Name: 菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶ全山解剖法による菌体・円周体・口蓋味覚芽の可視化と分析。マウスモデルを用いて細胞数と神経支配容積を正確に測定し、味覚回路と疾患メカニズムの理解に貢献します。

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カヴィスカ・クルパラナンタは、組織染色と周回味覚芽のイメージングへの貢献、乳頭へのインナーゼーションの染色とイメージングのためのジェニファー・シュー、動物のケアとジェノタイピングのためのカイティー・ホーン、柔らかい口蓋味の芽の組織染色に対するリクン・マに感謝します。このプロジェクトは、R21 DC014857とR01 DC007176からR.F.K、F31 DC017660からL.Oにサポートされました。

著者らは開示するものは何もない。

3つの口腔味覚領域(真菌形態、円周、口蓋)から味覚芽全体を一貫して収集し、染色するアプローチの開発は、味移し細胞を分析し、新たに組み込まれた細胞、インナーブ、およびこれらの構造間の関係を追跡するための重要な改善を提供する。さらに、標識母集団50の内部または外側の両方で潜在的な二次ニューロンマーカーの局在化を促進する。これは、特に、味乳頭が堅牢な体性感覚のインナーヴィス52、53を受け取ることを考えると、いくつかの味覚ニューロンを標識する可能性があることを考えると、特に関連する。乳頭ハウジング味覚芽は、より低い倍率を使用して画像化することもできます。これは、乳頭全体、ならびに味覚芽へのインナーブの視覚化を可能にし、味覚芽および周囲の神経線維に浸透する内インレーションの独立した分析を可能にする。
皮膚の体性感覚神経終末は、毛包の周りの彼らの組織と上皮の他の成分との関係に基づいて区別することができます。乳頭の平行分析は、類似...

味覚芽は、口腔内に存在する化学的味覚刺激のサブセットを結合する50〜100特殊上皮細胞のコレクションである。味移調細胞は、一般に、分子マーカーと相関していた電子顕微鏡基準に基づいて、タイプ1、2、3、4、5、6、7、8、9として存在すると考えられている。II型細胞は、ホスホリパーゼC-β2(PLCβ2)2および一過性受容体電位カチオンチャネルを発現し、サブファミリーMメンバー51および甘味、苦味、及び旨味1、10を透過する細胞が含まれる。III型細胞は炭酸脱水酵素4(Car4)11とシナプトソーム関連タンパク質258を発現し、酸味11に主に反応する細胞を示す。塩分を伝達する細胞は、12、13、14ほど明確に線引いがされていないが、タイプI、タイプII、タイプIII細胞15、16、17、18、19を含む可能性がある。味覚芽環境は複雑で動的であり、味覚伝達細胞が成人期を通じて継続的にひっくり返り、基底前駆細胞3、20、21に置き換えられることを考えると。これらの味伝達細胞は、脳幹に味覚情報を渡す原発性およびペトロサル神経節から擬似単極神経線維に接続する。これらのニューロンは、形態に関する情報が最近までとらえどころが見えなくなっていたため、主に22,23を運ぶ味覚情報の種類に基づいて分類されている。II型細胞はカルシウム恒常性調節薬タンパク質1イオンチャネル25を介して神経線維と通信するが、一方、III型細胞は古典的なシナプス8,26を介して通信する。細胞型系統の導入を含む味覚芽細胞のさらなる特徴付け、それらの分化に影響を与える因子、および連結アーバーの構造は、すべて活発な調査の分野である。
味覚芽の研究は、いくつかの技術的な課題によって妨げられています。舌を構成する異種および緻密な組織は、免疫組織化学27、28、29の抗体透過性を有意に低下させる。これらの障害には、セクション間で味覚芽が分割され、測定が代表的なセクションに基づいて近似されるか、セクション間で合計されるという切片プロトコルが必要です。これまでは、代表的な薄いセクションを使用して、体積値とトランスデューシングセル数30の両方を近似していました。より厚いシリアル断面化は、すべての味覚芽セクションのイメージングと、各セクション31からの測定値の合計を可能にする。このような厚いセクションを切断し、全体の味覚芽を選択すると、小さな味覚芽32、33、34に向かってサンプリングバイアス。切除された味覚芽からの神経の内挿推定値は、ピクセル数13、35の分析に基づいており、36、37、38で定量化した場合。これらの測定値は、アーバーが分割されるため(通常はラベルが不十分)ため、個々の神経アーバーの構造と数を完全に無視します。最後に、上皮を剥がすと味覚芽全体が39、40に染色されますが、味覚芽神経線維を取り除き、細胞間の正常な関係を混乱させる可能性があります。したがって、味覚芽内の構造的関係の調査は、染色アプローチによって引き起こされるこの混乱のために制限されています。
全構造コレクションは、代表的なセクションの必要性を排除し、容積、細胞数、および構造形態41の絶対値測定の決定を可能にする。このアプローチは、精度を高め、バイアスを制限し、技術的な変動性を低減します。味覚芽は、34、42、および領域間で43、44、および全体の味覚芽分析の両方でかなりの生物学的変動性を示すので、この最後の要素は重要であり、完全な細胞数を制御と実験条件の間で比較することができます。さらに、無傷の味覚芽を収集する能力は、異なる形容細胞とそれに関連する神経線維との間の物理的関係の分析を可能にする。味移し細胞は互いに45と通信し、神経線維46と通信することができるので、これらの関係は正常な機能にとって重要である。したがって、機能喪失条件は、細胞の損失によるものではなく、セル関係の変化によるものと考えられます。ここでは、味覚芽とその内因、味覚細胞の数と形状の両方のボリューム分析を精製するための絶対的な測定の利点を達成するために全体の味覚芽を収集し、およびトランスデューシング細胞の関係と神経アーバー形態の分析を促進するための方法を提供します。また、この新しい組織準備のための全型実装方法の下流に提示される:1)味覚芽量と総インナービネーションを分析するための1と2)味覚ニューロンのまばらな細胞遺伝的標識(味覚変容細胞のサブセットを標識)と、その後の味覚神経アーバー形態の分析、味覚細胞型の数とその形状の分析 細胞とその神経樹立。これらのワークフローは、組織の準備と全体の味覚芽の分析とその内側のアーバーの完全な形態に対する新しいアプローチを提供します。

<table><tbody><tr><td>2,2,2-トリブロモエタノール</td><td>ACROS 有機物 AC421430100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>ACROS</td><td>126470025</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab Fragment ロバ アンチウサギ IgG</td><td>ジャクソン免疫研究</td><td>711-007-003</td><td>15.5&mu;L/mL</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>712-605-150</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>AutoQuant X3 ソフトウェア</td><td>&nbsp;メディア サイバネティクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鈍器 エンド フォーセプス</td><td>ファイン サイエンス ツール&nbsp;</td><td>FST 91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT&trade;Plus EdU Cell Proliferation Kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10637</td><td>キットの指示に従ってください&nbsp;</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>マリエンフェルド</td><td>107242</td><td></td></tr><tr><td>サイトケラチン-8</td><td>発生研究ハイブリドーマバンク(DSHB)、(RRID:AB_531826)&nbsp;</td><td>Troma1上清</td><td>(1:50、4°Cで保存;C)</td></tr><tr><td>解剖ハサミ(粗)</td><td>Roboz</td><td>RS-5619</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ(細)</td><td>Moria</td><td>MC19B</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21206</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit、Alexa Fluor&reg; 555</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31572</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>DyLight&trade; 405 AffiniPure Fab Fragment Bovine Anti-Goat IgG</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>805-477-008</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>Fisher Scientific (Superfrost Plus Miscroscope slides)</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Car4</td><td>R&Dシステムズ&nbsp;</td><td>AF2414</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>イマリス&nbsp;</td><td>ビットプレーン&nbsp;</td><td>ピクセルベースの画像解析ソフトウェア</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida 360 + Explorer</td><td>MBF Biosciences</td><td>3Dベクトルベースの画像解析ソフトウェア</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normal Rabbit Serum&nbsp;</td><td>Equitech-Bio, Inc</td><td>SR30</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1000</td><td></td><td>(波長458、488、515のマルチアルゴンレーザー、および543および633</td><td></td>を放出する追加のHeNeレーザー</tr>)<tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>EMD</td><td>PX0055-3</td><td>4% in 0.1M PB</td></tr><tr><td>Rabbit anti-dsRed</td><td>Living Colors DsRedポリクローナル抗体;Clontech Clontech Laboratories, Inc. (632496)</td><td>632496</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>ウサギ抗PLC&beta;2&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Cat# sc-206</td><td>(1:500)</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性無水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP332-500</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウムモノベーシック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP330-500</td><td></td></tr><tr><td>tert-アミルアルコール</td><td>アルドリッチケミカル</td><td>カンパニー8.06193</td><td></td></tr>ティ<tr><td>ッシュモールド電子</td><td>顕微鏡科学</td><td>70180</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュテック&reg;&nbsp;O.C.T.コンパウンド</td><td>さくら</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>BIO-RAD</td><td>#161-0407</td><td></td></tr><tr><td>ゼノン&trade;アレクサフロー&トレード;555ウサギIgGラベリングキット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Z25305</td><td>キットの指示に従ってください&nbsp;</td></tr></tbody></table>

菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

味覚芽は、口腔内の化学刺激のサブセットを検出するために特化した味覚伝達細胞のコレクションです。これらの伝達細胞は、脳にこの情報を運ぶ神経線維と通信します。味覚伝達細胞は成人期を通じて絶えず死んで置換されるため、味覚芽環境は複雑で動的であり、細胞の種類、その位置、およびそれらの間の物理的な関係の詳細な分析を必要とします。詳細な分析は、抗体透過性を著しく低下させた舌組織の不均一性および密度によって制限されている。これらの障害は、測定が近似され、細胞の関係が失われるように、セクション間で味覚芽を分割するプロトコルを切り離す必要があります。これらの課題を克服するために、本明細書に記載されている方法は、真菌形態乳頭、乳頭の乳頭の周り、および口蓋の3つの味覚領域から全体の味覚芽および個々の末端アーバーを収集、イメージング、および分析することを含む。全体の味覚芽を収集すると、バイアスと技術的な変動を減らし、味覚芽のボリューム、総味覚芽のインナレーション、トランスデューシング細胞数、および個々の末端アーバーの形態を含む機能の絶対数を報告するために使用することができます。この方法の利点を実証するために、本論文は、一般的な味覚芽マーカーとすべての味覚繊維のラベルを使用して、真菌形態と味覚芽の間の味覚芽とインナレーション量の比較を提供する。味覚ニューロンのまばらな細胞遺伝的標識(味伝達細胞の標識されたサブセットを有する)の使用のためのワークフローも提供される。このワークフローは、画像解析ソフトウェアを用いて、個々の味覚神経の構造、細胞型数、細胞間の物理的関係を解析します。これらのワークフローは、組織の調製と全体の味覚芽とその内側のアーバーの完全な形態の分析のための新しいアプローチを提供します。

SSRedおよびケラチン-8に対する抗体によるリングアル上皮の染色(一般的な味覚芽マーカー)は、Phox2b-Cre:tdTomatoマウス50,51において味覚芽全体と全味覚芽の内インベーションの両方を標識した(図3A)。毛穴からそのベースにこれらの味覚芽をイメージングすると、最高解像度のx-y平面画像(図3A、B)を与えた。ピクセルベースのイメージングプログラムの輪郭関数を用いて、各セクション(図3B)における味覚芽の周辺を概説し、次いで味覚芽体積を表す表面(図3C)を生成した。表面内のみの味覚芽ラベルに関連する蛍光をマスキング(または複製)は、この蛍光のみを含む新しいチャネルを作成し、味覚芽を隠す乳頭染色を排除した(<strong class="...

本論文では、全体および無傷の味覚芽(それらを内面化する神経線維を含む)を一貫して生み出し、味覚芽内の構造と周囲の乳頭の構造間の関係を維持する全真菌形態、周回、口蓋味覚芽の組織調製、染色、分析の方法について説明する。

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

この全マウント解剖および分析ワークフローは、個々の味覚神経アーバーの完全な形態を分析する新しいアプローチを提供し、細胞型の数を伝達し、細胞間の物理的関係を示す。全体の言語上皮を収集すると、細胞の絶対数と全体の味覚芽内のインナーブの体積を測定することができます。このアプローチは、セクションからのサンプリングに基づくセル構造の推定値よりも正確であり、技術的な変動性を低減します。これはまた、その内インレーションに関連して味覚芽細胞の詳細な分析を提供する最初の方法です。この方法は、味覚芽内の潜在的な回路、ならびに正常な味覚機能を破壊する疾患プロセスおよび化学療法に関する調査を強化することができる。ほとんどの場合、どの構造や関係が中断されるかは不明であるため、これらの要因をすべてそのまま維持することで、単一の準備内のすべての分析が可能になります。最も一般的な間違いは、上皮の下側に十分近い解剖しないことによって上皮を損傷することを避けようとしています。組織の型の組織を凍結する前に、できるだけ多くの下層組織を除去することが不可欠です。また、上皮が組織の金型の底に平らに横たわっていることを確認することも重要です。0.1モルリン酸緩衝液で舌を解凍し、すすいでから始めます。次に、真菌形態乳頭を含む前舌の1/2を、解剖顕微鏡下のガラススライドに置きます。鈍い鉗子および解剖はさみを使用して筋肉を取り除き、リングアル上皮が湾曲しているように組織を開いたままにし、粗い解剖用はさみの刃を上皮に平行に保つことによって組織の平らな配向を保障する。それは味覚芽が含まれているので、舌の腹側非角化上皮を捨てます。その後、角化上皮の下側に近い解剖のために細かい解剖はさみを使用してください。鈍い終わりの鉗子を使用して上皮の一部を組織型に置き、平らに横たわるようにします。その後、最適な切断温度化合物(OCT)の滴を組織に加えます。組織モールドを解剖スコープの下で以前に冷却された金属ベースに置き、OCTが凍結するまで鉗子で組織を軽くタップし続け、組織ができるだけ平らに凍結することを保証する。OCT が凍結したら、すぐに追加の OCT を追加し、冷却した 2-メチルブタンのビーカーに金型を凍結するまで置きます。OCT金型をクライオスタットに取り付け、20ミクロンのセクションに切ります。各セクションを収集し、上皮の基部に近い評価を行うために、それを光顕微鏡の下で見ます。上皮の下側から組織を剃った後、上皮を解凍し、シェーカー上の0.1モルPBで2回する。硬口蓋前を柔らかく硬い口蓋の接合部に切り、その後、軟口蓋を下の組織から分離し、残りの骨片が切り取られ、追加の筋肉および結合組織を除去する。鈍い終わりの鉗子で口蓋を保持し、残りの腺を取り除き、カミソリの刃でそれらを穏やかに掻き取ることによって結合組織を失う。全体の味覚芽およびすべての味覚芽の内インベーションをPhox2b-Cre TdTomatoマウスにおいて、DsRedおよびケラチン8の抗体でリンガル上皮を染色することによって標識した。味覚芽量を測定し、真菌形態または円周測定領域のいずれかで味覚芽量とインナレーション量との間に相関関係を明らかにされなかった。TrkB CreER TdTomatoマウスにおけるタモキシフェンの低用量の投与は、遺伝子組み換えおよび少数のニューロンの標識を引き起こす。全体マウント味覚芽を、炭酸脱水酵素4とホスホリパーゼCベータ2との味転生細胞マーカーで染色した味覚を有する芽を示す。この味覚芽は、繊維を再構築した後に取り除かれた味覚芽で示されている2つのラベル付き端子アーバーを有する。細胞ピクセルベースのイメージングソフトウェアを使用して、神経線維と味のトランスデューシング細胞の間の最も近い近接を決定すると、19の味のトランスデューシング細胞のうち、青色末端アーバーが水色の炭酸脱水酵素4plus細胞の200ナノメートル以内にあったことが明らかになった。緑色のトレースに関連する末端のアーバーはマゼンタで示され、光と濃い青色の両方の炭酸脱水酵素4プラスセルの200ナノメートル以内です。全型ケラチン8および5-エチニル-2'デオキシウリジンまたは真菌形態の味覚芽のEdU染色は、EdU標識細胞が味覚芽の内外に存在していたことを明らかにした。マゼンタと紫の核は、味覚芽のケラチン8プラスボーダーの外側で観察されます。黄色、ティール、青の細胞は味覚芽の中にありました。このプロトコルを試みるとき、組織解剖および凍結ステップは極めて重要である。これらの組織解剖方法は、様々な細胞および構造の染色を行い、味覚芽内と味覚芽の外側の両方の関係を分析するが、乳頭内で行うことができる。これは、味覚芽内の全体の味覚樹ボールの最初の分析だけでなく、味のトランスデューシング細胞との関係です。これらの要素の一部を1つの調製で保存し、染色することで、分析の可能性が広がり、可能な測定が絞り込まれます。

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神経科学

味覚伝達の分子メカニズムの知識は、最近、主な原因動物モデルを使用して、大きな進歩を遂げました。しかしながら、ヒト組織における哺乳類のワラントの研究間の味の感度と特異性の広い多様性。私たちは、人間の舌で乳頭からの生活の味細胞を収集するために生検の手法を説明します。...

人間の舌から茸（味）乳頭を収集する手法

我々は人間の茸状乳頭味細胞の長期培養を分離して維持するための再現可能なプロトコルを開発することを目的とした。生検で得られたヒト茸状乳頭由来の細胞が正常に生存率の低下なしに個以上の通路（12ヶ月）培養で維持した。...

人間の茸状の味覚乳頭細胞の単離および培養

出典: Fowler, B. E., et al.味覚刺激に対するマウス膝状神経節ニューロン応答のin vivoカルシウムイメージングJ. Vis. 経験。(2021年)...

落射蛍光顕微鏡を使用した膝状神経節ニューロン応答の in vivo イメージング

脂肪酸及び食事と脂肪食品の嗜好との関連の経口化学受容、肥満の発展とその理由食生活の変化は、多くの個人のために困難な場合があるとの関与するメカニズムの識別を可能にすることができる。...

オーラル脂肪酸しきい値、脂肪知覚、脂肪食品嗜好、およびヒトにおける乳頭密度を測定

ここでは、デジタル写真から茸状乳頭密度を測定するためのプロトコルを提示します。この方法は、ミラー＆リーディ（1990）による茸状乳頭の元の記述の仕事に優先順位付けし、客観的な特性の測定基準を構築します。...

茸乳頭の客観的な分析のためのデンバー乳頭プロトコル

本発明者らは、味覚コーディングを研究する3つの新しい方法を提示する。単純な動物、 Manduca sexta（ Manduca ）を用いて、解剖プロトコール、複数の味覚受容体ニューロンの活動を記録するための細胞外テロドールの使用、および味物質の正確なタイミングパルスの送達および監視のためのシステムを記載する。...

味覚コーディングを研究する新しい方法

ここでは、共焦点顕微鏡法を用いたマウス二次口蓋融合のライブイメージングのためのプロトコールを提示する。このプロトコールは、様々な蛍光レポーターマウス系統と、および機械的洞察のための経路阻害剤と組み合わせて使用​​することができる。このプロトコールは、他の発生系におけるライブイメージングに適合させることができる。...

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

ここでは、生きた麻酔薬用マウスのジェニュー酸神経節を暴露する方法と、カルシウムイメージングを使用してこれらのニューロンのアンサンブルの応答を測定して刺激を味わう方法を紹介し、異なる覚醒剤を用いた複数の試験を可能にする。これにより、どのニューロンがどのタスタントに反応するかを深く比較することができます。...

マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する

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μTongue:生体内舌用マイクロ流体ベースの機能イメージングプラットフォーム

カルシウムイメージングアプローチにより、覚醒しているハエの脳内で味覚誘発反応を記録し、ラベルに溶液を塗布することができます。 Drosophila melanogaster...

インビボ成体ショウジョウバエにおける味覚誘発性神経応答のカルシウムイメージング

学ぶ全山解剖法による菌体・円周体・口蓋味覚芽の可視化と分析。マウスモデルを用いて細胞数と神経支配容積を正確に測定し、味覚回路と疾患メカニズムの理解に貢献します。

菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析

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