現されたPFUポリメラーゼ(より効率的)を使用してください。PCR反応を設定する:250 μL反応の場合、207.5 μL オートクレーブMQ H2O、25 μL 10x PFUバッファー、5 μLフォワードプライマー:ctggagaatcccgggcgccg、5 μL リバースプライマー:アサガタタタタトガカック、5 μLNTPミックス、2.5μL PFU酵素を使用します。私たちは通常、組み立てるのに十分なDNAを得るために一度に60の反応を実行します。</li>
	<li>PFUポリメラーゼを使用する場合は、30 sで52°Cのアニーリング温度と延長時間30sを使用してください。それ以外の場合は、メーカーの推奨条件に従ってください。</li>
	<li>PCR が完了したら、PCR 製品を精製するために、選択した PCR クリーンアップ キットを使用します。</li>
</ol>5. ヒストン・オクターマーの組み立て
<ol><li>ヒストンタンパク質ペレットH2A、H2B、H3、およびH4のアリコートを溶解し、総体積100μLのGuHClバッファ内にヒストンタンパク質のそれぞれ別々のストックが存在するようにします。</li>
	<li>A280吸光度を測定して、ヒストンタンパク質の濃度を計算します。</li>
	<li>吸光度がタンパク質に対して1より大きい場合は、より正確な濃度を得るためにGuHClバッファーで希釈する。</li>
	<li>H2AとH2Bのタンパク質を1:1モル比で組み合わせ、合計4μg/μLのタンパク質濃度に希釈します。</li>
	<li>2 M TE バッファーに対して 4 °C で連続して 2 M TE バッファー 2 時間、0.5 M TE バッファー 5 時間。 注:透析の第2および第3のステップは、タンパク質の不安定な立体構造を引き起こし、沈殿します。これらのステップでは大きな降水量が予想されます。</li>
	<li>4°Cで16,800 x g で遠心分離により沈殿物を除去する。</li>
	<li>再度、A280 吸光度を測定するヒストンダイマー(H2A/H2B混合物)と四量体(H3/H4混合物)の濃度を計算する。</li>
	<li>1:1モル比でダイマーと四量体を混合し、固体NaClを加えてNaClを2Mに調整します。</li>
	<li>ヒストン・オクターマーは4°Cで保存でき、ダイマーやテトラマーよりも安定しています。これは分解を引き起こす可能性がありますので、ヒストンオクタマーを凍結しないでください。</li>
	<li>アセチル化ヒストンで組み立てる場合は、野生型タンパク質を手順中のアセチル化タンパク質に置き換えるだけです。</li>
</ol>6. 核組立体
<ol><li>100x TE バッファーと固体 NaCl を使用して、601 DNA を 2M TE バッファーに調整します。2M TE バッファーの 601 DNA をヒストンオクタマーに 0.85:1 ~ 0.90:1 のモル比で加えます。遊離DNAがゲルシフト解析に存在する場合、DNAの比率が低くなる可能性があります。</li>
	<li>DNA-ヒストン混合物を透析袋に移し、2M TEバッファーの約200 mL(または複数のサンプルを組み立てる場合は複数)に入れ、4°Cで非常に穏やかにかき混ぜます。</li>
	<li>塩TEバッファーをゆっくりと滴下するためにパージする蠕動ポンプを設定します。ボリュームがおよそ2倍になったら、半分のボリュームを注ぎます。これを合計で少なくとも4回実行します。ポンプを使用すると、開始体積に応じて4-8時間かかることがあります。ヌクレオソームは、塩濃度が150mM(塩分濃度計で測定)に減少すると形成される。</li>
	<li>塩濃度が150mMに低下した後、透析は一晩で20mMのTEバッファーに対して。</li>
	<li>遠心分離により沈殿物を除去し、プレートリーダーを用いてA260 読み取りによるヌクレオソームの濃度を測定する。</li>
	<li>His-TEVプロテアーゼ(TEV:ヌクレオソーム1:30、w:w)を加え、4°Cで一晩インキュベートしてヒスチジンタグをすべて除去します。ニNTA樹脂プルダウンにより、核組液からヒスチジンタグ不純物を除去します。</li>
	<li>ヌクレオソームを位置決めし、試料を均質化し、60°Cで1時間インキュベートする。 注: 特に不安定なアセチル化されたサイトでは、この手順は推奨されない場合があります。</li>
	<li>4 °Cで、短期間(数週間)のヌクレオソームを保管する。</li>
	<li>長期保存のために、透析用ヌクレオソームは貯蔵バッファーに対して、-80°Cで保存します。</li>
</ol>

<ol><li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea%3A+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li>
<li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysyl-tRNA+synthetase%3A+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li>
<li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91(2008).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689(2017).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li>
<li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li>
<li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+DNA+sensing+pathways%3A+STING%2C+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li>
<li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGAS+produces+a+2%27-5%27-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+%5BG%282%27%2C5%27%29pA%283%27%2C5%27%29p%5D+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+PLPLRT%2FSD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li>
</ol>

著者の誰かによって宣言する競合する財政的利益はありません。

実験中にこのプロトコルを詳細に従うことは不可欠です。ヌクレオソームは非常に安定しておらず、多くの試行錯誤がこのプロトコルを決定することに入っています。粒子状物は容易に組み立てプロセスを妨げる可能性があるので、すべてのステップ(または観察されるたびに)で沈殿物を除去することが重要です。常にヒストンサンプルを氷の上に置いてください。ヌクレオソームが4°Cで長時間保存されている場合、自発的に分解することができます。実験で使用する前に2週間以上4°Cで保存されている場合は、ネイティブPAGEでサンプルを確認してください。これはまた、それらを分解する原因となる可能性がありますので、渦オクターやヌクレオソームを避けてください。ダイマー、テトラマー、または八重奏体の組み立てに問題が発生した場合、これは通常、タンパク質の質が悪いという指標です。タンパク質の品質を15%SDS-PAGEで確認してください。タンパク質の純度が低い場合の1つの選択肢は、純粋な水に対してタンパク質を透析することです。これは、重い沈殿を引き起こし、タンパク質の収量を大幅に減少させるが、より純粋なサンプルを生成します。ヒストンアセチル化部位の組み込みおよびヌクレオソーム安定性は大き...

我々は、PylRSおよびtRNAPylを利用して、部位特異的アセチル化ヒストンを有する再構成単核体を合成および組み立てる。PylRSは、翻訳後修飾(PTM)を用いてタンパク質を産生する遺伝コード拡張ツールとして非常に価値があることが証明されており、約200の異なるncAAを組み込むために遺伝的に進化してきました。PylRSは、アンバーストップコドンで組み込み、翻訳中に他のアミノ酸との競合を除去します。PylRSは、メタノジェニック古風で初めて発見され、その後、新しい反応性化学基をタンパク質1,2に組み込むために化学生物学に利用されている。
MmAcKRS1はメタノサルシナ・メイジ・ピルスから進化し、アセチル化タンパク質3、4、5、6の合成のために私たちの研究室で頻繁に使用されました。MmAcKRS1は、大腸菌での翻訳中に選択したmRNAの中で、黄色の突然変異部位でAcKを提供する。この技術は、以前にK4、K9、K14、K18、K23、K27、K36、K56、K64、およびK79ヒストンH3リシン部位にAcKを組み込み、アセチル化単核体4、5、6にサーチュイン1、2、6、および7の活性を研究するために使用されてきた。ここでは、アセチル化ヒストンを発現し、アセチル化ヌクレオソームを再構成するこの方法を詳述する。

<table><tbody><tr><td>0.5 M TE バッファー</td><td>NA</td><td></td><td>NA 0.5 M NaCl、20 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.8</td></tr><tr><td>1 M TE バッファー</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1 M NaCl、20 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.8</td></tr><tr><td>100x TE バッファー</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NA 2</td><td></td><td></td><td>M NaCl、20 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.8</td></tr><tr><td>20 mM TE バッファー</td><td>NA</td><td></td><td>NA 20 mM NaCl、 20 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M 塩化グアニジン、20 mM Tris、500 mM NaCl、pH 8.0</td></tr><tr><td>アセチルリジン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カラム洗浄バッファー</td><td>NA</td><td>NA</td><td>6 M 尿素、500 mM NaCl、20 mM Tris、20 mM イミダゾール pH 7.8</td></tr><tr><td>溶出バッファー</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;可変流量薬液移送ポンプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV プロテアーゼ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒストン溶解バッファー</td><td>NA</td><td></td><td>NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td></tr><tr><td>Ni-NTA 樹脂</td><td></td><td></td><td>6 M 尿素, 500 mM NaCl, 20 mM トリス, 250 mM イミダゾール, pH 7.8</td></tr><tr><td>PCR クリーンアップキット</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>ペレット洗浄バッファー</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td> petDUET-His-TEV-H2B <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>保存バッファー</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl、20 mM トリス、20 mM NaCl、1 mM EDTA、20% グリセロール、pH 7.8</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

アセチル化ヒストンタンパク質は、変異体をコードする大腸菌、N ε-アセチルリジン(AcK)特異的メタノサルシナマジピロリシンtRNA合成酵素(MmAcKRS1)およびその同系tRNA(tRNAPyl)を組み立てるために容易に発現することができる。MmAcKRS1 および tRNAPylは、大腸菌での翻訳中に選択した mRNA の中で、黄色の変異部位で AcK を送達します。この技術は、H3リジンサイトでAcKを組み込むために広く使用されています.ピロリシル-tRNA合成酵素(PylRS)は、部位特異的なタンパク質修飾または機能化のために他の非カノニカルアミノ酸(ncAAs)を組み込むために容易に進化させることができる。ここでは、MmAcKRS1システムを用いたAcKをヒストンH3に組み込み、アセチル化H3タンパク質を再構成された単核球体に統合する方法を詳述する。アセチル化再構成単核体は、生化学的および結合アッセイ、構造決定、およびよりに使用することができる。新しい相互作用の発見やエピジェネティクスの理解に関連する実験を設計するには、改変単核体を得ることが重要です。

ダイマー、テトラマー、および八重差は、12% SDS PAGEゲルを実行することによって評価できます (図 1および図 2)。ここでは、アセチル化四量体の一部が他のテトラマーよりも低い収率を持っていることがわかります(図1)。実際、コア領域に近いほど、収率は低く見られます。これは、アセチル化が四量体の組み立てに干渉するため、コア領域に近づく可能性が最も高いです。オクタマーを組み立てた後も同様の影響が認められる(図2)。601 DNA配列を有するオクターマーを組み立てた後、ヌクレオソームは、5%1x TBE Native PAGEゲルを用いて、臭化エチジウムによる染色を行い、それを用いて評価することができる(図3)。TEV消化前に、10k基底対マーク付近ではヌクレオソームバンドが...

ここでは、遺伝子コード拡張を用いてアセチル化ヒストンタンパク質を発現し、再構成されたヌクレオソームをインビトロで組み立てる方法を紹介する。

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

修飾モノヌクレオソームを取得することは、エピジェネティックな実験を設計するために重要です。私たちのプロトコールは、生化学的および結合アッセイ、構造決定などに使用できるアセチル化再構成モノヌクレオソームを提供します。私たちの技術の主な利点は、その汎用性です。このシステムは、多くの種類の修飾をモノヌクレオソームに組み込むために簡単に変更できます。まず、培養フラスコに1リットルのオートクレーブ処理した2YT培地を調製します。適切な抗生物質を含む培地20ミリリットルに、プラスミドとpEVOL-AckRSを含むタグを持つ共形質転換細胞ストックを接種し、摂氏37度で増殖させると、OD0.6が得られます。オートクレーブ処理した2YT培地1リットルに適切な抗生物質を添加し、20ミリリットルのスターター培養液を接種します。37°Cで培養物を2〜3時間培養し、OD0.6、2.8を得ます。誘導剤とAcKを添加すると、最終濃度が1ミリモルのIPTG、0.2%アラビノース、および5ミリモルのAcKになります。37°Cで6〜8時間培養します。次に、細胞を2,700 x gで15分間ペレット化し、摂氏マイナス80度で一晩保存します。ペレットを培養1リットルあたり50ミリリットルのヒストン溶解緩衝液に溶解し、細胞を60%振幅で3分間超音波処理し、1秒オンと1秒オフの間隔で行います。ペレット含有体を41,600 x gで45分間。上清を廃棄し、封入体を30ミリリットルのヒストン溶解バッファーに再懸濁し、再度30分間遠心分離します。介在物体を30ミリリットルのペレット洗浄バッファーに再懸濁し、遠心分離を繰り返します。次に、封入体を25ミリリットルの6モル塩酸グアニジン緩衝液に溶解します。37°Cで撹拌しながら1時間インキュベートし、次いで45分間遠心分離する。上清を1ミリリットルのニッケルNTA樹脂と6モルの塩酸グアニジニウム緩衝液で平衡化して2時間インキュベートし、変性条件下でニッケルNTA精製を進めます。カラムを 3 カラム容量の洗浄バッファーで洗浄し、アセチル化ヒストンタンパク質を 10 mL の溶出バッファーで溶出します。アセチル化ヒストンタンパク質を5%酢酸緩衝液に対して透析し、摂氏4度で3時間塩を除去し、緩衝液を最低6回交換します。タンパク質を分量化し、脂肪分解し、マイナス80度で無期限に保存します。ヒストンタンパク質ペレットH2A、H2B、H3、およびH4のアリコートを溶解して、各ヒストンタンパク質が塩酸グアニジンバッファーに別々にストックされ、総容量が100マイクロリットルになるようにします。280ナノメートルで吸収剤を測定することにより、各ヒストンタンパク質の濃度を計算します。どのタンパク質でも吸光度が1より大きい場合は、塩酸グアニジン緩衝液で希釈して、より正確な濃度を得てください。H2AをH2Bと組み合わせ、H3をH4タンパク質と1対1のモル比で組み合わせ、マイクロリットルあたり4マイクログラムの総タンパク質濃度に希釈します。2モルTEバッファーに対して一晩、1モルTEバッファーに対して1モルTEバッファーに対して1°Cで1°Cで連続して透析し、0.5モルTEバッファーを5時間透析します。終了したら、摂氏4度で16,800 x gで遠心分離し、沈殿物を除去します。ヒストン二量体と四量体の濃度は、280ナノメートルの吸光度を測定することで計算できます。二量体と四量体を1対1のモル比で混合し、塩化ナトリウム濃度を2Mに調整します。100X TEバッファーと固体塩化ナトリウムを使用して、601 DNAを2モルTEバッファーに調整します。溶液をヒストン八量体に0.85、2.9対1のモル比で加えます。DNAヒストン混合物を透析バッグに移し、摂氏4度で非常に穏やかに攪拌しながら、約200ミリリットルの2モルTEバッファーに入れます。蠕動ポンプをセットアップして、無塩TEバッファーをゆっくりと滴下します。体積が約2倍になったら、体積の半分を注ぎます。これを少なくとも 4 回行いますが、開始量にもよりますが、4 時間から 8 時間かかる場合があります。塩分濃度を150ミリモルに下げた後、20ミリモルのTEバッファーに対して一晩透析します。遠心分離により沈殿物を除去し、プレートリーダーでヌクレオソームの濃度を測定します。his-TEVプロテアーゼを添加し、摂氏4度で一晩インキュベートして、すべてのヒスチジンタグを除去します。次に、ニッケル-NTA樹脂のプルダウンにより、ヌクレオソーム溶液からヒスチジンタグの不純物を除去します。摂氏60度で1時間インキュベートしてヌクレオソームを位置決めし、サンプルをホモジナイズします。ヌクレオソームは摂氏4度で短期保存します。長期保存の場合は、保存バッファーに対してヌクレオソームを透析し、マイナス80°Cで保存します。アセチル化四量体の一部は、12%SDS-PAGEゲルを泳動して評価したところ、他の四量体よりも収率が低かった。コア領域に近いほど、観測された収量は低くなります。これは、アセチル化が八量体の集合体に干渉したためである可能性が最も高いです。601 DNA配列で八量体を組み立てた後、5%1X TBEネイティブPAGEゲルを使用してヌクレオソームを評価し、続いて臭化エチジウムで染色することができます。サーマルポジショニングの前に、観察されたヌクレオソームバンドは非常に広く、縞模様が発生する可能性があります。このプロトコールを実行するときは、タンパク質を常に氷の上に置いてください。集合した二量体、四量体、ヌクレオソームを維持することが重要です。この手順により、研究者はアセチルリジン部位を特にモノヌクレオソームに設置できるようになり、クロマチンの文脈での翻訳後修飾の研究への扉が開かれました。任意の数の非標準アミノ酸をインストールするように簡単に適合させることができます。

site-specific-lysine-acetylation-histones-for-nucleosome

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々は、リジンメチル化の変化を定量化するためにMALDI質量分析法と還元的メチル化化学を使用するための手法を提案する。...

リジン脱メチル化酵素活性の定量測定のためのMassSQUIRMのアプリケーション

非標準的なアミノ酸類似体のタンパク質への残留特異的な取り込みのための使いやすい無細胞発現プロトコルが、医学、薬学、構造、機能研究のために紹介されています。...

使用モデルタンパク質への非標準アミノ酸の残基特異的取り込み<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;無細胞転写翻訳システム

このプロトコルは、示差的に同位体標識姉妹ヒストンを含むヌクレオソームの再構成を説明します。これと同時に、非対称的に翻訳後修飾ヌクレオソームはpremodifiedヒストンのコピーを使用した後に発生することができます。これらの製剤は、容易に高分解能NMR分光法を用いて、同時に両方の姉妹ヒストンに、修正クロストークのメカニズムを研究するために使用することができます。...

示差同位体で標識された姉妹ヒストンとヌクレオソームの再構成

この原稿では、ヒストンとその翻訳後修飾を認識する抗体の特異性プロファイリングにペプチドマイクロアレイ技術を適用する方法が記載されています。...

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3...

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

遺伝コードの拡張は、タンパク質アセチル化を含む、生物学的プロセスの広い範囲を研究するための強力なツールとして機能します。均一に生成するためのこの手法を悪用する安易なプロトコルをアセチル化したタンパク質の大腸菌細胞の特定のサイトを示します。...

大腸菌Site-Specifically アセチル化蛋白質を生成する安易なプロトコル

部位特異的タンパク質アセチル化および/またはサクシニル化入居 (化学量論) 内因性変更後導入された変更のレシオ メトリック分析を通して全体の proteome...

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

クロマチン環境規制、適切な遺伝子発現に必要な重要なプロセスです。ここでは、クロマチン修飾の採用によって遺伝子発現を制御する手法について述べる遺伝子特異的かつ可逆的に機械。...

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

この記事では、単一分子相関力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のためにヌクレオソーム含有DNAテザーを再構成するための詳細な実験手順を示します。さらに、クロマチン相互作用タンパク質の結合挙動を視覚化し、ヌクレオソームの物理的特性の変化を解析するために実施できるいくつかの下流実験についても説明します。...

単一分子相関力および蛍光顕微鏡法のためのIn Situヌクレオソームアセンブリ

本研究では、遺伝暗号拡張を利用して、大 腸菌...

大 腸菌 および哺乳類細胞における遺伝コード拡張による部位特異的リジンラクチル化

学ぶ、大腸菌を用いた遺伝子コード拡張技術によるヒストンH3の特異的アセチル化とモノヌクレオソーム再構成法。この方法はエピゲネティクス研究やタンパク質相互作用解析に応用可能です。

大腸菌の遺伝子コード拡張を用いた核組換えのためのヒストンの特異的なリジンアセチル化

さらに動画を探す