Name: 急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶ急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定法。ラットの前頭前野や海馬を用いた48ウェルプレートアッセイとHPLC-ECDにより、薬理学的条件別の放出動態を解析し、小胞性とトランスポーター媒介性の機構を区別する。

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この作品は、フォンデサイト開始基金N 11191049をJ.A.P.に付与し、NIHはG.E.TにDA038598を付与することによって支援されました。

動物の取り扱いと組織の収集を含むすべての実験は、承認されたプロトコル201508873(UF)と1071(CCNY)に従って、フロリダ大学とニューヨーク市立動物の世話と使用委員会(IACUC)に従って行われました。試薬および緩衝液については 、補足ファイルを参照してください。
1. 急性ラット脳スライスを準備する
注:この実験では、成人雄ラット(250〜350g)を使用しました。しかし、このセットアップは、異なる発達点、雌ラット、および他の種のために機能する。マウスのようなより小さな動物を使用する場合、実験者は、条件ごとに異なる数の脳スライスまたはパンチを使用してプロトコルを最適化するように調整することができる。解剖バッファはバッファ1と呼ばれます。流出バッファーは、バッファー 2 と呼ばれます。
<ol><li>補足ファイルに記載されているとおりに、バッファー 1 を準備します。95%/5%(O2/CO2)を氷上で20分間泡立て、酸素で飽和バッファー1。バッファー1の50 mLを取り出し、小さなビーカーまたはペトリ皿で氷の上で冷やします。このバッファーは、急性収穫全脳を保持するために使用されます。.</li>
	<li>1~2%のイオフルランで1匹または2匹の成虫ラット(250~350g)を麻酔し、ギロチンを使って切断し、脳を迅速に取り除きます。すぐにステップ1.1から容器の中の氷冷酸素化緩衝液1に脳を置く。 注:イオブルランとギロチンが安全に使用されていることを確認してください。ヒュームフードの下にオープンイオブルラン。</li>
	<li>ビブラートメまたはコンプレトムを使用して、対象領域ごとに300μmのコロナ脳切片を切り取ります(図1)。バブリングバッファ1は、セクションが作成されている間に存在する必要があります。ステンレス製のヘラを使用して、慎重かつすぐに氷冷酸素化緩衝液1で満たされた新しいペトリ皿に脳スライスを移します(図2)。</li>
	<li>さらに、ラット脳atlas57を用いて慎重にスライスをガラススライド(図1G)に移動させることにより脳スライス(例えば、パンチ、切り出し)を解剖する。例えば、その暗い、縞状の構造に基づいて、側側線条体を識別し、皮質と独特の螺旋構造への近接性に基づいて海馬を識別します。左右半球は、制御スライスと実験スライスとして使用するために分離されてもよい(図2G-H)。ここで、後回線を2mmのパンチに更に解剖した(図1G)。</li>
	<li>先端を切り落としたプラスチック転写ピペットを使用して、酸素バブリングで酸素化された氷冷バッファー1に浸した小さな容器にスライスまたは脳パンチを移します。これらの容器は、ステンレスメッシュ、またはバッファーで満たされた小さなペトリ皿(図1H)であってもよい。</li>
</ol>2. 脳のスライスまたはパンチからの元生体内因性モノアミン放出
注:このセクションで使用されるデバイスは、48ウェルプレートと、カルボーゲンラインに接続されたインセットフィルタのない6つのマイクロ遠心分離フィルタユニットで構成された組織ホルダーで構成されています(図2)。ホルダーを作るためには、頑丈なプラスチック棒(例えば、セルスクレーパーから)を使用し、それにインセットフィルターなしでマイクロ遠心フィルターユニットをスーパー接着します。1~2日間乾燥させます。内因性モノアミン放出実験に要する時間およびアンフェタミン、フルオキセチンおよびコカインの濃度は、現在の文献および以前のプロトコル13,20,58に基づいている。
<ol><li>
組織活性化
	<ol>
<li>ステップ1.1.5から流出チャンバーの各ウェルに脳組織を移し、一定の穏やかな泡立ちを伴う0.5-1 mLの酸素化緩衝液2のスライドウォーマーで37°Cで30〜50分間回復することを可能にする(図2B1)。</li>
		<li>このインキュベーションの間に、実験のために所望の濃度に薬剤を希釈する。すべての薬物は、バッファー 2 に溶解する必要があり、濃度は、現在の文献に基づいています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
最初のインキュベーション
	<ol>
<li>脳組織を含む組織ホルダーを500 μLの酸素化緩衝液2を含むウェルに移動し、37°Cで20分間インキュベートします。 ホルダーに余分なバッファが入らなくなるまで、ウェルの端にあるホルダーをタップして、バッファを最小限から無くして転送します。</li>
		<li>モノアミントランスポーター阻害剤などの薬理学的薬剤を用いた実験では、酸素化緩衝液2で希釈した薬物で組織サンプルをインキュベートする(例えば、10μMフルオキセチン、40μMコカイン; 図2B2参照)。各ウェルの最終ボリュームは500 μLになります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
第二のインキュベーション
	<ol>
<li>各薬剤の所望の濃度の有無にかかわらず500 μL合計緩衝液2を含む新しいウェルのセットにティッシュとホルダーを移動させる。余分なバッファが残っていないか確認してください。各ウェルは、実験条件のn = 1を表します。各実験条件は三重で行われる。</li>
		<li>1つの井戸には酸素化された緩衝液2、次の10-30 μM AMPHが含まれ、最終井戸には10-30 μM AMPHとモノアミントランスポーター阻害剤が含まれています。各薬剤は、酸素化緩衝液2に溶解される。</li>
		<li>薬物条件の500 μLで37°Cで20分間組織をインキュベートします。 注:追加のウェルは、モノアミントランスポーター阻害剤の有無にかかわらず酸素化高K+ バッファ2を含む可能性があります。各薬剤を酸素化緩衝液2(500μL)に溶解します。</li>
		<li>20分のこの第二のインキュベーションの間に、ステップ2.2.1の最初のインキュベーションからウェルから溶液を集め、1Nの過塩素酸またはリン酸の50 μLを含むマイクロ遠心チューブに移す(HPLCの種類に依存して、最終濃度0.1N)。サンプルの最終容積は550 μLです。</li>
		<li>20分の2回目のインキュベーションの後、脳切片またはパンチを含む組織ホルダーを空の井戸に移動させ、氷の上のプレートを維持します。上清を1Nの過塩素酸またはリン酸の50μLを含むマイクロ遠心分離管に移します。サンプルの最終容積は550 μLです。</li>
		<li>組織を含む各ウェルに氷冷緩衝液1の1mLを加える。小さなピンセットを使用して組織のすべてを収集し、きれいなマイクロ遠心チューブに転送します。</li>
		<li>脳組織を用いたチューブを-80 °Cに維持する。 バッファ1の1mLを捨てます(図2B4)。</li>
		<li>マイクロ遠心分離機フィルターチューブ(0.22 μm)を2,500 x g で各インキュベーションから得たフィルター溶液。この濾液を使用して、電気化学的検出を伴うHPLCを用いてモノアミン含有量を決定します(図2B5)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 組織の生存率
<ol><li>MTTアッセイ 注:この実験的なセットアップに関する重要な懸念は、組織が数時間59まで使用することができるように組織の生存率です。MTTアッセイ60,61は、実験の終わりまでに組織の生存率を決定するために使用される。このアッセイは、適切な代謝を有する生細胞による黄色のテトラゾリウム塩MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イイル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化)の紫色のフォルマザン結晶への変換に基づいています。<ol>
<li>実験後は、組織サンプルの別々のグループを維持し、それらを2つのグループに分けます。</li>
		<li>トリトンX-100で37°Cで1基を20分間インキュベートし、コントロールとして緩衝液2に溶解する。トリトンX-100治療は細胞死をもたらす。第2群を緩衝2内に維持し、トリトンX-100(組織生存率制御)でインキュベートしない。</li>
		<li>0.5 mg/mLの最終濃度に酸素化緩衝液2の両方のグループにMTT(PBSの5mg/mL、pH 7.4)を加えます。</li>
		<li>組織サンプルを37°Cで20分間インキュベートし、PBSで洗浄し、SDS(10%、w/v)、DMF(25%、v/v)、水の混合物250μLを含むマイクロ遠心チューブに移し、フォルマザン結晶を溶解します。</li>
		<li>サンプルを24時間インキュベートする。</li>
		<li>チューブを10,000 x gで10分間遠心し、マイクロプレートリーダーを使用して562 nmおよび690 nmで上清(200 μL)の吸光度を測定します。組織生存率は次のように計算されます: (A562-A690)/組織重量.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. モノアミンのHPLC分析
<ol><li>前のプロトコル13,44に従ってHPLC-ECDを用いて各実験条件からモノアミン放出を定量し、逆相カラムを用いた。<ol>
<li>検出に必要な移動フェーズを準備します。これは、100 mMリン酸、100 mMクエン酸、0.1 mM EDTA-Na2、600 mg/Lオクタンスルホン酸、8%対/vアセトニトリル(最終pH 6.0)で構成されています。移動相の組成は、使用するHPLCおよびカラムの種類によって異なります。</li>
		<li>電気化学検出器(2mmガラス状炭素電極)の電位を0.46Vに設定し、流量を0.05mL/minに設定します。</li>
		<li>各サンプルの5 μLをロードし、自動注入および検出のためにHPLCに神経伝達物質標準を含む。各サンプルの添加量は、使用するHPLCの種類によって異なります。</li>
		<li>HPLCの実行が完了したら、所定のHPLC分析ソフトウェアを使用してクロマトグラフデータを取得および分析します。</li>
		<li>各モノアミンから構成される標準的な曲線を使用してモノアミンの含有量を分析 (ドーパミン: DA, ノルエピネフリン: NE, セロトニン: 5-HT; 図2C)。結果のクロマトグラムを使用して、メーカーのガイドラインに基づいてカーブ(AUC)の下の領域を取得します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. タンパク質定量のための組織のライセートを準備する
<ol><li>
タンパク質アッセイ
	<ol>
<li>脳切片/パンチを含む各マイクロ遠心分離管に氷冷リシスバッファーとプロテアーゼ阻害剤(0.1 g/1 mL)を加え、害虫ホモジナイザーを使用してホモジナイズします。マイクロ遠心チューブは、タンパク質の分解を防ぐために均質化しながら氷の上に維持する必要があります。</li>
		<li>4 °Cで1時間、軽い回転で組織の均質化をインキュベートする。</li>
		<li>遠心分離機組織は、4°Cで15分間16,000xgで均質化し、上清を回収する。</li>
		<li>上清中のタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン(BSA)を標準として定めます。</li>
		<li>各脳サンプル中のモノアミン含有量を、脳組織の 250 μL で測定したタンパク質の総含量(μg)に正規化します。以下の式を使用して、nmolモノアミン/gタンパク質を決定します。df = 希釈係数。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62127/62127eq01.jpg">
6. 統計分析
<ol><li>一方向のANOVAを使用してモノアミン放出(nmol/g)を分析し、続いてシダックの多重比較テストを行い、ポストホック比較を行います。</li>
	<li>独立したグループのための非対の学生の t検定を使用して組織の生存率を分析します(コントロール対1%Triton X-100)。</li>
	<li>すべての統計分析で、アルファレベルを 0.05 ≤に設定します。</li>
</ol>

著者は開示を持っていません。

モノアミン放出測定は、異種細胞、神経細胞培養、脳シナプトソーム、エキソウビボ急性脳スライス、および動物全体で長年にわたって行われてきた13,20,41,42,58,64,65,66,67,68.このような調製物は、モノアミンが役割を果たす神経疾患および精神疾患のための新しい薬理学的薬剤の発見につながる可能性のある基本的な神経伝達物質放出機構を探求する神経科学の分野を可能に...

多くの神経疾患および精神疾患は、単アミン神経伝達物質(ドーパミン[DA]、セロトニン[5-HT]、ノルエピネフリン[NE])恒常性1,2,3の調節不全または不十分な維持に関連している。これらの状態は、うつ病1、2、統合失調症2、不安2、中毒4、更年期5、6,7、疼痛8、およびパーキンソン病3を含むが、これらに限定されない。例えば、更年期のいくつかのラットモデルは、海馬、前頭前野、線条体内のモノアミンの調節不全または減少が、更年期障害を経験している女性に見られるうつ病と認知機能の両方に関連している可能性があることを示している。これらのモデルにおけるモノアミンの調節異常はHPLC-ECDを用いて広範囲に検討されてきたが、この研究は測定された神経伝達物質の含有量と神経伝達物質の放出を区別しなかった5,6,7.モノアミンは、Ca2+依存性のvesicular release9を介して古典的に細胞外空間に放出され、それぞれの原形質膜再取り込みシステム(ドーパミントランスポーター、DAT;セロトニントランスポーター、SERT;ノルエピネフリントランスポーター、NET)10,11を介してリサイクルされる。逆に、アンフェタミン(AMPH)や3,4-メチレンジオキシメタンフェタミン(MDMA)などの乱用薬がトランスポーターシステムを介してDAおよび5-HTをそれぞれ放出することが知られているため、これらのトランスポーターはモノアミンを放出または流出させ得ることを示唆している。.したがって、モノアミン放出ダイナミクスの適切な機械学的理解は、特定の標的薬物療法を開発するために重要である。
高速スキャン環状ボルタンメトリー(FSCV)18、生体内マイクロダイアルシス13、イメージング19、放射性標識モノアミン20のプレインキュベーション、光遺伝学、さらに最近では遺伝子組み換え蛍光センサーとフォトメトリクス21,22などのモノアミン放出を研究するために幅広い技術が採用されています。.FSCVおよび生体内マイクロ透析は、モノアミン放出の研究に使用される主要な技術である。FSCVは、急性脳スライスおよびin vivo23におけるDAを中心に刺激された興奮性放出を研究するために使用される。FSCVは電極を使用して放出を刺激または誘発するため、神経伝達物質放出の主な原因はCa2+依存性の小胞放出18、24、25、26、27、28、29、30、31である.生体内のミクロジアル症とHPLCを併用すると、関心のある脳領域に配置されたプローブを用いて細胞外神経伝達物質レベルの変化を測定する13,32。FSCVと同様に、生体内のミクロジアルシスに対する大きな制限は、神経伝達物質放出源の決定における困難である:Ca2+依存性の小胞放出またはトランスポーター依存性である。注目に値する、両方の方法は、モノアミン放出の直接測定を可能にする。光遺伝学の最近の進歩を通じて、研究は、絶妙な細胞型特異性21,22と短い時間スパンでの5-HTおよびDA放出の検出を実証する。しかし、これらの戦略は、複雑で高価な技術と機器を必要とし、間接的にモノアミン放出を測定し、特に受容体にモノアミン結合を介して。また、放射線標識モノアミンは、モノアミンのダイナミクスの研究にも使用されます。放射性標識モノアミンは、各モノアミントランスポーター20、33、34、35、36、37、38、39、40、一次ニューロン20、シナプトソーム33、39、41、異種細胞などの様々なモデルシステムにプリロードされ得る、42、および急性脳スライス43,44。しかし、放射能は実験者に潜在的な害をもたらし、トリチウム標識された検体は内因性モノアミンダイナミクス45,46を忠実に再現しない可能性がある。HPLC-ECDなどのオフライン検出法と組み合わせたスーパーフュージョンシステムは、複数の組織源からのモノアミンの検出を可能にしました。ここでは、このプロトコルは、急性脳スライスを使用して、内因性基底および刺激されたモノアミン放出を直接測定するための最適化された低コスト、シンプル、および正確な方法として提供される。
急性脳スライスは、主に生体内の解剖学的微小環境を維持し、無傷のシナプス47,48,49,50,51,52を維持するため、機械学的仮説をテストすることを可能にする。いくつかの研究では、急性脳スライスまたは切り刻まれた脳組織は、Ca2+媒介放出53,54,55,56を刺激するためにKClを使用したスーパーフュージョン技術と組み合わせて使用されてきた。超灌流システムは、モノアミンを含む神経伝達物質放出機構の分野の理解を進めるために重要であった。しかし、これらのシステムは比較的高価であり、組織分析に利用可能なチャンバーの数は4〜12の範囲です。これに対し、ここで提示する方法は安価であり、48の組織サンプルの測定を可能にし、そして96までの組織サンプルを使用するように精製され得る。48ウェルプレート内の各ウェルには、フィルターを使用して放出された製品を組織から分離する組織ホルダーが含まれ、放出されたモノアミンをHPLC-ECDによって収集して分析します。重要なことに、この方法は、モノアミン放出を調節する薬理学的薬剤による治療後に、前頭前野、海馬、および後方線条体などの異なる脳領域からの5-HT、DA、およびNE放出の同時測定を可能にする。これにより、実験者は、試験するサンプル数を増加させ、使用する動物の数を減らす安価なマルチウェルシステムを用いて複数の質問に答えることができる。

<table><tbody><tr><td>48ウェルプレート</td><td>NA</td><td>NA</td><td>アッセイ</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A998-1</td><td>移動相</td></tr><tr><td>塩化カルシウム 無水</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>修飾人工脳脊髄液 OR 排出バッファー</td></tr><tr><td>クラリティソフトウェア</td><td>Anetc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>移動相</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>Sigma</td><td>1002608421</td><td>解剖バッファー</td></tr><tr><td>DMF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4551</td><td>MTT アッセイ</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>移動相</td></tr><tr><td>GraphPad ソフトウェア</td><td>Graphpad Software, Inc</td><td></td><td>統計分析</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SigmaAldrich</td><td>H3375</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>HPLC、10 年アンペロメトリック</td><td>Anetc</td><td></td><td>HPLC、LC-EC システム</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Amuza</td><td></td><td>HPLC HTEC-510.</td></tr><tr><td>L-アスロビック酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5960</td><td>解剖バッファー</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma</td><td>7487-88-9</td><td>KH バッファー</td></tr><tr><td>微量遠心分離機用フィルターユニット UltraFree</td><td>Millipore</td><td>C7554</td><td>Assay - 6 to fit in 48 well plate</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Thermo Fisher</td><td>M6494</td><td>MTT Assay</td></tr><tr><td>Nanosep</td><td>VWR</td><td>29300-606</td><td>Assay; protein assay</td></tr><tr><td>オクタンスルホン酸</td><td>Σ Aldrich</td><td>V800010</td><td>移動相</td></tr><tr><td>Pargylineクロロハイドレート</td><td>Σ Aldrich</td><td>P8013</td><td>修飾人工脳脊髄液OR排出緩衝液</td></tr><tr><td>リン酸</td><td>Σ Σ Aldrich</td><td></td>移動<td>相</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Σ</td><td>12636</td><td>KH緩衝液</td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Σ</td><td>1001655559</td><td>KHバッファー</td></tr><tr><td>プレシソナリーVF-21-0Z</td><td>プレシソナリー</td><td></td><td>コンプレストーム</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>P2714</td><td>溶解バッファー。</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S5761</td><td>解剖バッファー</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>S5761</td><td>解剖バッファー</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td></td><td>Σ S3014</td><td>KH バッファー</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td>溶解バッファー</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>MTT アッセイ / 溶解バッファー</td></tr></tbody></table>

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

A Plate-Based Assay for the Measurement of Endogenous Monoamine Release in Acute Brain Slices

モノアミン神経伝達物質は、多数の神経疾患と精神医学的疾患に関連付けられている.このような状態の動物モデルは、モノアミン神経伝達物質の放出および取り込みダイナミクスの変化を示している。電気生理学、高速スキャン環状ボルタンメトリー(FSCV)、イメージング、生体内ミクロジアル、光遺伝学、または放射能の使用などの技術的に複雑な方法は、モノアミン機能を研究するために必要とされる。ここで紹介する方法は、モノアミン放出を調べる組織ホルダーを含む48ウェルプレートを用いて急性脳スライス中のモノアミン放出を検出するための最適化された2段階のアプローチであり、モノアミン放出測定のための電気化学的検出(HPLC-ECD)と組み合わせた高性能液体クロマトグラフィーである。簡単に言えば、前頭前野、海馬、および側頭線を含む目的の領域を含むラット脳切片は、組織スライサーまたはビブラートームを用いて得られた。これらの関心領域は、脳全体から解剖され、酸素化された生理学的緩衝液中にインキュベートされた。実験時間を通じて、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム(MTT)アッセイによって生存率を調べた。急性解剖された脳領域は、トランスポーター(アンフェタミン)を介してモノアミン放出を誘導することが知られている様々な薬物条件で、またはexocttic小胞体放出(KCl)の活性化を通じてインキュベートされた。インキュベーション後、上清中の放出物を収集し、HPLC-ECDシステムを介して分析した。ここで、基礎モノアミン放出は、急性脳スライスからHPLCによって検出される。このデータは、AMPHおよびKClがモノアミン放出を誘導することを示すインビボおよびインビトロの結果をサポートする。この方法は、モノアミン輸送体依存性放出に関連するメカニズムを研究するのに特に有用であり、迅速かつ低コストでモノアミン放出に影響を及ぼす化合物をスクリーニングする機会を提供する。

この技術は、内部組織ホルダーを備えた48ウェルプレートに基づく電気化学的検出を用いたHPLCを用いた内因性モノアミンの放出を測定するための脳スライスの使用を説明する。実験用セットアップは 図1 および 図2に示されている。最初に、実験の終わりまでに組織の生存率を確保するために、MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-yl)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物、テトラゾール)アッセイを行った。機能的実験の後、急性脳スライスは代謝活性であり、細胞死の状態である1%Triton X-100でインキュベートされたものと比較して生存可能であり続ける(図3)。
急性,20分,AMPHを用いた海馬および前頭前野の脳切片の治療は,各モノアミンの細胞外レベルの有意な増加を誘発する(<...

急性脳スライスを用いた内因性モノアミン放出の検出に関する簡単な手法を紹介する。セットアップはモノアミン放出のためのティッシュホールダーを含んでいる48ウェル版を使用する。放出されたモノアミンは、HPLCによって電気化学的検出と結合して分析される。さらに、この技術は、創薬のためのスクリーニング方法を提供する。

Monoamine neurotransmitters are associated with numerous neurologic and psychiatric ailments. Animal models of such conditions have shown alterations in ...

この技術は、モノアミン放出を調べるための一般的に使用される方法の適応であり、一度に複数の薬理学的条件下で予め放射性標識モノアミンを予め取り付けせずに内因性放出の測定を可能にする。この技術の主な利点は、それがかなり費用対効果が高く、複数の薬理学的条件を一度に調べることができ、そして、我々は、静脈とトランスポーター媒介放出を区別する能力を有する内因性モノアミン放出を研究することができるということです。収穫後に成人250から350グラムの雄ラットの脳スライスを調製するために、すぐに脳と氷を冷た酸素化解剖バッファーに置き、対象領域ごとに300ミクロンのコロナ脳切片を獲得した。脳スライスのさらなる解剖のために、慎重に組織をガラススライドに移動し、ラット脳アトラスを使用して、暗い線条体構造に基づいて裏線条体を識別し、皮質とそのユニークなスパイラル構造への近接性に基づいて海馬を識別する。コントロールスライスと実験スライスとして使用するために、左右半球を分離します。また、後回り線条体をさらに2ミリメートルのパンチに解剖することができる。次に、修正されたチップを備えたプラスチックトランスファーピペットを使用して、酸素バブリングで酸素化された氷冷解剖バッファーに浸した小さな容器にサンプルを移します。モノアミン放出を誘導するには、一定の穏やかな泡立ちで1ウェルあたり0.5から1ミリリットルの流出バッファーを含む48ウェル流出チャンバーをカスタムメイドの各ウェルに組織サンプルを移し、サンプルが摂氏37度で30〜50分間回復することを可能にする。平衡期間の終わりに、脳組織を含む組織ホルダーを、薬理剤の有無にかかわらず500マイクロリットルの酸素化流出緩衝バッファーを含むウェルに移動し、ウェルの端にあるホルダーをタップして、摂氏37度で20分間のウェル間の緩衝液の最小限の移動を防ぎます。インキュベーションの最後に、関心のある薬物の有無にかかわらず500マイクロリットルの流出バッファーを含む新しいウェルセットにホルダーを移動し、さらに20分間プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。第2インキュベーション中に、1回のインキュベーションから氷上の1つの正常な過塩素酸またはリン酸の50マイクロリットルを含むマイクロ遠心分離チューブに、第1インキュベーションから溶液を移す。 そしてチューブナンバーワンにラベルを付ける「2回目のインキュベーションの終わりに、組織ホルダーを氷上のプレートと一緒に空の井戸に移動し、上清を2番目のインキュベーションから、通常の過塩素性またはリンの50マイクロリットルを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。氷の上の酸。これらのチューブ番号2にラベルを付ける"上清のすべてが転送されたら、組織の各ウェルに氷冷解離バッファーの1ミリリットルを追加し、各組織サンプルを新しいマイクロ遠心チューブに移すために小さなピンセットを使用します。サンプルチューブからバッファーを取り出し、組織をマイナス80°Cで保存し、収集したインキュベーション溶液をマイクロ遠心分離用フィルターチューブに移して遠心分離し、HPLC分析まで氷の上に濾液を置きます。ECD と流量の可能性をモノアミンの検出に関するメーカーの推奨に設定します。各サンプルの負荷と適切なアリコートは、自動注入および検出のためのHPLCへの神経伝達物質の標準を含み、測定器が分析を完了することを可能にする。次に、HPLC解析ソフトウェアを使用して、各モノアミンで構成される標準曲線を使用してクロマトグラフデータを取得および分析し、メーカーのガイドラインに基づいて曲線下の領域を取得します。6時間の機能分析の後、組織サンプルは生存可能であり、1%Triton X-100でインキュベートされたサンプルはMTT変換の有意な減少を示す。アンフェタミンを伴う海馬および前頭前野の脳切片の急性20分治療は、各モノアミンの細胞外レベルの有意な増加を誘発する。サンプルがフルオキセチン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤で前処理されると、アンフェタミンは海馬内および前頭前野の細胞外セロトニンの増加を誘発し、細胞外ドーパミンおよびノルエピネフリン産生の増加は影響を受けない。さらに、アンフェタミンによるドーサル線条体パンチの急性20分間の治療は、細胞外ドーパミンレベル発現の35倍の増加を誘発し、一方、コカインによるドーサル線条体パンチ治療、モノアミントランスポーターブロッカー、アンフェタミン誘導細胞外ドーパミンの有意な阻害をもたらす。膜脱分極を誘発するために塩化細胞外カリウムの濃度を高めることは、未処理の対照条件と比較してモノアミンの外皮放出を誘導するのに十分であり、フルオキセチンもコカイン処理もこの深い分極化を誘発しない。クリーンカットセクション、パンチの正確な局在化を持ち、実験全体を通して一貫した酸素化を維持することが不可欠です。脳切片は、ウェスタンブロッティングやヒストロジーなどのさらなる生化学的処理および分析のために実験後に使用することができる。

a-plate-based-assay-for-measurement-endogenous-monoamine-release

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ドーパミンは、はっきりとドーパミンニューロンの細胞体と樹状突起を含む脳核、で規制されています。ここでは黒質（SN）とげっ歯類では腹側被蓋野（VTA）の中​​脳核のドーパミン調節では、結果を最大化するために解剖し、サンプル処理のアプローチを説明し、その結果、結論と洞察力。...

黒質や腹側被蓋野のドーパミン規制の包括的なプロファイリング

このビデオでは、代謝的に活性なex...

試験薬物曝露時の脳切片からのモノアミン放出を測定するためのプレートベースアッセイ

このビデオは、マウス脊髄切片のニューロンネットワーク活動を研究するための微小電極アレイベースのアッセイを示しています。まず、スライスの表在性後角(SDH)からの電気生理学的活動が記録されます。次に、カリウムチャネル阻害剤を導入して脱分極を延長し、ニューロンネットワーク全体で同期したリズミカルな活動をもたらします。...

微小電極アレイを用いたマウス脊髄切片における神経回路の評価

このビデオは、マウスの脳から採取したシナプトソームにおけるドーパミン取り込みの評価を示しています。ドーパミントランスポーターを介したドーパミン取り込みのためのシナプトソームの調製、さまざまな濃度の放射性標識ドーパミンでシナプトソームを治療する手順、シナプトソームを単離する手順、およびドーパミン取り込みを定量化するための放射能の測定手順を概説します。...

放射性標識ドーパミンを用いたマウス脳シナプトソームのドーパミン取り込みの測定

神経細胞の膜輸送を動的に原形質膜タンパク質の可用性と大幅に影響を与える神経伝達を制御します。今日まで、成体ニューロンにおけるニューロンのエンドサイトーシス輸送を測定するために挑戦してきた。ここでは、急性の脳切片における表面タンパク質発現のex vivoでの急速な変化を測定するための非常に効果的な、定量的な方法を記載している。...

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

ここでは、トニックおよび酵素結合微小電極アレイ（MEA）を使用して、in vivoで相性の細胞外グルタミン酸変化を測定の空間的及び時間的に正確な方法のセットアップ、ソフトウェアナビゲーション、およびデータ分析を記載しています。...

アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

シナプトソーム ドーパミンやドーパミン ・ トランスポーターの機能と線条体組織中ドパミンのレベルを評価することによりマウスにおけるドーパミン恒常性を調査するため高速液体クロマトグラフィー分析を表す実験ツールそれぞれ。ここでドーパミン組織量を測定、ドーパミン ・ トランスポーターの機能を評価するプロトコルを提案する.

高速液体クロマトグラフィー分析とシナプトソーム ドーパミンによるマウスにおけるドーパミン作動性恒常性の評価

我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ...

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

酸素消費率(OCR)は、ミトコンドリア機能の一般的なプロキシであり、さまざまな疾患モデルを研究するために使用することができます。我々は、シーホースXF分析装置を用いて、成体マウスの急性線条体切片のOCRを直接測定する新しい方法を開発した。...

成体マウスの急性線条体スライスにおける酸素消費率の測定

ここでは、相補型金属酸化膜半導体高密度微小電極アレイシステム(CMOS-HD-MEA)を使用して、 ex vivo...

相補型金属酸化物半導体高密度微小電極アレイシステムによる急性脳切片からの高品質発作様活性

学ぶ急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定法。ラットの前頭前野や海馬を用いた48ウェルプレートアッセイとHPLC-ECDにより、薬理学的条件別の放出動態を解析し、小胞性とトランスポーター媒介性の機構を区別する。

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

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