Name: 自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶ 自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成法。コラーゲンゲル化、ケラチノサイト播種、エアリキッド界面移行の最適化により、長期培養可能なin vivo様皮膚モデルを構築し、疾患研究やパーソナライズド医療への応用を可能にする。

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著者らは、ジム・ラインヴァルト博士59 とエレン・H・ファン・デン・ボガード20 博士がN/TERT細胞株の寛大な贈り物に感謝している。この作品は、米国心臓協会(19IPLOI34760636)によって支えられていました。

1. 3D文化の準備
<ol><li>確立されたプロトコル50、51、52を使用して、ラットテールコラーゲンストックを8 mg /mLで準備します。あるいは、ラットテールコラーゲンは、適切な濃度でベンダー(材料リストを参照)から購入することができる。 注:コラーゲンは、3〜10 mg / mL、またはより高い50、51、52の範囲で異なる濃度で調製または購入することができます。プロトコルの計算は8 mg/mL濃度を仮定しますが、研究者のニーズに基づいて調整することができます。</li>
	<li>細胞株を拡張する:内皮細胞および線維芽細胞は、3Dコラーゲン真皮成分生成の開始時に播種する準備ができている必要があります(ステップ2)。ケラチノサイトは、3D培養の7日目に準備ができている必要があります。1 つの完全な VHSE コンストラクトは 7.5 x 105内皮細胞を必要とします。7.5 x 104線維芽細胞;そして1.7 x 105 5のケラチノサイトの生成 (表 1) 注:これらの密度は、12ウェルの透過性組織培養インサートまたは同等の場合に適しています。細胞密度とフォーマットは、研究者のニーズに基づいてスケールアップまたはスケールダウンすることができます。明確にするために、この量の内皮細胞および線維芽細胞は1〜3個の真皮成分を播種し、表皮成分はそれぞれ1.7 x105 ケラチノサイトを必要とする。</li>
	<li>このプロトコルで全ての細胞遠心分離を300xgで5分間行いますが、より脆弱な細胞タイプでは減少する可能性があります。</li>
</ol>2. 3Dコラーゲン皮膚成分の生成
注: ステップ 2 は時間を重視する手順で、1 つの設定で完了する必要があります。真皮成分の播種を開始する前に適切なゲル化と均質性を確保するためにコラーゲンストックの品質チェックを完了することをお勧めします、 議論のトラブルシューティングを参照してください。
<ol><li>細胞コラーゲン層調製および播種<ol><li>1.7 mLキャップマイクロ遠心分離チューブを2つ用意し、1つは無細胞サポート用、もう1つはセルラー真皮用です。このステップで与えられた量は、(3)12ウェルサイズのVHSEに十分な3mg/mLコラーゲン(標的コラーゲン濃度)の1 mLを調製する。調整が必要な場合は、数式が一覧表示されます。研究者のニーズに基づいて体積と密度の両方をスケーリングすることができます(共通の参照番号は 表2に示されています)。</li>
		<li>各チューブに、100 μLの培養グレード 10x リン酸緩衝生理食塩 (PBS) (1 本のチューブは 3 VHSE を得る) を加え、8.6 μLの 1 N NaOH を加えます。湿った氷の上にキャップチューブを置き、少なくとも10分間冷やします。 Cs = コラーゲンストック濃度 Vf = 必要なコラーゲンの最終容積 Ct = ターゲットコラーゲン濃度 Vs = 所望量に必要なストックコラーゲンの体積 (Vf) Vpbs = 標的コラーゲン濃度に必要な10X PBSの体積(Ct) VNaOH = Ctに必要な 1N NaOH のボリューム Vメディア= Ctに必要なメディア、コール 中断、または ddH2O のボリューム <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62125/62125eq01.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62125/62125eq02.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62125/62125eq03.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62125/62125eq04.jpg"></li>
		<li>1000 μL の正の変位ピペットを使用できるように準備し、取っておきます。後のステップは時間に敏感であるため、ピペットチップとセットボリューム(それぞれ375 μLと125 μL)をロードするのが便利です。さらに、516 μLの通常の1000 μLピペットをセットします。 注:正の変位ピペットは、必要に応じて通常のピペットで置き換えることができますが、コラーゲンの粘度が高く、この手順の時間/温度感度のため、正の変位ピペットは、一貫した播種結果を生成するのに役立ちます。通常のピペットを使用する場合は、動きが遅くなります。</li>
		<li>培養挿入ウェルプレートを準備する:滅菌鉗子を使用して、3つの12ウェルサイズの培養インサートを無菌12ウェル組織培養プレートに入れ、中央列に入れます。</li>
		<li>繊維芽細胞および内皮細胞タイプに適した冷たい培地を設定する。</li>
		<li>キャップチューブを冷却した後、1つのチューブ(細胞サポート用)をラック上に置き、内容物を見えます。他のチューブ(セルラー真皮用)を氷の上に置いておく。</li>
		<li>冷凍から8mg/mLコラーゲンストックを取り除き、湿った氷の上に置きます。 注:これはコラーゲンを凍結するので、冷凍氷や-20°Cベンチトップクーラーを使用しないでください。</li>
		<li>コールドキャップチューブに516 μLの培地を加え、1000 μL 正変位ピペットを使用して375 μLのコールドコラーゲンをすぐに加えます。コラーゲンを溶液に分配します(チューブの側面にはありません)。すぐに空のピペットの先端を取り外し、調製された250 μL正変位ピペットに切り替えて混合します。<ol>
<li>泡の形成を防ぐために迅速に、しかし穏やかに混ぜ、可能であれば、溶液から先端を除去しないでください。溶液が均質な色になるまで混ぜますが、これは通常約5ピペットサイクルまたは10s(フェノールレッドの培地を使用する場合、色が明るく均一になります)。混合する際は、均一な混合のためにチューブ(底部と上)の異なる位置から描画するようにしてください。 注:これは、516 μLの細胞培養グレードの水または他の細胞培養グレードの液体で行うことができますが、ほとんどの培地のフェノールレッドは混合の良い指標です。2D拡張に使用した繊維芽細胞または内皮培地のいずれかを使用してください。</li>
		</ol></li>
		<li>125 μLの細胞コラーゲンを3つの12ウェル培養インサートの各膜にすぐに分散させます。細胞コラーゲンゲルの均一なカバレッジを確保するために、皿を揺らす;均一な膜被覆を作成しない場合は、ピペットチップを使用して、コラーゲンを穏やかに広げて膜をペイントします。膜に圧力をかけないようにしてください。ゲル化は、ほぼ即座に始まります。このステップを迅速に実行して、カバレッジを均等にします。 注:余分な細胞コラーゲンがあります。しかし、1mL未満のコラーゲン懸濁液を調製すると、溶液の混合が困難になり、ゲル化が不十分になる可能性があります。</li>
		<li>すぐに12ウェルプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに移して、少なくとも20分間ゲル化します(細胞コラーゲンは必要に応じてより長くゲル化することができます。このゲル化時間中に、ステップ2.2に進みます)。氷からコラーゲン懸濁液を取り除き、冷凍に戻します(コラーゲンは4°Cで最も安定しています)。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞懸濁液及び播種製剤 注: このプロトコルのカルチャのタイムラインでは、これはサブマーション 1 日目 (SD1) に対応します。<ol>
<li>無細胞コラーゲン支持体のゲル化中に、トリプシン化し、内皮および線維芽細胞株をカウントする。</li>
		<li>それぞれの培地の258 μLに7.5 x 10 5個の内皮細胞と7.5 x 104個 の線維芽細胞を懸濁し、細胞懸濁液を組み合わせて516 μLアリコを作り出します。使用するまで、湿った氷の上に細胞懸濁液を維持します。</li>
		<li>1000 μL の正の変位ピペットを使用できるように準備し、取っておきます。後のステップは時間に敏感であるため、ピペットチップとセットボリューム(それぞれ375 μLと250 μL)をロードするのが便利です。さらに、516 μLの通常の1000 μLピペットをセットします。</li>
	</ol></li>
	<li>真皮コンパートメントの細胞を含んだコラーゲンの播種<ol>
<li>ゲル化期間後、インキュベーターから細胞コラーゲンの12ウェルプレートを取り除きます。 注:このコラーゲンが30分後にゲル化しない場合は、播種中に間違いがあったか、コラーゲンストックに問題がある可能性があるため、手順を続行しないでください(説明のトラブルシューティングを参照)。</li>
		<li>1.7 mLキャップチューブをウェットアイスから取り外します(10x PBSとNaOHを含む)。内容物が見えるようにチューブをラックに配置します。すべてのキャップ(セルサスペンション、コールドキャップチューブ)を緩める/開きます。</li>
		<li>4°C冷凍からストックコラーゲン(8mg/mL)を取り出し、湿った氷の上に置きます。キャップは開いたままにしておきます。</li>
		<li>冷たいキャップされたチューブに冷却されたセル懸濁液の516 μLを加えます。1000 μL 正の変位ピペットを使用して、375 μLのコールドコラーゲン溶液をキャップチューブの溶液に直接直接ピペットします。</li>
		<li>ピペットからすべてのコラーゲンをチューブに排出し、正の変位ピペットチップを捨てます。すぐに250 μLの正の変位ピペットに切り替え、コラーゲン溶液を混合する。</li>
		<li>コラーゲン溶液を先に完成した様に混ぜて(素早く、しかし、泡形成を防ぐために、穏やかに)、可能であればゲルから先端を取り除かないでください。溶液が均質になるまで混合する(約5ピペットサイクルまたは10s)。混合する場合は、均一な混合のためのチューブ(底部と上)の異なる位置から描画することを確認してください。</li>
		<li>混合したら、3つの12ウェル培養インサートのそれぞれで250μLの細胞コラーゲン溶液を細胞内コラーゲン支持体にすぐに移す。無細胞コラーゲン支持体の均一なカバレッジを確保するために、皿を揺らすか、または細胞層を乱すことなく、新たに播種した細胞コラーゲンを穏やかに動かすために正の変位ピペットを使用してください。</li>
		<li>12ウェルプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに直ちに移動させ、少なくとも30分間ゲル化させます。使用後、コラーゲンを4°Cの冷凍に戻します。</li>
		<li>30分のゲル時間の後、プレートを軽く傾けてゲル化を評価します。コラーゲンが固化していることを確認します。</li>
		<li>500 μL と 1000 μL のブレンドメディア (半分の内皮および半分の線維芽細胞維持培地) を挿入器の上部チャンバーと下部チャンバーにそれぞれ加えます(上から、次に底部に、熱静圧がコラーゲンを押し上げないようにします)。コラーゲンゲルに直接ではなく、ウェルの側面にゆっくりとメディアを加え、コラーゲンの破壊を最小限に抑えます。<ol>
<li>コラーゲンゲルが水没していることを確認し、必要に応じてさらに培地を追加します。ウェルプレートを一晩のインキュベーターに入れ、一晩インキュベーターに入れます。この段階では、メディアには 10% FBS が含まれています。各セルラインの通常のメンテナンス メディア( 図1、Aに示す回路図)。 注: VHSE 培養中のメディアは、カスタムセルタイプに適合させることができます。何らかの最適化が必要な場合があります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>水中2日目(SD2)メディアの変更<ol>
<li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li></li><li> </li><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li></ol><ol><li><li> </li></ol><ol><li><ol><li> </li><li> </li><li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li> <ol><li></li><li><li> </li><li></ol></li><li> <ol><li></li><li><li></li><li><li></li><li></ol></li><li>&amp;ターミナル <ol><li><li></li><li> </li><li><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li><ol><li> </li></ol></li><li><li><li></li><li> </li><li><li><li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、VHSEの生成とその三次元分析のための簡単で再現可能な方法を実証しました。重要なことに、この方法は、いくつかの特殊な技術や機器の部分に依存し、ラボの範囲のためにアクセスできるようにします。さらに、細胞タイプはプロトコルの限られた変更に置き換えることができるので、研究者はこのプロトコルを特定のニーズに適応させることができます。
適切なコラーゲンゲル化は、皮膚培養を確立する上で挑戦的なステップです。特に精製せずに粗精製剤を使用する場合、微量汚染物質がゲル化プロセスに影響を与える可能性があります。一貫性を保つために、VHSE生成に使用するのと同じコラーゲンストックを使用して実験のグループを実行する必要があります。さらに、ゲル化は理想的には7-7.4のpHで起こるべきであり、そして微量の汚染物質はpHをシフトし得る。コラーゲンストックを使用する前に、所望の濃度で細胞ゲルを実践し、pHをゲル化する前に測定する必要があります。真皮成分の播種を開始する前にこのコラーゲン品質チェックを完了すると、完全な実験を設定する前に、適切なゲル化とコラーゲン均質性の問題を特定します。細胞コラーゲンを培養インサートに直接播種する代わりに、pH全体のスケールを評価するpHストリップにコラーゲンを播種し、7-7.4のpHを検証します。ゲル化は、コラーゲンゲル溶液の液滴をカバースリップまたは組織培養プラスチックウェルプレートに塗布することによって評価することができる(培養インサートの閉じ込められた側面をシミュレートするためにウェルプレートが推奨される)。ゲル化時間後、コラーゲンは固形でなければならない、すなわち、プレートが傾いているときには流れてはならない。位相対面顕微鏡では、コラーゲンは均質で透明に見えるはずです。透明なゲル内の不透明なコラーゲンの不定形のブロブが正常であるが、時折、透明なゲル内の不十分な混合、間違ったpH、および/または混合中にコラーゲンを冷やし続けることができなかったために問題が起こりやすいことを示す。
細胞の播種量および培地は調整され得る。上記のプロトコルでは、カプセル化された細胞量は、皮膚構築物の上に播種された1.7 x 10 5ケラチノサイトを有するコラーゲンのmL当たり7.5 x 10 5個の内皮細胞と7.5 x 10 5の内皮細胞で12ウェル挿入物に最適化されている。細胞密度は、様々なコラーゲン濃度48およびHSE生成22、80、81における3D血管ネットワーク発生を調査する予備研究および以前の研究に基づいて、このVHSEプロトコルに対して最適化されている。同様のシステムでは、公表された内皮細胞密度は1.0 x 106細胞/mLコラーゲン48である。線維芽細胞濃度は、コラーゲン22、28、82〜1x105細胞/mLのコラーゲン22、28、1x105細胞/mLのコラーゲンの0.4 x 10の5細胞/mL、58、83、84、85の範囲であることが多い。角化細胞濃度は0.5 x 105 [セル/cm2]から1 x10 5[セル/cm2]8の範囲です。細胞密度は特定の細胞および研究の質問のために最大限に活用することができる。線維芽細胞などの収縮細胞を有する三次元培養は、生存率低下および培養損失86、87を招く収縮を招く可能性がある。予備実験は、真皮コンパートメントの収縮(より多くの真皮細胞、より収縮性の真皮細胞、より長い水没培養、またはより柔らかいマトリックスで起こり得る)および表皮表面被覆を試験するために完了すべきである。さらに、過剰な真皮収縮が起こっている場合やケラチノサイトのカバレッジの異なる速度が必要な場合、沈み込み日数および血清含有量の先細り速度の日数もカスタマイズすることができます。例えば、真皮水没の期間中に収縮が気づいた場合、またはケラチノサイトが表面単層を確立している間に、血清テーパリングプロセスを通してより迅速に移動し、VHSEをALIに上げることは、追加の収縮を防ぐのに役立ちます。同様に、ケラチノサイトの被覆が理想的でない場合、VHSEが血清なしで水没する日数を変更すると、表皮単層カバレッジを増加させ、血清が取り残されるので収縮を緩和するのに役立つ可能性があります。細胞密度の変化や上記の他の提案は、特定の文化と研究目標に合わせて最適化する必要があります。
空気液体界面(ALI)期間中に表皮の適切な階層化を確立するためには、ALIおよび各構成体の適切な水分補給が培養長全体にわたって維持されるように、各ウェルの流体レベルを定期的にチェックし、維持することが重要である。メディア レベルは、一貫した ALI レベルが確立されるまで、毎日チェックおよび追跡する必要があります。表皮層は乾燥ではなく水分補給をしているように見えるはずですが、コンストラクトにはメディアのプールが存在してはいけません。ALI の間、コンストラクトは、通常の不透明な白/黄色の色を作成します。表皮層は不均一に発達する可能性が高い。一般的に、VHSEは、コラーゲンの播種または真皮収縮のために傾いています。また、構築物の中央部で高い表皮部分を小さい構成(24ウェルサイズ)で観察し、VHSEの周囲の隆起形成を12ウェルサイズで観察することも正常である。構成体13 の収縮は、これらの地形形成を変化させ、かつ/または全く観察されない場合がある。
VHSEの染色とイメージングは、VHSEに機械的操作を導入します。各文化の操作を計画し、制限することは非常に重要です。操作が必要な場合は、挿入膜からVHSEを取り除くとき、構造表面に染色または洗浄液を追加する場合、イメージング準備中に貯蔵/イメージングウェル内のVHSEを取り外して交換する際に、穏やかな動きを維持します。具体的には、表皮成分の座端層は壊れやすく、基底表皮層を取り除く危険性がある。表皮の尖体層は壊れやすく、天然組織4でも脱生物を経るが、表皮構造の正確な分析のためには、損傷や損失を最小限に抑えることが重要である。表皮層が構成体から持ち上がった場合、それらは別々に画像化することができます。表皮の基底層は真皮に依然として付着している可能性が最も高く、尖体層の一部が剥離する可能性がある。表皮の可視化のために、核染色は、高密度核が表皮の下層および中層の特徴であるため、これを観察するのに役立ちます。
VHSEポスト・フィケーションの共焦点イメージングはプロトコルで議論されているが、直立ベースの光コヘレン断層撮影(OCT)88、89、90、91、92、93を介して、培養中のVHSEを画像化することも可能である。VHSEは、目立つ効果なしに少なくとも2時間、インキュベーションや加湿なしでイメージングに耐えられるほど安定しています。OCTはラベルフリーで非侵襲的であるため、成熟時に表皮厚さを追跡することが可能です。他の非侵襲的なイメージングモダリティも同様に採用される可能性があります。
VHSEのレーザー減衰により、真皮と表皮の構造を組み合わせた体積画像は困難な場合があります。これは、表皮側(図1)と真皮側(図2)から、真皮血管構造および表皮の良好な分解能を可能にする2つの向きで構成体をイメージングすることによって軽減することができる。さらに、サンプルをクリアすることができ、最小限の減衰で構造全体の容積画像を可能にします。いくつかの消え方が試みられたが、記載のメタノール/メチルサリチル酸法は最良の結果をもたらした。他のクリアメソッドの最適化に興味のある研究者は、これらのレビュー49、61、62に向けられています。クリアする場合、この方法は蛍光体や構造に損傷を与える可能性がありますので、クリアする前にサンプルを完全に画像化することをお勧めします。また、蛍光は数日以内に消えてしまう可能性があるため、クリア後できるだけ早くイメージングを完了する必要があります。
簡潔でアクセス性を高めるには、このプロトコルは、前の文献11,80で見つかった最も単純なメディアブレンドを利用しました。単純なメディア ブレンドを使用することには多くの利点がありますが、この選択の制限も認識されます。他のグループは、表皮および真皮の健康に対する特定の培地成分の影響を研究しており、外部遊離脂肪酸/脂質などの他の培地添加剤94が表皮の角層を増強し、皮膚バリア機能を改善することを発見した。当社の免疫蛍光マーカーは、表皮における適切な分化と成層を示していますが、実施されている研究によっては、追加のメディア最適化が必要になる場合があります。さらに、ここで提示されたVHSEを評価する際に、表皮BMの広範な分析は行われなかった。BMの完全性は、皮膚同等物の重要な指標である。様々なグループは、培養期間及びBMマーキング95に及ぼす影響、ならびに線維芽細胞の存在の分析及びBM発現14に対する成長因子効果の付加に関する研究を行ってきた。BMコンポーネントの分析は、このプロトコルを使用する際に評価し、最適化する必要があることに注意することが重要です。
このプロトコルでは、VHSE生成のための手順を説明し、ALIで8週間後の結果を示す。VHSE培養は、目立った変化や生存率の喪失なしにALIで12週間まで培養されており、より長く生存可能である可能性があります。重要なことに、このプロトコルは、IMR90肺線維芽細胞との皮膚線維芽細胞の置き換えによって示されるように、一般的に利用可能な細胞タイプに容易に適応可能である。研究者のニーズと利用可能なリソースに応じて、培養物の細胞タイプとメディアブレンドを調整できますが、より異なる細胞タイプはメディアの最適化を必要とする場合があります。要約すると、これらの手順は、皮膚生物学と疾患の研究のためのVHSEの文化を明確にすることを意図しています。アクセシビリティを最大限に高めるために、このプロトコルは、研究研究の特定のニーズにさらにカスタマイズできる最小限の効果的なアプローチとして、共通の装置、細胞株、試薬を使用して、このシンプルで堅牢な開発を行いました。

人間の皮膚は、免疫/機械的バリアとしての作用、体温の調節、保水性および感覚的役割1、2、3、4など、多くの重要な生物学的機能を果たす。解剖学的には、皮膚は人体で最大の器官であり、表皮、真皮、および下皮の3つの主要な層で構成され、表皮細胞に加えて、間質、血管、腺、および免疫系の構成要素の複雑なシステムを有する。表皮自体は、バリア機能およびネイティブ皮膚の他の構造(すなわち、汗および皮脂腺、爪)3を維持するために連続的に更新される4層の細胞から構成される。皮膚生理学は免疫機能、創傷治癒、癌生物学、その他の分野において重要であり、インビトロ単一培養からインビボ動物モデルまで幅広いモデルを使用する研究者をリードしています。動物モデルは、皮膚生理学の完全な複雑さを研究する能力を提供するが、マウスのような一般的に使用される動物モデルは、ヒト5と比較して有意な生理学的差異を有する。これらの制限は、動物モデルのコストの増加と、ヒト皮膚の生理学をより密接に反映するインビトロモデルの開発に焦点を当てる多くの研究者を導いた1,6.このうち、より単純なモデルタイプの1つは、細胞真皮マトリックス上の表皮角化細胞のみで構成されるヒト表皮同等物(HEE;半厚皮膚モデルとも呼ばれる)であるが、生体内で見られる表皮分化および成層を捕捉する。この上に、皮膚および表皮成分(角化細胞および線維芽細胞)を含むモデルは、しばしばヒト皮膚同等物(HSE)、完全厚さの皮膚モデル、または組織ノティピック皮膚構築物(OSC)と呼ばれる。簡単に言えば、これらのモデルは、ゲルマトリックス内に真皮細胞を封入し、表皮細胞を上に播種することによって生成される。表皮の分化と成層は、特殊なメディアと空気暴露7を介して達成することができる。皮膚等価物は、コラーゲンタイプI(ラットテールまたはウシの皮膚起源のいずれか)1、8で作られた真皮ゲルを用いた自己集合性の技術を用いて生成されることが多いが、同様のモデルはフィブリン9、10のような他のマトリックス成分を組み込んだ。 線維芽細胞由来11、12、カダダビリック表皮化膜13、14、15、16、市販のゲル1、12、13、17、18、19。現在、市販の皮膚同等物があります(前述の1,2)。しかし、これらは主に治療目的のために開発されており、特定の研究の質問に容易にカスタマイズすることはできません。
HSEは創傷治癒、移植、毒物学、および皮膚疾患/発達11、12、13、16、8、20、21、22、23の研究に適用されている。3D培養は2D培養24と比較してヒト組織の機能をより包括的にモデル化するが、生体内集団をより正確に反映する多様な細胞型を含めることで、複雑組織24、25、26における細胞細胞協調の研究が可能になる。ほとんどのHSEは、皮膚線維芽細胞および表皮角化細胞27のみを含むが、生体内皮膚環境には他の多くの細胞タイプが含まれる。最近の研究は、より多くの細胞集団を含む始まった。これらは血管系血管系細胞10、28、29、30、31、32、33、34、皮下組織35、36、神経成分の中の有骨細胞を含む、21, 幹細胞 27,37,38, 免疫細胞10,39,40,41,42, その他の疾患/癌特異的モデル16,40,43,44 ,45,46,47.これらの中で特に重要なのは血管系です。一部のHSEには血管細胞が含まれますが、全体的には真皮10、29、拡張インビトロ安定性28、および適切な血管密度全体にわたる接続性を持つ包括的な毛細管要素が欠けています。さらに、HSEモデルは、通常、HSEの3次元構造の分析を制限するポストカルチャー組織学的断面を通じて評価される。3次元解析により、血管密度48、49の体積評価、表皮厚みおよび分化の局所的変動を可能にする。
HSEは最も一般的なorganotypicモデルの1つですが、適切な細胞外マトリックスと細胞密度の同定、メディアレシピ、適切な空気液体界面手順、培養後分析など、これらの構造を生成する際には多くの技術的課題があります。また、HEEモデルやHSEモデルはプロトコルを公開しているが、組織学的解析ではなく真皮脈管及び体積イメージングを組み込んだ詳細なプロトコルは存在しない。この研究は、主に市販の細胞株から血管化ヒト皮膚同等物(VHSE)の培養のためのアクセス可能なプロトコルを提示する。このプロトコルは容易にカスタマイズ可能に書かれ、異なる細胞タイプおよび研究の必要性に対して簡単に適応することを可能にする。アクセシビリティ、可用性、コストの点で、市販品の使用よりもシンプルな製品や生成技術の使用が優先されました。また、VHSEの三次元構造の評価を可能にする簡単な容積画像化および定量法が記載されている。この手順を堅牢でアクセス可能なプロトコルに翻訳することで、非専門研究者は、これらの重要なモデルを個別化医療、血管化組織工学、移植片開発、および薬物評価に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>1 N NaOH</td><td>Fisher Chemical</td><td>S318-100</td><td>(Dilute from Lab stock)</td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>ACROS Organics</td><td>#41678-5000, Lot # B0143461</td><td>PBS中の固体パラホルムアルデヒドを使用して構成、pHを6.9に調整</td></tr><tr><td>オートクレーブ鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11295-00</td><td>Dumont #5 鉗子</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher bioreagents</td><td>Cat # BP510-250, Lot # 190231</td><td>Rnase、Dnase、プロテアーゼフリー</td></tr><tr><td>細胞株、内皮:微小血管内皮細胞(HMEC1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3243</td><td>SV40不死化微小血管内皮細胞。750,000細胞/mLのコラーゲンを使用したことに注意してください。</td></tr><tr><td>細胞株、線維芽細胞:真皮ヒト線維芽細胞、成人</td><td>ATCC</td><td>PCS-201-012</td><td>初代真皮細胞。75,000細胞/mLのコラーゲンを使用したことに注意してください。</td></tr><tr><td>細胞株、線維芽細胞:ヒト肺フィラブロ芽球(IMR90)</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td>初代胚細胞。75,000細胞/mLのコラーゲンを使用したことに注意してください。</td></tr><tr><td>細胞株、ケラチノサイト:n/TERT-1</td><td></td><td></td><td>hTERT発現により不死化。N/TERT-1は、ハイグロマイシン耐性を付与するレトロウイルスベクターを用いて作製しました。Dickson et al. 2000によって確立された細胞株。ATCC PCS-200-010またはPCS-200-011と交換できます。コンストラクトごとに170,000個の細胞が使用されたことに注意してください。N/TERT1細胞は、30%コンフルエントなプレートから使用する必要があります-2つの30%コンフルエント90 mm組織培養皿は、十分な細胞を提供します。著者らは、Jim Rheinwald博士とEllen H. van den Bogaard博士に、N/TERT細胞株の寛大な贈り物に感謝します。</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific;Sorvall Legend X1R</td><td></td><td>(標準実験装置)</td></tr><tr><td>計算ソフトウェア</td><td>MATLAB</td><td>MATLAB 2020a</td><td>MathWorks, Natick, MA.</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカTCS SPEII共焦点</td><td></td><td>レーザー走査型共焦点。他の共焦点顕微鏡またはデコンボリューション顕微鏡法に置き換えることができます。</td></tr><tr><td>カバーガラス(22 x 22)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545F</td><td>0.13-0.17 mm No.1 厚さ</td></tr><tr><td>シアノアクリレート瞬間接着剤またはシリコーングリース</td><td>接着剤マスター</td> <td>#THI0102</td><td>接着剤マスター、厚さ、インスタント接着剤、シアノアクリレート; 瞬間接着剤は好ましい</td></tr><tr><td>DMEMメディアベース</td><td>コーニング;Mediatech、Inc</td><td>REF#10-013-CM;ロット#26119007</td><td>DMEM、1X(イーグルの媒体のダルベッコの修飾)、4.5 g / Lグルコース、L-グルタミン&ピルビン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>DMEM / F-12 50/50</td><td>コーニング;Mediatech、Inc</td><td>REF#10-090-CV;ロット#21119006</td><td>DMEM / F-12 50/50、1X(ダルベッコのMod。Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) と L-グルタミン</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Decon Labs</td> <td>#V1101</td><td>(標準ラボ試薬)</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>キャット # FB12999102、ロット # AE29451050</td><td>研究グレード ウシ胎児血清、トリプル 0.1 um 滅菌フィルター</td></tr><tr><td>ファインチップ鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>#11295-00</td><td>デュモン #5 鉗子</td></tr><tr><td>ヒト上皮成長因子(EGFの)</td><td>Peprotech</td><td>Cat # AF-100-15-1MG, Lot # 0318AFC05 D0218</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Alpha Easar</td><td>Lot # 5002F2A</td><td>Made up in DMSO</td></tr><tr><td>Insulin (human)</td><td>Peprotech</td><td>Lot # 9352621</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Light/Phase Contrast Microscope</td><td>VWR</td><td>76317-470</td><td>(標準実験装置)</td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Alfa Aesar</td> <td>#AAJ6178806</td><td>DL-イソプロテレノール塩酸塩、98%</td></tr><tr><td>ケラチノサイト-SFM(1x)培地ベース</td><td>Gibco;ライフテクノロジーズコーポレーション</td><td>REF#:10724-011;ロット#2085518</td><td>ケラチノサイト-SFM(1X);無血清中質</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>キャット#A61-100、ロット#181977、CAS#50-81-7</td><td>結晶性。L-アスコルビン酸は、塩L</td></tr><tr><td>-グルタミン(固体)</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>CAT#BP379-100、LOT#172183、CAS#56-85-9</td><td>L-グルタミン、白色結晶または結晶性粉末</td></tr><tr><td>MCDB 131メディアベース</td><td>Gen Depot</td><td>CM034-050、ロット#03062021</td><td>MCDB 131中ベース、L-グルタミンなし、滅菌ろ過金属</td></tr><tr><td>パンチ</td><td>ソナエンタープライズ(SE)</td><td>791LP、12PC</td><td>中空レザーパンチセット、高炭素鋼、硬度:48HRC;(さまざまなサイズを含む):1/8インチ、5/32インチ、3/16インチ、7/32インチ、1/4インチ、9/32インチ、5/16インチ、3/4インチ、7/16インチ、1/2インチ、5/8:、3/4インチ。このパンチセットも便利ですが、x-actoナイフも使えます。12ウェルトランズウェルVHSEに適した金属パンチのサイズは、3/8インチまたは1/2インチです。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>CAS#67-56-1</td><td>(オプション)。脱水ステップのクリアに。</td></tr><tr><td>サリチル酸メチル</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>O3695-500;ロット#164535;CAS#119-36-8</td><td>(オプション)。クリアリング用。</td></tr><tr><td>マイクロチューブ、1.7 mL</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック・コーポレーション;オリンパスプラスチック</td><td>キャット#24-282;ロット#19467</td><td>1.7 mlマイクロチューブ、透明;耐沸騰性、ポリプロプレン、認定Rnase、Dnase、DNA、PCR阻害剤およびエンドトキシン</td></tr><tr><td>フリーPBS、10倍培養グレードまたはオートクレーブ済み</td><td>APEXバイオリサーチ製品</td><td>Cat # 20-134、ロット# 202237</td><td>PBSバッファー、10倍ドライパック; パックの内容物を容器に加え、1リットルに水を加えて10倍濃縮します。</td></tr><tr><td>PBS、1x培養グレード、(-)カルシウム、(-)マグネシウム</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>Ref # 25-508;ロット#07171015</td><td></td></tr><tr><td>PBS、1x非培養グレードの</td><td>APEXバイオリサーチ製品</td>Cat<td>#20-134、ロット#202237</td><td>PBSバッファー、10xドライパック;パックの内容物を容器に加え、1リットルに水を加えて10倍の濃縮物を生成します。水で1倍に希釈します。&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco;ライフテクノロジーズコーポレーション</td><td>Ref#15140-122、ロット#2199839</td><td>ペン連鎖球菌(10,000ユニット/ mLペニシリン、10,000 ug / mLストレプトマイシン)</td></tr><tr><td>ペトリ皿、ガラス、小さな</td><td>コーニング</td><td>PYREX 316060</td><td>(オプション)。クリアコンテナ</td></tr><tr><td>のシャーレ、100mm</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875713</td><td>PDMSのメイクアップに使用します。</td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン(PDMS)</td><td>ダウコーニング</td><td>GMID 02065622、バッチ#H04719H035</td><td>シルガード184シリコーンエラストマーベース、ダウコーニング、ミッドランド、ミシガン州)</td></tr><tr><td></td><td>ダウコーニング</td><td>GMIDの02065622、バッチ#H047JC4003</td><td>DOWSIL 184、シリコーンエラストマー硬化剤</td></tr><tr><td colspan="4">注:PDMSは通常、ベースと硬化剤の両方のコンポーネントを含むキットとして販売されています。</td></tr><tr><td>容積式ピペット (1000 & 250 uL)</td><td>ギルソン</td><td>1000 uL: HM05136, M1000. 250 uL: T12269L</td><td>M1000 ピペット容量 (100-1000 uL);M250ピペット容量から250 uL</td></tr><tr><td>ポジティブディスプレイスメントチップ/ピストン (1000 & 250 uL)</td><td>ギルソン</td><td>1000 uL: CAT # F148180, BATCH # B01292902S; 250 uL: CAT # F148114, BATCH # B05549718S</td><td>滅菌済みキャピラリーとピストン</td></tr><tr><td>丸型チップスクーピュラ</td><td></td><td></td><td>(オプション、標準的な実験装置) イメージング前のVHSEの操作用</td></tr><tr><td>ケラチノサイト-SFM培地</td><td>用サプリメントギブコ;ライフテクノロジーズコーポレーション</td><td>Ref#37000-015、ロット#2154180</td><td>EGFヒト組換え体(Cat#10450-013)、ウシ下垂体抽出物(Cat#13028-014)</td></tr><tr><td>組織培養プレートインサート、12ウェルサイズ、3&micro;mポアサイズ</td><td>コーニング;Costar</td><td>REF#3462-クリア;ロット#14919057</td><td>トランズウェル;12 mm直径インサート、3.0 umの細孔サイズ、組織培養処理、ポリエステル膜、ポリスチレンプレート、&nbsp;</td></tr><tr><td>組織培養プレート、12ウェルサイズの</td><td>Greiner Bio-one;CellStar</td><td>の猫#665 180;ロット#E18103QT</td><td>12ウェル細胞培養プレート;滅菌済み、蓋付き;製品は無菌で、検出可能なDnase、Rnase、ヒトDNAおよび発熱物質を含まない。内容物 非細胞毒性</td></tr><tr><td>組織培養プレート、60.8cm^2 成長面積</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td>Cat # 25-202;ロット番号:191218-177B</td><td>組織培養皿;治療、成長面積60.8 cm ^ 2;滅菌、Dnase、Rnase、パイロジェンフリー;バージンポリスチレン</td></tr><tr><td>トリトン×100</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>Cat#8698.5-16、ロット#4708R34</td>湿<td>潤剤</td></tr><tr><td>トリプシン0.25%</td><td>コーニング;Mediatech、Inc</td><td>Ref # 25-053-CI</td><td>0.25% Trypsin、2.21 mM EDTA、1x [-] 重曹</td></tr><tr><td>1型コラーゲン ラットの尾から単離</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>56054-1</td><td>Sprauge-Dawley ラットの尾は、Pel-Freezまたは他のサプライヤーから冷凍で購入できます。コラーゲンは尾腱から分離することができます。分離プロトコルの参照 [Cross et al.,2010;ラジャン他、2007;ボーンスタイン、1958] 。あるいは、高濃度ラットテールコラーゲンは、コーニング(カタログ番号:354249)</td></tr><tr><td>真空チャンバー、ベンチトップ</td><td>Bel-Art</td><td>F42010-0000</td><td>(標準実験装置)</td></tr><tr><td>ハンドヘルド精密ナイフ</td><td>X-Acto</td><td>X3311</td><td>(X-Actoナイフはスチールパンチを購入した場合オプション)</td></tr></tbody></table>

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

ヒトの皮膚等価物(HSE)は、ヒト皮膚の表皮および真皮成分をモデル化する組織工学的構造である。これらのモデルは、皮膚の発達、創傷治癒、および接木技術を研究するために使用されてきた。多くのHSEは血管系を欠き続け、構造の容積評価を制限するポストカルチャー組織学的切除を通じてさらに分析される。ここに提示された、血管化されたヒト皮膚同等物(VHSE)を生成するために、アクセス可能な材料を利用する簡単なプロトコルです。さらに説明する、これらの構成体の体積イメージングおよび定量化技術が記載されている。簡単に言えば、VHSEは、真皮および表皮細胞をラットテールコラーゲンI型Iゲルに播種する12のウェル培養インサートで構成される。真皮コンパートメントは、コラーゲンゲル全体に分散した線維芽細胞および内皮細胞で構成されています。表皮コンパートメントは、空気液体界面で分化する角化細胞(皮膚上皮細胞)で構成されています。重要なことに、これらの方法は研究者のニーズに基づいてカスタマイズ可能であり、ヒト皮膚線維芽細胞(hDF)およびヒト肺線維芽細胞(IMR90s)の2つの異なる線維芽細胞タイプを有するVHSE生成を実証する結果がある。VHSEは、共焦点顕微鏡を通じて開発され、4週間および8週間のタイムポイントで計算ソフトウェアを使用して体積的に分析された。容積検査のために、VHSEを固定、染色、画像、およびクリアするための最適化されたプロセスについて説明します。この包括的なモデル、イメージング、および解析の手法は、HSE 経験の有無にかかわらず、個々のラボの特定の研究ニーズに合わせて容易にカスタマイズできます。

このプロトコルの目的は、長期的な培養のためのアクセス可能で簡単な技術を使用して、血管化されたヒトの皮膚同等物の生成および体積分析を記述することです。可能な限り、ステップの根拠は、研究者が研究ニーズに基づいてカスタマイズする能力を可能にするために記述されています。

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

このプロトコルで提供される詳細は、多くの場合、技術的に困難である人間の皮膚同等の生成に対処します。血管系および容積物イメージングなどの新規ヒト皮膚等価プロトコル要素が含まれる。この技術は、疾患、老化およびパーソナライズされた医学の研究のために、インビボ組織とより密接に一致する皮膚モデルの簡単な構築を可能にする。このプロトコルの最も困難な部分は、水中と空気液体界面の間の移行です。一貫した結果を得るためにタイミングとメディアのレベルを最適化するには、いくつかの試行が必要になる可能性があります。まず、冷たいキャップチューブに516マイクロリットルの培地を加え、1000マイクロリットルの正の変位ピペットを使用して375マイクロリットルの冷たいコラーゲンをすぐに加えます。空のピペットチップを取り外し、調製した250マイクロリットルの正変位ピペットに切り替えて混合します。素早く混ぜますが、余分な泡の形成を防ぐために優しく混ぜます。溶液中の先端を保ち、溶液が均質な色になるまでチューブの異なる位置から均一に混合し、通常は約5ピペットサイクルまたは10秒を要する。12ウェル培養インサートの膜上に125マイクロリットルの細胞コラーゲンを直ちに分散させる。均一なカバレッジを確保するには、プレートを傾け、ピペットチップを使用して、コラーゲンを穏やかに広げて膜を塗ります。12ウェルプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに直ちに移動させ、少なくとも20分間ゲル化させます。ゲル化期間の後、インキュベーターから細胞コラーゲンの12ウェルプレートを取り出します。湿った氷から1.7ミリリットルのキャップチューブを取り出し、冷凍からストックコラーゲンを取り出し、蓋を開けた状態で湿った氷の上に置きます。冷たいキャップチューブに冷却されたセルサスペンションの516マイクロリットルを追加します。1000マイクロリットルのピペットを使用して、375マイクロリットルのコールドコラーゲン溶液をキャップチューブ内の溶液に直接直接ピペットします。ピペットからチューブにすべてのコラーゲンを排出し、正の変位ピペットチップを捨てます。すぐに250マイクロリットルのピペットに切り替え、コラーゲン溶液を混合したら混合し、250マイクロリットルの細胞コラーゲン溶液を12ウェル培養インサートの細胞コラーゲン支持体に移し、12ウェルプレートを摂氏37度の細胞培養インキュベーターに移します。30分のゲル時間の後、プレートを軽く傾けてゲル化を評価し、コラーゲンが固化したことを確認します。500マイクロリットルと1000マイクロリットルのブレンドメディアを、挿入物の上部チャンバーと下部チャンバーにそれぞれ加えます。コラーゲンゲルが水没していることを確認し、必要に応じてさらに培地を追加します。ウェルプレートを一晩培養用の細胞培養インキュベーターに入れます。7日目の水中では、手動ピペットを使用して、各コンストラクトの下部と上部のチャンバーからメディアを収集して廃棄します。透過性膜の真下に貼り付けたメディアを収集するには、ピペットチップを膜の下に置き、挿入物を一時的にノックアウトします。各ウェルの下の部屋に5%FPSを補充したヒト皮膚同等物またはHSE培地の1ミリリットルを加え、各ウェルの上部チャンバーに200マイクロリットルの細胞懸濁液を加える。ケラチノサイトを真皮構築面に直接播種し、インキュベーターで2時間落ち着かせる。ケラチノサイトを播種してから2時間後、慎重に300マイクロリットルのHSE培地を添加し、各コンストラクトの上部チャンバーに5%FPSを添加した。媒体をロードした後、コンストラクトをインキュベーターに戻します。手動ピペットを使用して、上部チャンバーからのメディア廃棄物のみを除去することによって、各コンストラクトを空気液体インターフェース(ALI)に持ち上げます。触れたり損傷を与えたりすることなく、表皮層にできるだけ近づけるようにしてください。プレートを異なる角度で傾けてメディアを収集し、一貫した湿度を維持するためにプレート内の周囲の井戸に約2ミリリットルの無菌水を加えます。数時間後にプレートを確認して、角化細胞がまだALIに残っていることを確認してください。上部の部屋のメディアを取り外し、各井戸からどれだけのメディアが取り除かれるかを追跡します。表皮層は乾燥ではなく水分補給に見えるはずですが、構築物の上にメディアをプールしてはいけません。免疫蛍光染色用の構成体を調製するには、インサートを逆さまにして、ウェルプレートの上に置きます。細かい先端鉗子または精密ナイフを使用して膜の円周の約半分を切断しながら、片手で挿入物を安定させる。プラスチックハウジングの近くにできるだけ近く切ります。細かい先端鉗子を使用して、切断された膜のフラップの端をつかみ、VHSE構造と同様に挿入物から多孔質膜を穏やかに剥がします。構造がチャンバーの側面に詰まった場合は、細かい先端鉗子または小さなすくい器を使用して井戸に移動します。VHSEが井戸に入ったら、挿入膜の残りの部分を捨て、染色中にVHSEを水没位置に保持するために各ウェルに培養挿入ハウジングを保持します。イメージングの2日前に、ポリジメチルシロキサンまたはPDMSを調製する。任意のクリーンな混合容器を計量バランスに置き、スケールを切ります。ベースを追加し、クロスリンカーを追加します。溶液を少なくとも4分間激しく攪拌し、小さな泡を作り出します。十分な混合の後、90または100ミリメートルのペトリ皿にPDMSを注ぎます。すべての気泡が消え、PDMSがクリアされるまで、真空チャンバー内のPDMSを脱気します。真空をゆっくりと解放し、PDMSを取り外します。皿をオーブンに入れ、摂氏50~60度で一晩硬化させ、PDMSが均等に治癒するために皿が平らに座っていることを確認します。イメージングの1日前には、VHSE構成体と同じサイズのPDMSシートから円形の井戸をパンチまたは切り取るために、スチールパンチまたはハンドヘルド精密ナイフを使用してください。円形ウェルの周りに正方形のパッチをカットして、単一のPDMSウェルを作成します。PDMSと同様のサイズのガラスカバースリップを使用すると、PDMSの底面にシアノアクリル酸接着剤を追加し、使い捨てのピペットチップで均等に塗ります。ガラスを中央に置き、PDMSに十分に押し込み、パンチされた円の中に透明なガラス窓を残します。接着剤を使用する前に一晩乾燥させてください。表皮および真皮の特性評価は、VHSE構築物におけるヒト皮膚に対して適切な免疫蛍光マーカーを示す。サイトケラチン10は、通常、皮膚同等物のすべてのスラビサル層をマークする初期分化ケラチノサイトマーカーである。インボルクリンおよびフィラグリンは、ケラチノサイトにおける後期分化マーカーであり、皮膚同等物の上層最上の上の分化マーカーである。VHSEをクリアすると、1つの設定で簡単なイメージングが可能になり、真皮と表皮を別々に画像化するために構築物の方向を変更する必要がなくなりました。容積画像を使用すると、各構成体全体で血管構造をマッピングする 3D レンダリングを生成できます。画像スタックは計算ソフトウェアにロードされ、3Dレンダリングと定量化にはカスタムアルゴリズムが使用されました。骨格化は、各コラーゲンIVマーク容器の決定的な中心を決定し、得られたデータは血管径と血管分率を計算するために使用された。この手順に従って、バリア分析、走査型電子顕微鏡、脂質プロファイルなどの特性評価方法を実行して、血管系が表皮成熟および安定性に特異的に及ぼす影響を理解することができる。このプロトコルは、血管化皮膚モデルにおける組織関連および細胞型特異的研究を可能にする。特に老化や個別化医療の研究に適しています。

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Research

JoVE Journal

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自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

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