Name: 組織組織の血栓溶解性の有効性と溶解薬を測定するインビトロシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学ぶ histotripsyを用いた血栓溶解療法の評価法。バブル活動による線維素溶解と赤血球溶血を強化し、深部静脈血栓症の非侵襲的治療効果をin vitroで検証する手法です。

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この研究は、国立衛生研究所、グラントR01HL13334によって資金提供されました。著者らは、ドラブキンのアッセイを支援してくれたケビン・ハワース博士と、プロトコルの設計を支援してくれたヴィクトル・ボレン博士に感謝したいと考えています。著者らはまた、ヒストトリップシーソースの設計に関する彼の指導のためにアダム・マクスウェル博士に感謝しています。

著者らは開示するものは何もない。

提案されたプロトコルは、リソトリップスの治療効果を定量化するモデルを提示する。重要な詳細については説明しましたが、このプロトコルの成功には、いくつかの重要な側面を考慮する必要があります。rt-PAの酵素活性は、アレニウス温度依存性30を有する。温度は水や組織の音速にも寄与する要因であり、温度の変化は焦点域の幾何学的形状のわずかな変化を引き起こす可能性があります。したがって、水温は37°Cで慎重に調整する必要があります。プロトコルで使用されるrt-PAの用量(2.68 μg/mL)は、他の薬力学的血栓切除戦略42のために臨床的に採用されたものと一致する。ステップ5.8では、30mLのプラズマがリザーバに移され、35mLアリコートがステップ3.1.3に記載されている。この追加のプラズマは、大気圧に平衡させるために37°Cに加えた時間の経過に伴う蒸発によるプラズマの損失を占めています。
焦点距離、絞り幅、および治療トランスデューサの周波数は、焦点領域のサイズと深さを決定します。したがって、トラ...

血栓症は、循環を妨げる健康な血管における血栓形成の状態である。静脈血栓塞栓症の医療費は年間7~100億ドルで、米国では375,000-425,000例です。肺塞栓症は肺動脈の閉塞であり、静脈血栓塞栓症の最も深刻な結果である。肺閉塞の主な原因は深部静脈血栓症であり、主に腸骨静脈セグメント4、5、6からである。深部静脈血栓症(DVT)は、痛み、腫れ、足の潰瘍、および四肢切断7、8、9をもたらす長期的な合併症を有する肺閉塞以外に固有の後遺症を有する。重大な閉塞の場合、カテーテル指向血栓溶解薬(CDT)は、血管再カナル化10の最前線のアプローチである。CDTの結果は、血栓の年齢、場所、サイズ、組成、病因、および患者リスクカテゴリ11を含む多くの要因に依存します。さらに、CDTは、血管損傷、感染症、出血合併症、および長時間の治療時間10と関連している。次世代デバイスは、血栓溶解薬(すなわち、薬力学的血栓切れ)12,13と機械的血栓切れを組み合わせることを目指す。これらの装置の使用は、出血合併症の減少につながる薬用量を低くし、かつCDTと比較して治療時間12、13、14を短縮した。これらのデバイスは、依然として出血性の副作用や慢性血栓15の不完全な除去の問題を保持しています。したがって、より低い出血合併症で血栓を完全に除去できるアジュバント戦略が必要です。
考えられるアプローチの1つは、リソトリップシーと呼ばれるヒストトリップ補助血栓溶解治療です。ヒストトリップスは、組織16の気泡雲を核とするために焦点を当てた超音波を使用する非侵襲的な治療モダリティである。気泡活性は外因性核を介して生成されるのではなく、血栓17、18を含む組織に固有の核を活性化するのに十分な緊張を有する超音波パルスの適用によって生成される。気泡雲の機械的振動は、血栓に歪みを与え、構造を無細胞の破片19に崩壊させる。ヒストトリップスバブル活性は、インビボおよびin vitro20、21、22の両方で、引き込まれた血栓と引き込みられていない血栓の効果的な分解を提供する。以前の研究では、23,24は、組織虫と組換え組織型プラスミノーゲン活性化剤(rt-PA)の組み合わせが、単独または組織単独と比較して治療効力を有意に増加させることが実証された。ヒストトリップスバブル活性に関連する2つの主要なメカニズムが改善された治療効果の原因であると仮定される:1)改善されたリンパ球の送達による線維化症の増加、および2)血栓内の赤血球の血糖分解。血栓質量の大部分は赤血球24で構成され、したがって、赤血球分解を追跡することは、サンプルのアブレーションのための良好な代理である。他の形成された血栓要素も、ヒストトリップスバブル活性下で崩壊する可能性が高いが、このプロトコルでは考慮されない。
ここでは、リソトリップスでインビトロでDVTを治療するためのベンチトップアプローチについて概説する。プロトコルは、ヒストトリップス源の重要な動作パラメータ、治療有効性の評価、および画像ガイダンスについて説明する。このプロトコルには、腸骨静脈セグメントを模倣する流路の設計と、ヒト全血栓の製造が含まれる。実験手順は、流路に配置された血栓に沿ってヒストトリップス露光を達成するために、ヒストトリップス源およびイメージングアレイの位置を概説する。血栓破壊を達成し、オフターゲットバブル活性を最小限に抑えるための関連インソネーションパラメータが定義されている。バブル活動の誘導および評価のための超音波画像の使用は24を例示する。血塊損失、D-二量体(線維化症)、およびヘモグロビン(血化)などの治療効果を定量化するための指標は、23、24、25、26、27を概説する。全体として、この研究は、DVTを治療するためのリソトリップシーの有効性を実行し、評価するための効果的な手段を提供する。

<table><tbody><tr><td>吸収シート</td><td>精密音響</td><td>F28-SMALL-M</td><td>300mm x 300 mm x 10 mm</td></tr><tr><td>ホウケイ酸パスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1367820A</td><td>長さ 14.6 cm、容量2 mL</td></tr><tr><td>遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22364111</td><td>容量1.5 mL</td></tr><tr><td>ドラブキンアッセイ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D5941-6VL</td><td></td></tr><tr><td>ドローシリンジ</td><td>コールパー</td><td>マーEW-07945-43</td><td>60mL容量</td></tr><tr><td>フィルターバッグ</td><td>マクマスターカー5162K111</td><td></td> 1<td>ミクロンまでの粒子サイズを除去</td></tr><tr><td>流路チューブ</td><td>マクマスターカー5154K25</td><td></td><td>ポリエチレンライニングEVAプラスチックチューブ(外径:3/8インチ、内径:1/4インチ</td></tr> <tr><td>発熱体</td><td>ウォンブラザーズ</td><td>HT 300チタン</td><td>ロッド タンクの底に置かれたチタンロッド</td></tr><tr><td>イメージングアレイ</td><td>ベラソニックス</td><td>L11-5v</td><td>128エレメント、感度は-55〜-49dB</td></tr><tr><td>低ゲル化アガロース</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>モデル容器</td><td>マクマスターカー</td><td>5234K98</td><td>長さ6.6cm、内径0.6cm、厚さ1mm</td></tr><tr><td>ナノ純水</td><td>バーンステッド</td><td>ナノピュアダイヤモンド</td><td>ASTMタイプI、18Mohm-cm抵抗率</td></tr><tr><td>プラズマ</td><td>Vitalant</td><td>4PF000</td><td>プラズマは24時間以内に凍結</td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Biotek</td><td>Synergy Neo HST プレートリーダー</td><td>ヘモグロビン定量用</td></tr><tr><td>プローブカバー</td><td>Civco</td><td>610-362</td><td></td></tr><tr><td>プログラミングプラットフォーム</td><td>MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>組換え組織型プラスミノーゲンアクチベーター (rt-PA)</td><td>ジェネンテック</td><td>アクティバーゼ</td><td></td></tr><tr><td>リザーバー</td><td>コールパーマー</td><td>EW-07945-43</td><td>60mL容量</td></tr><tr>シ<td>リンジポンプ</td><td>コールパー</td><td>マーEW-74900-20</td><td>ポンプをシリンジに取り付け、あらかじめ決められた速度で流路の流れを吸い込む</td></tr><tr><td>トランスデューサ</td>ー <td>社内でカスタマイズされた</td><td></td><td>8エレメント、楕円形に焦点を合わせたトランスデューサー(長軸9cm、短軸7cm、焦点距離6cm)、カスタム設計・造られたクラスDを搭載アンプとマッチングネットワーク</td></tr><tr><td>超音波スキャンシステム</td><td>ベラソニックス</td><td></td><td>バンテージ 研究用超音波システム</td></tr><tr><td>水タンク</td><td>高度なアクリル</td><td>C133</td><td>14 x 14 x 12, 1/2"</td></tr></tbody></table>

組織組織の血栓溶解性の有効性と溶解薬を測定するインビトロシステム

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

深部静脈血栓症(DVT)は世界的な健康上の懸念事項です。臨界閉塞の血管再カナル化を実現する第一のアプローチは、カテーテル指向血栓溶解薬(CDT)です。苛性副作用と CDT に関連する長い治療時間を軽減するために, アジュバントと代替アプローチが開発中です。.そのようなアプローチの1つは、気泡雲核形成を介して組織をアブラレートする集中超音波療法であるヒストトリップシーである。前臨床試験は血栓分解のためのヒストルシーと血栓溶解薬の間の強力な相乗効果を実証した。本報告書は、組織虫補助血栓溶解療法、またはリソトリップスの有効性を評価するためのベンチトップ法を概説する。
新鮮なヒト静脈血から製造された血栓は、その寸法およびアクロスメカニカル特性が腸骨静脈を模倣する流路に導入された。チャネルは、血漿およびリコンビナント組織型プラスミノーゲン活性化剤と浸透した。バブル雲は、大腿静脈血栓の治療のために設計された焦点を当てた超音波源を有する血栓に生成された。電動ポジショナーは、血栓の長さに沿ってソースフォーカスを変換するために使用されました。各インソネーション位置では、バブル雲からの音響放出を受動的に記録し、受動的キャビテーション画像を生成するためにビーム形成された。治療効果を測定するための指標には、血栓質量損失(全体的な治療効果)、およびパーフューズ動物中のD-二量体(線維化症)およびヘモグロビン(血糖化)の濃度が含まれていた。このインビトロ設計には、生体内の副作用を評価する手段の欠如や血栓のlysesとしての流量の動的変化を含む制限があります。全体として、このセットアップは、DVTを治療するためのヒストトリップシーベースの戦略の有効性を評価するための効果的な方法を提供する。

本研究で概説されているプロトコルは、DVTのインビトロセットアップにおける静脈血栓モデリング、血栓破壊のためのリソトリップ、および超音波イメージングの詳細を強調している。採用された手順は、rt-PAとヒストトリップスバブルクラウド活動の組み合わせによる血栓破壊を評価するために必要な手順を示しています。ベンチトップのセットアップは静脈の腸骨静脈の特徴を模倣するように設計されていた。 図1A は、骨位静脈の音響、機械的、幾何学的特性を有するモデル容器を示す。血栓は、部分的に閉塞性血栓を模倣するためにモデル容器の中に配置されます。血栓は0.65 mL/minの速度で貯留層から引き出される血漿およびrt-PAと浸透する。この速度は、非常に閉塞した容器34における遅い流量と一致する。
楕円的に集線型のトランスデューサは、9cmの長軸、7cmの短軸、および6cmの焦点距離を有する1.5MHz基本周波数(図2A)が<strong ...

肝トリプシー支援溶解性分娩またはリソトリプシーは、深部静脈血栓症の治療のために開発中である。この併用療法の有効性を評価するために、インビトロの手順をここに提示する。血栓モデル、画像ガイダンス、および治療有効性の評価のための主要なプロトコルについて議論する。

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

このプロトコルは、重要な深部静脈血栓症を治療するための代替非侵襲的アプローチである、肝細胞性助診血症またはリソトリップスの作用の有効性および作用メカニズムを評価するためのベンチトップ法を提供する。この技術は、気泡活性を使用して、血栓内の増加した滑液送達および赤血球の血化による線維化症の増加による双方向効果を有する。深部静脈血栓症を治療するためのこのベンチトップアプローチは、血栓のモデリング、リソトリプシーによる治療、および治療中の同時イメージングを容易にする。バブルクラウド生成、治療計画、画像誘導は、腎臓腫瘍や肝臓腫瘍などの他の疾患のインビトロ組織ストリップベースの治療法をさらに調査するために使用することができます。ヒストトリップのソースを設定するには、モーターを使用したポジショニングシステムにソースを取り付けます。イメージングアレイをプローブカバーで覆い、ヒストトリップのソースの開口部にアレイを同軸で固定します。画像アレイを超音波スキャンシステムに接続し、タンク内のヒストトリップスソースとイメージングアレイを完全に水没させます。シリンジを使用して気泡を静かに取り除き、イメージングアレイとスキャナを使用して、毎秒20フレームで脱気Bモードの水画像を取得します。画像を取得しながら、共焦点トランスデューサの開口部内の撮像アレイの位置を、泡雲が画像ウィンドウの中心に位置し、検出された焦点位置を撮像ウィンドウに記録します。その後、インソネーションを中止し、ヒストトリップのソースに印加される電圧をゼロに設定します。分析用の血栓を調製するには、プライヤーを使用して血栓を含むピペットの密閉された端部を切断し、血栓と血清をシャーレにスライドさせます。メスを使用して血栓を1センチメートルの長さにカットし、クリーニングワイプを使用してカットセクションを静かにブロットして余分な液体を取り除きます。ピンセットを使用して、凝固器のセクションを慎重にスケールに配置し、重量を記録します。次に、脱気逆浸透水タンクから流路を手動で上げ、チャネルからモデル容器を取り外します。ピンセットを使用して、血栓を損傷することなく慎重にモデル容器に血栓を配置し、船を流路に取り付けます。貯蔵所に対するステージの近位端が遠位側に比べて低くなるようなタンクに流路を下げ、ピペットを使用して37°Cの加温プラズマを30マイクロリットルの加温したプラズマを貯留槽に加える。水タンクの温度を少なくとも摂氏36度に達するまで監視し、ピペットを使用して80.4マイクログラムのrt-PAをプラズマ貯留層に加えます。流路を盛り付けるには、シリンジポンプを使用して、モデル容器が満杯になるまで、貯留層からチャネルにプラズマを引き込みます。次に、モデル容器を手動でレベル設定して、イメージングウィンドウ内に見られるように、モデル容器に気泡が存在しないようにします。血栓の長さに沿って均一なヒストトリップス露光のためのヒストトリップス源とイメージングアレイのパスを計画するには、イメージングスクリプトを使用して、血栓の長さに平行なイメージングアレイを位置合わせし、容器内に気泡がないことを確認します。電動ポジショナーを使用して、イメージング平面が血栓の断面に平行になるようにイメージングアレイを位置合わせします。イメージングウィンドウをガイドとして使用して、リザーバに対して、近位の血栓の端部にヒストトリップのソースを移動します。血栓の長さに沿ったインソネーション パスを決定するには、血栓の長さに沿ったウェイポイントを 5 ミリずつ設定します。各ウェイポイントを確定する前に、ヒストトリップスソースからの火災テストパルスは、実証済みと同じインソネーションパラメータを使用しますが、全体的な露出は合計10パルスに減少しました。各ウェイポイントで、製造元が指定したコマンドを使用してモーターの位置を保存します。前処理ステップで定義された経路に従って血栓をその長さに沿って治療するには、注射器ポンプを毎分0.65ミリリットルに設定し、プラズマの半月板が動くのを待ちます。確立されたウェイポイント間の中間ステップを含む処理パスを固定ステップサイズで補間し、ポジショナーを使用して、元々設定されたインソネーションパラメータを使用して、各パス位置でヒストトリップソースを移動します。次に、各場所でヒストトリップパルスを適用する数秒前に、血栓とモデル容器のBモード画像を取得するようにイメージングアレイを設定するスクリプトを作成します。その後、各ウェイポイントでヒストトリップパルスを適用し、スクリプト内の音響放出を取得して、解析後に受動的キャビテーション画像を形成します。イメージングウィンドウを使用して、各パス位置でのヒストトリップスパルスの適用中にバブルのアクティビティを画像化します。解析後、モデル容器を水槽から手動で上げて、重力によってパーフューズを排出し、シリンジポンプを使用して流路からプラズマ溶液を引き出し、小さなビーカーにパーフューザート全体を収集できるようにします。モデル容器を外し、血栓を取り外します。その後、ラボ組織で血栓を拭き、血栓の重量を量って血栓質量損失を評価します。ヒストトリップス源に十分な電圧を印加すると、トランスデューサの焦点領域に気泡雲が生成され、超音波画像を介して可視化される。焦点位置は、バブル雲の中心として定義されます。この対照は、プラズマ単独に曝露された血栓の透過物、およびリソトリプシー処理血栓のこのパーフューズトを、実証されるようにヘモグロビンおよびD二量体含有量を評価するために使用された。ヘモグロビン濃度のばらつきは、光学吸光度によって定量することができる。ここでは、組織上の露出の前にBモードイメージングを介してモデル容器内で血栓を可視化し、受動キャビテーション画像のセグメンテーションのための血栓位置を決定することができる。血栓のBモード画像と共に登録されたこの受動キャビテーション画像が確認したように、音響エネルギーは、ヒストリシー暴露の間に主に血栓内に含まれる。ヒストトリップに曝露されたサンプルでは、破壊は主に血栓中心に限定され、受動的キャビテーションイメージングを介して追跡された気泡活動の観測位置と一致する。リティックの添加により、塊の損失は血塊の周囲に近い領域でも起こる。あるいは、rt-PAを含むエコゲンリポソームを全身性rt-PA送達の代わりに使用して、血栓への標的薬物送達の評価を可能にすることができる。リソトリップシーは、多くの疾患の治療に代替非侵襲的アプローチを提供する。このin vitroプロトコルは、インビボアプリケーションにおける治療の有効性とその潜在的な成功の評価を可能にする。

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