Name: エコHIV脳感染症のラットモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶEcoHIVラットモデルによるHIV脳感染症の神経行動学的研究法。マイクログリア標的化とシナプス機能評価により、HIV関連神経認知障害のメカニズム解明に貢献します。

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この研究は、NIH助成金HD043680、MH106392、DA013137、およびNS100624によって資金提供されました。

すべての動物のプロトコルは、サウスカロライナ大学の動物ケアと使用委員会によって見直され、承認されました(連邦保証番号:D16-00028)。6人の成人男性F344/Nラットは、12/12光の下で制御された環境に収容されたペアでした:食物および水へのアドリビタムアクセスを伴う暗いサイクル。すべての動物は、実験動物のケアと使用のためのガイドで国立衛生研究所によって確立されたガイドラインを使用して世話をされました。
1. 293 FT細胞でのウイルス包装
<ol><li>293 FT細胞(5×105/mL)をゼラチンで75cm2フラスコをDMEMプラス10%FBS11で培養する。37°Cで細胞を成長させ、トランスフェクションで50%コンフルエントにする。</li>
	<li>22.5 μLのトランスフェクション試薬(例えば、リポフェクタミン3000)を750μLの培地(例えばOpti-MEM)に1.5 mLのマイクロ遠心分離管および渦に3 s用に希釈する。</li>
	<li>1.5 mLマイクロ遠心分離チューブで750μLの培地で20μgのEcoHIVプラスミドDNAを希釈し、よく混ぜます。</li>
	<li>希釈したトランスフェクション試薬のチューブに希釈したDNAを加え、穏やかに混ぜます。室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>75cm2 フラスコに10mLの温め込みDMEM培地を加えます。37°Cで2日間細胞をインキュベートする。</li>
	<li>収穫し、パッケージレンチウイルスを含む2つのフラスコから条件付き培地の24 mLを組み合わせます。</li>
	<li>遠心分離機は、条件培地の全24mLを500xgで4°Cで10分間10分間行う。 明確化した上清を滅菌50mLチューブに移します。</li>
	<li>レンティx濃縮器8mLと24mLの清澄上清(1:3比)を組み合わせます。優しい反転で混ぜます。4°Cで2日間インキュベートする。</li>
	<li>遠心分離機混合物を1,500xgで4°Cで45分間混合した。 上清を慎重に取り除いてください。</li>
	<li>100 mM PBS の 100 μL でペレットをゆっくり再中断します。</li>
	<li>P24 ELISAキットを用いるチターウイルス濃度。</li>
</ol>2. エコHIV-EGFPウイルスステレオタキシック手術
<ol><li>3%セボフルランを使用してラットを麻酔します。ラットが有害な刺激に反応せず、反射神経が存在しない場合は、ステップ2.2に進みます。</li>
	<li>脳領域から毛髪を剃り、70%エタノールとクロルヘキシジンベースのスクラブで皮膚を2回殺菌します。立体装置の中で、ラットを起こしやすい位置に固定します。</li>
	<li>頭皮の中線に沿って皮膚を通して切開(5〜6cm)を作ります。</li>
	<li>2つの掘削位置を0.8 mm横に、1.2 mmのロストラルをブレグマにマークします。各頭蓋骨の位置に穴(直径0.4mm)をドリルします。</li>
	<li>10 μL 注射注射シリンジで、Titered EcoHIV レンチウイルス溶液 (1.04 × 106 TU/mL) を充填します。ステレオタキシック装置に注射器を固定します。</li>
	<li>穴の穴の表面に近い針を下に移動します。測定し、深さ2.5ミリメートルを移動します。</li>
	<li>0.2 μL/min の速度で 1 μL のウイルス溶液を注入します。注射領域の中に針を5分間置いておきます。針がラットの頭蓋骨の外になるまでゆっくりと上に移動します。</li>
	<li>4-0シルク糸で皮膚を縫合します。</li>
	<li>切開を70%エタノールで1回殺菌します。皮下にブトルフェノールを注入する(ドロレックス、0.1mg/kg体重)。</li>
	<li>ラットが目を覚ますまで加熱パッド付きの回収室に移します。</li>
</ol>3. 脳の切り分けの可視化
注:EcoHIVウイルス注入後1~8週間お待ちください。
<ol><li>5%セボフルランでラットを麻酔します。ラットが有害な刺激に反応せず、反射神経が存在しない場合は、ステップ3.2に進みます。</li>
	<li>ヒュームフードの中の上の位置にネズミを固定します。</li>
	<li>胸部中線に沿って皮膚を切開します。横隔膜を切り、胸腔を開きます。</li>
	<li>20G×25mmの針を左心室に挿入します。</li>
	<li>すぐにはさみで右心房を開きます。</li>
	<li>5mL/minの速度でプレチル100mMPBSの50mLをパーフューズします。</li>
	<li>5 mL/min の割合で 100 mL の冷たいパラホルムアルデヒドをパーフューズします。</li>
	<li>ラットを切断し、頭皮を開き、脳を取り除きます。</li>
	<li>4%パラホルムアルデヒドで一晩後置。</li>
	<li>脳が底まで浮くまで脳を30mLチューブで100mM PBSで30%スクロースの40 mLに移します(約3日間)。</li>
	<li>スナップは、メチルブタノールで脳を2分間凍結します - 80°C。</li>
	<li>-20 °Cクライオスタット内の金属プラットフォーム上の脳組織を固定します。</li>
	<li>クライオスタットを使用して、厚さ50μmのコロナセクションをカットします。</li>
	<li>細かいブラシでガラススライドに脳のスライスを転送します。</li>
	<li>0.3 mLのアンチフェード媒体でセクションを取り付け、22 mm 50 mmカバーリップでカバーします。</li>
	<li>ガラスのスライドを室温で乾燥するまで暗闇の中に保管してください。</li>
	<li>脳領域の境界とニューロンの形態学的特徴に基づいてZスタックを使用して、共焦点顕微鏡で標的ニューロンを画像化します。 注意:使用される共焦点顕微鏡の設定は、60 X(A / 1.4、油)の倍率、および488nmの波長を使用して0.15 μm(ピンホールサイズ30 μm;バック投影ピンホール半径167nm)のZ平面間隔でした。</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

著者の誰も宣言する利害の対立を持っていません。

このプロトコルでは、ラットにEcoHIV誘導HIV感染モデルを確立した。具体的には、注射後7日のラット脳における活性HIV感染を誘導することに成功した皮質へのEcoHIVの二国間立体態注入について述べた。Futhermore, 我々はラットのEcoHIV感染が手の重要な側面を研究するための良好な生物学的システムであり得ることを実証する。8週間後- EcoHIV感染, ラットは、重要な神経認知障害を示しました, NAcのMSNにおける時間処理およびシナプス機能不全の変化を含む.ニューロHIVとHAND2の研究のための動物モデルの重要性を考えると、新しい生物学的システムの開発は、分野内の新しい質問に対処するために有利である可能性があります。ポタッシュら3 は、マウスで活性HIV-1感染を誘導するためにEcoHIVの使用を最初に報告した。具体的には、マウスを尾静脈注射3を介してEcoHIVウイルスの0.1mLの溶液を接種した。感染から6週間後、脾臓細胞およびリンパ球でHIV-1ウイルスDNAが検出され...

生物学的システムは、HIV-1関連神経認知障害(HAND)とその基礎となる神経機構2に関する我々の理解を高めている。特定の研究に最も適した生物学的システムを決定することは、しばしば関心の問題に依存する2.宿主動物モデルの範囲の限界は、HIV-1疾患の発症の研究に挑戦する。HIV-1ウイルス複製および病因を調べるため、Potash et3は、HIV表面エンベロープ糖タンパク質のコード領域を置換する活性HIV-1感染のマウスモデルを作成し、gp120を、エコトロピックMLVgp80に置き換え、マウス4におけるウイルス複製に成功した。キメラHIV(EcoHIV)マウスにおける尾静脈注射後、HIV-1血清陽性個体(例えば、感染したリンパ球およびマクロファージ)に似た多くの特徴が認められ、抗ウイルス免疫応答、および炎症3、5、6を標的とした。
マウスとラットはどちらもムリダエのメンバーですが、基本的な種の違いは、特定の実験問題に対するそれらの適合性に影響を与える可能性があります7.したがって、ラットへのEcoHIV感染モデルの拡張(一般的に薬物乱用および神経認知障害の研究で使用される)は、ニューロHIVの研究において有利であろう。例えば、その大きなサイズは、薬物自己投与手順のためのより実用的な8のための頸状カテーテル移植を行う。ラットにおける薬物自己投与技術は、HIV-19における動機づけに利用されている。さらに、多くの神経認知/行動タスクは、最初はラット10のために設計されました。ここでは、ラットにおけるEcoHIVの立体的注射の利用を報告し、EcoHIV感染モデルを拡張し、ニューロHIVおよびHANDに関連する新しい質問に対処する重要な機会を与える。

<table><tbody><tr><td>293FT細胞</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤溶液</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatゼラチン 75cm&sup2;ベントキャップ付き長方形傾斜ネック細胞培養フラスコ</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン、4.5 g / Lグルコース、ピルビン酸ナトリウム付きコーニングDMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラスVWR</td><td></td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>ドリル<tr><td>デュモン#5鉗子</td><td>ワールド精密機器</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #7 鉗子</td><td>ワールド プレシジョン インスツルメンツ</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ スナップキャップ マイクロ遠心分離機 バイオプール セーフロックチューブ</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>エチコン ビクリル プラス 抗菌、4-0 ポリグラクチン 910 縫合糸、27インチ。FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Hamilton</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルス関連p24 ELISAキット</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X コンセントレーター</td><td>宝</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元血清中</td><td>寿命技術</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>定位固定装置</td><td>Kopf Instruments</td><td>モデル 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12-550-154%</td><td></td></tr><tr><td>Vannas はさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

エコhiv脳感染症のラットモデル

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

EcoHIV感染マウスモデルは、HIV関連の神経学的合併症を調査する上で重要な有用性を有することがよく研究されている。薬物乱用および神経認知障害の研究のためのEcoHIV感染ラットモデルの確立は、神経HIVおよびHIV-1関連神経認知障害(HAND)の研究において有益であろう。本研究では、キメラHIV(EcoHIV)を用いた活動性HIV感染のラットモデルの作成に成功したことを実証する。まず、EcoHIVのレンチウイルス構築物を、培養293 FT細胞に48時間包装した。次いで、条件付き培地を濃縮し、力を入れた。次に、F344/Nラット脳組織へのEcoHIV-EGFPの両側立体態注射を行った。感染の1週間後、EGFP蛍光シグナルが感染した脳組織で検出され、EcoHIVがラットに活性HIV感染を誘導することに成功したことを示している。また、ミクログリア細胞マーカーに対する免疫染色を、Iba1、実施した。結果は、ミクログリアがEcoHIVを収容する主要な細胞型であることを示した。さらに、EcoHIVラットは、感染後8週間に、HANDの潜在的な神経行動メカニズムおよびシナプス機能障害である時間処理に変化を示した。全体として、本研究は、HIV-1感染のEcoHIVモデルをラットに拡張し、脳内のHIV-1ウイルス貯留層ならびにHANDおよび薬物乱用などの関連する併存疾患を研究するための貴重な生物学的システムを提供する。

このコンディション培地は、293FT細胞に感染したEcoHIV-EGFPのレンチウイルスから採取した。次に、濃縮し、力を合わせた後、F344/Nラットの脳(皮質領域)に立体的に注入した。注射後7日間、ラットを屠殺し、ブレグマ5.64mmからブレグマ-4.68mmまでのコロナ脳スライスから画像を撮影した。 図1Aでは、脳全体、特に皮質および海馬歯状の歯素回に有意なEcoHIV-EGFPシグナルがある。さらに、Iba1とEcoHIV-EGFPプローブによるデュアルラベリングは、ミクログリアが脳内のEcoHIV発現を有する主要な細胞型であるという強力な証拠を提供した(図1B)。特に、EcoHIV-EGFPの分布パターンは、ラット脳におけるミクログリアの相対的な局所濃度(すなわち、海馬の皮質およびデンテート回)と一致する。
その後の研究では、ラットにおけるEcoHIV感染の有用性を検証し、手のひらの主要な側面をモデル化した。上記のプロトコルを用いて、F344/NラットはE...

ここでは、キメラHIV(EcoHIV)を用いた活性HIV感染の新しいラットモデルを確立するプロトコルを提示し、脳内のHIV-1ウイルス貯留層の理解を深め、HIV関連神経認知障害および関連する併存疾患(すなわち薬物乱用)を研究するシステムを提供するために重要である。

エコHIV脳感染症のラットモデル

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

ラットを使用して、このプロトコルは、キメラHIVを使用してアクティブHIV感染の新しいモデルを確立するために使用することができます。ラットでは、薬物乱用と神経認知障害の研究のためのEcoHIV感染モデルの確立は、神経HIVおよびHIV-1関連神経認知障害の研究に有益であり得る。デモンストレーションの手順は、私の研究室の研究員であるハイロン・リーです。ウイルスを293個のT細胞に包み込む場合、2つのゼラチンコーティングされた75平方センチメートルのフラスコのそれぞれに10%FBSを加えたDMEMのミリリットル当たり10〜5倍の293個のT細胞を種子化し、培養物が50%合流するまで37度で細胞を培養する。トランスフェクションの日に、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに750マイクロフラスコの培地で22.5マイクロリットルのトランスフェクション試薬を希釈し、溶液を3秒間渦巻く。キメラEcoHIVプラスミドDNAの20マイクログラムを250マイクロリットルの培地で20マイクログラム希釈し、フラスコ当たり1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブを完全に混合します。希釈したDNAと希釈トランスフェクション試薬を穏やかな混合と組み合わせ、得られた溶液を室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、各ウイルス懸濁液を10ミリリットルのプリウォームDMEM培地に加え、各ウイルス補充溶液を293個のT細胞の1フラスコに加える。2日間の細胞培養の後、遠心分離のためにフラスコから上澄み液を1本の50ミリリットルの円錐管に溜め、浄化された上清を新しい50ミリリットルチューブに移す。透明化された上清に8ミリリットルのLenti-Xコンセントレータを加え、穏やかな反転と混ぜます。摂氏4度で2日間のインキュベーションを行った後、混合物を遠心分離し、慎重に上清を取り除き、100ミリモルPBSの100マイクロリットルでペレットを静かに再中断し、P24 ELISAキットを使用してウイルス濃度を引き立てる。EcoHIV-EGFP注射の場合、ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、脳領域から髪を剃り、70%エタノールとクロルヘキシジンベースのスクラブで露出した皮膚を2回殺菌する。立体的な装置でラットを起こしやすい位置に固定し、頭皮の正中線に沿って皮膚を通して5〜6センチメートルの切開を行います。1つの掘削位置を0.8ミリメートル横に、1つの1.2ミリメートルのロストラルをブレグマにマークし、各頭蓋骨の位置で直径0.4ミリメートルの穴を開けます。10マイクロリットル注射器に1ミリリットル当たり6ミリのトランスダクションユニットに1.04倍をロードし、ステレオタキシック装置に注射器を固定します。針を1つの穴の表面に近づけ、針を2.5ミリリットルの穴に差し込みます。1分間に0.2マイクロリットルのウイルスの速度で1マイクロリットルのウイルス溶液を注入する。すべてのウイルスが注入されたら、注射領域の中に針を5分間残してから、ゆっくりと針を引っ込めて、ラットの頭蓋骨の外に出るまで引き込みます。4-0シルク糸縫合糸で皮膚切開を閉じ、溶液を70%エタノールで殺菌し、ラットを回復室に入れ、再発まで監視する加熱パッドを付けます。ウイルス注入後1~8週間、ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、ラットをヒュームフード内の上皮の位置に固定し、胸部中線に沿って皮膚を切開する。横隔膜を切って胸腔を開き、20ゲージを25ミリメートル針ずつ左心室に挿入します。すぐにはさみで右心房を開き、毎分5ミリリットルの流量で50ミリリットルの予冷100ミリモルPBSを浸透させます。すべてのPBSが配信されたら、100ミリリットルの冷たい4%パラホルムアルデヒドをパーフューズします。すべての固定剤が送達されたら、頭蓋骨から脳を取り除き、新鮮な4%パラホルムアルデヒドで一晩組織を固定する。翌朝、脳がチューブの底に落ち着くまで、脳がチューブの底に落ち着くまで、30ミリモルPBSの30%スクロースの40ミリリットルにサンプルを入れ、マイナス80°Cで2分間メチルブタノールで脳組織を凍結する。凍結後、マイナス20度のクライオスタットと細かいペイントブラシを使用して、厚さ50ミクロンのコロナセクションを取得します。すべてのセクションが得られたら、300マイクロリットルのアンチフェード媒体でサンプルを覆い、22の50ミリリットルのカバーリップで取り付けます。培地が乾燥したら、共焦点顕微鏡で断面を画像化する。レンチウイルス注射の7日後、ラットコロナ脳スライス画像は、脳組織全体、特に皮質および海馬デンテート回内のEcoHIV-EGFPシグナルの有意な存在を明らかにする。Iba1およびEcoHIV-EGFPプローブとの二重標識は、ミクログリアが脳内のEcoHIV発現を有する主要な細胞型であるという強力な証拠を提供する。感染後8週間、EcoHIV注射動物は生理学コントロールと比較して比較的平坦な間隔関数によって証明されるように、刺激間隔の操作に対して相対的な鈍感を示す。さらに、EcoHIV注射ラットは、制御動物に対する頭頸部径が増加した短い樹状脊椎の相対的頻度の増加によって証明されるように、樹状脊椎形態に深い変化を示す。立体性注入前の条件培地の濃度と濃度は、実験全体で一貫した複製可能な結果を確保するために重要です。EcoHIVのこの特定の地域の立体態注入は、脳内の効率的なHIV感染を提供し、ラットの時間的処理の欠陥を生成する。ラットにおける立体性HIV注射を利用してEcoHIV感染モデルを拡張することは、目の前の神経HIVに関連する新しい質問に取り組む重要な機会を与える。

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JoVE Journal

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低酸素性虚血性脳損傷のための出生後のラットのモデルは、ヒト新生児低酸素性虚血性脳症（HIE）の十分に確立されたモデルです。この記事では、出生後の仔ラットのHIEのモデルについて説明します。...

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このビデオは、ラットの脳の皮質にキメラHIVウイルスを注入する手順を示しています。そこでは、ウイルスRNAが宿主ゲノムに統合され、複製され、拡散して実験モデルで活動性HIV感染が確立されます。...

ラットモデルにおける活動性HIV感染の確立

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ラットにおける羊膜内リポ多糖で出生前低酸素性虚血を使用した未熟児のモデル化脳症

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デングウイルス誘発急性ウイルス脳炎様疾患のマウスモデル

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ラットの急性脳卒中後の脳回復を評価する前臨床モデル

ここでは、インタクトな脳構造の一部として標的分子を観察することを可能にする疎水性組織クリアリング法を提示する。この技術は現在、両方の男女のF344/...

ラット脳組織の疎水性組織除去法

未熟児の出血後水頭症(PHHP)は、絨毛膜羊膜炎と脳室内出血を組み合わせることにより、新生児ラットでモデル化できます。これらの出生前と出生後のイベントの組み合わせは、生涯を通じて、大頭症、脳室拡大、頭蓋内圧の上昇など、PHHPの臨床的特徴を正確に再現します。...

ラットにおける未熟児の出血後水頭症のモデリング

このプロトコルでは、EcoHIV感染と Tmem119-EGFP...

ミクログリア操作トランスジェニックマウスにおけるエコHIV感染細胞の同定

この記事では、躁病様と抑うつ様の両方の行動を捉える双極性障害のユニークなラットモデルの誘導のためのプロトコルを紹介します。...

双極性障害のラットモデルの開発

学ぶEcoHIVラットモデルによるHIV脳感染症の神経行動学的研究法。マイクログリア標的化とシナプス機能評価により、HIV関連神経認知障害のメカニズム解明に貢献します。

エコHIV脳感染症のラットモデル

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