急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ
2021年8月11日
急性脳スライスを用いた内因性モノアミン放出の検出に関する簡単な手法を紹介する。セットアップはモノアミン放出のためのティッシュホールダーを含んでいる48ウェル版を使用する。放出されたモノアミンは、HPLCによって電気化学的検出と結合して分析される。さらに、この技術は、創薬のためのスクリーニング方法を提供する。
この技術は、モノアミン放出を調べるための一般的に使用される方法の適応であり、一度に複数の薬理学的条件下で予め放射性標識モノアミンを予め取り付けせずに内因性放出の測定を可能にする。この技術の主な利点は、それがかなり費用対効果が高く、複数の薬理学的条件を一度に調べることができ、そして、我々は、静脈とトランスポーター媒介放出を区別する能力を有する内因性モノアミン放出を研究することができるということです。収穫後に成人250から350グラムの雄ラットの脳スライスを調製するために、すぐに脳と氷を冷た酸素化解剖バッファーに置き、対象領域ごとに300ミクロンのコロナ脳切片を獲得した。
脳スライスのさらなる解剖のために、慎重に組織をガラススライドに移動し、ラット脳アトラスを使用して、暗い線条体構造に基づいて裏線条体を識別し、皮質とそのユニークなスパイラル構造への近接性に基づいて海馬を識別する。コントロールスライスと実験スライスとして使用するために、左右半球を分離します。また、後回り線条体をさらに2ミリメートルのパンチに解剖することができる。
次に、修正されたチップを備えたプラスチックトランスファーピペットを使用して、酸素バブリングで酸素化された氷冷解剖バッファーに浸した小さな容器にサンプルを移します。モノアミン放出を誘導するには、一定の穏やかな泡立ちで1ウェルあたり0.5から1ミリリットルの流出バッファーを含む48ウェル流出チャンバーをカスタムメイドの各ウェルに組織サンプルを移し、サンプルが摂氏37度で30〜50分間回復することを可能にする。平衡期間の終わりに、脳組織を含む組織ホルダーを、薬理剤の有無にかかわらず500マイクロリットルの酸素化流出緩衝バッファーを含むウェルに移動し、ウェルの端にあるホルダーをタップして、摂氏37度で20分間のウェル間の緩衝液の最小限の移動を防ぎます。
インキュベーションの最後に、関心のある薬物の有無にかかわらず500マイクロリットルの流出バッファーを含む新しいウェルセットにホルダーを移動し、さらに20分間プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。第2インキュベーション中に、1回のインキュベーションから氷上の1つの正常な過塩素酸またはリン酸の50マイクロリットルを含むマイクロ遠心分離チューブに、第1インキュベーションから溶液を移す。 そしてチューブナンバーワンにラベルを付ける「2回目のインキュベーションの終わりに、組織ホルダーを氷上のプレートと一緒に空の井戸に移動し、上清を2番目のインキュベーションから、通常の過塩素性またはリンの50マイクロリットルを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。氷の上の酸。これらのチューブ番号2にラベルを付ける"上清のすべてが転送されたら、組織の各ウェルに氷冷解離バッファーの1ミリリットルを追加し、各組織サンプルを新しいマイクロ遠心チューブに移すために小さなピンセットを使用します。
サンプルチューブからバッファーを取り出し、組織をマイナス80°Cで保存し、収集したインキュベーション溶液をマイクロ遠心分離用フィルターチューブに移して遠心分離し、HPLC分析まで氷の上に濾液を置きます。ECD と流量の可能性をモノアミンの検出に関するメーカーの推奨に設定します。各サンプルの負荷と適切なアリコートは、自動注入および検出のためのHPLCへの神経伝達物質の標準を含み、測定器が分析を完了することを可能にする。
次に、HPLC解析ソフトウェアを使用して、各モノアミンで構成される標準曲線を使用してクロマトグラフデータを取得および分析し、メーカーのガイドラインに基づいて曲線下の領域を取得します。6時間の機能分析の後、組織サンプルは生存可能であり、1%Triton X-100でインキュベートされたサンプルはMTT変換の有意な減少を示す。アンフェタミンを伴う海馬および前頭前野の脳切片の急性20分治療は、各モノアミンの細胞外レベルの有意な増加を誘発する。
サンプルがフルオキセチン、選択的セロトニン再取り込み阻害剤で前処理されると、アンフェタミンは海馬内および前頭前野の細胞外セロトニンの増加を誘発し、細胞外ドーパミンおよびノルエピネフリン産生の増加は影響を受けない。さらに、アンフェタミンによるドーサル線条体パンチの急性20分間の治療は、細胞外ドーパミンレベル発現の35倍の増加を誘発し、一方、コカインによるドーサル線条体パンチ治療、モノアミントランスポーターブロッカー、アンフェタミン誘導細胞外ドーパミンの有意な阻害をもたらす。膜脱分極を誘発するために塩化細胞外カリウムの濃度を高めることは、未処理の対照条件と比較してモノアミンの外皮放出を誘導するのに十分であり、フルオキセチンもコカイン処理もこの深い分極化を誘発しない。
クリーンカットセクション、パンチの正確な局在化を持ち、実験全体を通して一貫した酸素化を維持することが不可欠です。脳切片は、ウェスタンブロッティングやヒストロジーなどのさらなる生化学的処理および分析のために実験後に使用することができる。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この研究は、急性脳切片を用いて内因性モノアミン放出を検出する技術を提示します。この方法は、HPLCと電気化学的検出を組み合わせ、様々な薬理学的条件下でのモノアミンダイナミクスの調査を可能にし、医薬品発見と神経科学研究を支援します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 薬理学
- 電気化学
背景
- モノアミン放出の理解は、医薬品発見と神経心理学的研究にとって重要です。
- 既存の方法は主に事前にロードされた放射性標識モノアミンに依存していましたが、この技術はその点を改善しています。
- 内因性放出の調査は、脳内の神経伝達物質ダイナミクスについての洞察を提供します。
- この方法により、複数の薬理学的条件を同時に調査することができます。
研究の目的
- 内因性モノアミン放出を検出するための効果的な方法を確立すること。
- 小胞性放出とトランスポーターを介した放出を区別すること。
- 神経伝達物質ダイナミクスに対する薬理学的効果の研究を促進すること。
使用された方法
- 急性脳切片は成体のオスラットから調製されます。
- モノアミン放出を分析するために、電気化学的検出を備えたHPLCが使用されます。
- 重要なステップには、慎重な切片、回復期間、バッファーの取り扱いが含まれます。
- 薬理学的作用剤を使用して、それらがモノアミン放出に与える影響をモニタリングします。
主な結果
- この技術は、アンフェタミンのような刺激物に対する細胞外モノアミンレベルの増加を実証します。
- 様々な薬理学的作用剤で、セロトニン、ドーパミン、ノルエピネフリンレベルに異なる効果が見られました。
- モノアミン放出に対する塩化カリウムの影響など、重要な機能的洞察が強調されました。
- この方法の検証により、急性薬物治療が神経伝達物質ダイナミクスを大きく変化させる可能性があることが示されています。
結論
- この方法により、モノアミン放出ダイナミクスの堅牢な調査が可能となり、神経伝達物質機能の理解が進みます。
- 神経薬理学における医薬品発見の取り組みのための汎用的なプラットフォームを提供します。
- 神経細胞メカニズムとそれらの様々な神経生理学的モデルや疾患モデルにおける意味についての知識を強化します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reliable quantification of endogenous monoamine release in acute brain slices addresses a critical need for mechanistic de-risking in neuropsychiatric drug discovery. This plate-based assay enables multiplexed pharmacological interrogation, supporting predictive confidence in target validation and early-stage compound screening. Its cost-effective, high-throughput design enhances portfolio triage and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of endogenous monoamine release under diverse pharmacological conditions.
- Distinguishes between vesicular (exocytotic) and transporter-mediated release mechanisms for mechanistic clarity.
- Supports functional target validation and biological de-risking in neuropsychiatric research.
- Facilitates predictive confidence in pathway interrogation and compound mechanism-of-action studies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain slice systems for downstream compound screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible monoamine release data suitable for assay standardization.
- Enables simultaneous evaluation of multiple pharmacological agents in a 48-well format.
- Supports scalable, cost-effective screening for transporter and exocytosis modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neurochemical endpoints observed in animal models of psychiatric disorders.
- Provides translational continuity from in vitro mechanistic studies to in vivo validation.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking compound effects to endogenous neurotransmitter dynamics.
- Supports biomarker alignment for preclinical candidate selection when relevant.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical validation, enabling robust hypothesis testing and compound triage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of monoamine release pathways and mechanistic de-risking.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible brain slice platforms for quantitative compound evaluation.
- Analytics: Delivers sensitive HPLC-ECD readouts for direct comparison of pharmacological conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo neurochemical endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, scalable platform for ongoing neuropharmacology and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes monoamine release measurement with high reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuropsychiatric candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in brain dissection, tissue handling, and neurochemical analysis.
- Needs access to HPLC-ECD instrumentation and validated analytical protocols.
- Demands rigorous cross-team standardization for tissue preparation and assay execution.
- Adaptable across brain regions and pharmacological conditions with careful localization and viability monitoring.
- Dependent on consistent oxygenation and precise anatomical identification for reproducible results.
