腸管内窩からのネズミ原発結上皮単層の生成
2021年2月6日
本プロトコルでは、腸内窩から直接マウスの一次上皮結腸単層を生成する方法を説明する。透過性フィルター上にコンフルエント単層を生成する実験的アプローチ、傷創傷治癒および生化学的研究のためのコンフルエント単層、免疫蛍光分析のためのまばらでコンフルエントな単層を提供する。
当社のプロトコルは、迅速で再現性の高い信頼性の高い方法で、小さな破片を使用して異なる表面に直接一次腸上皮単層を生成します。このプロトコルの主な利点は、培地の低消費と細胞培養の低コスト維持です。機能テストと高速ダウンストリーム アプリケーションを実行する簡単な方法です。
このプロトコルは、創傷修復、透過性バリア、および異なる細胞タイプの経上皮移動の研究における洞察を提供する。また、このモデルは宿主と病原体の相互作用、損傷した上皮、および創薬に有用である。開始するには、48ウェルプレートとチャンバースライドの各ウェルに200マイクロリットルのコーティング溶液を追加します。
2時間摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで両方を事前インキュベートします。コート 0.4 マイクロメートルの細胞膜挿入物 200 マイクロリットルのコラーゲン溶液。膜インサートを摂氏4度で30分間インキュベートし、摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターに2時間移します。
70%エタノールで安楽死させたマウスを消毒し、その後、はさみと鉗子の助けを借りて直腸から盲腸に結腸を解剖する。20ゲージの給餌管を取り付けた10ミリリットルのシリンジで氷冷PBSで便を静かに洗い流します。近位コロンを取り出し、遠位コロンを20ゲージの給餌管にそっとスライドさせます。
チューブの端にある結腸を4-0シルク縫合糸で結びます。結ばれた端に結びつきコロンを裏返しにして、もう一方の端を糸で結び、外科用ハサミを使って餌管の先端の下に結腸を切る。インバージラーを使用して、1.25ミリリットルのリピートシリンジの先端に反転結ばれた結腸の端をそっと開きます。
逆結腸の巻きの端をシリンジにスライドさせ、糸でしっかりと結びます。プランジャーをシリンジに挿入し、目に見えるしわが見えないまで結腸を膨らませます。膨らませたコロンソーセージを、5ミリリットルの細胞回収溶液を含む15ミリリットルのチューブに20分間氷の上に置きます。
5分に1回、結腸を膨らませ、収縮させます。4-0シルク縫合糸を使用して、繰り返しシリンジの先端の下に膨らんだ結腸を結びます。コロンソーセージを繰り返し注射器から切り取り、10ミリリットルの50ミリモルEDTAを含む15ミリリットルのチューブに40分間入れます。
チューブを摂氏4度で回転させます。EDTA溶液を5ミリリットルのシェイクバッファーに交換し、ソーセージを垂直位置で手動で2分間振ります。新しい15ミリリットルのチューブに振る溶液をデカントし、合計10ミリリットルのクリプトと揺れバッファーが収集されるまで振盪ステップを繰り返します。
懸濁液の20マイクロリットルの納骨堂の数を顕微鏡で数え、サンプルを希釈してマイクロリットル当たり5個の暗号の濃度を得る。400倍Gで400倍の検体を摂氏4度で10分間遠心分離する。その間、インキュベーターから48ウェルプレートと膜のインサートを取り出し、バイオセーフティキャビネットに置きます。
P200ピペットを使用してコーティング溶液を吸引し、細胞がメッキ可能になるまで蓋をわずかにオフセットしてプレートを残します。クリプト懸濁液の遠心分離後、振盪バッファーを取り外し、LWRN完全培地の3ミリリットルで無傷のペレットを再懸濁する。事前にコーティングされた48ウェルプレートとチャンバースライドの各ウェルに200マイクロリットルの納骨堂を加え、摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで両方をインキュベートします。
翌日、メディアを吸引し、新鮮なメディアを追加します。一般的に、細胞は24〜48時間でコンフルエントになる。細胞培養膜挿入物の場合、インサートの上部に200マイクロリットルのクリプトを加え、完全なLWRN培地を600マイクロリットルの底に加えます。
翌日、メディアを吸引し、新鮮なメディアを一番上の部屋にのみ追加します。5%の炭酸ガスインキュベーターでプレートを摂氏37度でインキュベートします。上皮ボルト/オームメーターを使用して、毎日の経上皮電気抵抗を測定します。
マウスコロンからクリプトを単離し、濃度を検証した後、クリプト懸濁液をマイクロリットル当たり5個のクリプトに濃縮した。48ウェルプレートウェルは、細胞合流に達すると傷創傷アッセイを行った。24時間後、創傷修復は、培養が健康で生存可能であることを示す観察された。
メディアが LWRN から分化メディアに変更された場合、より高い層値が達成されました。また、ISCマーカーの減少と分化マーカーの増加は、分化された単層が正常に生成されたことを示す観察された。また、異なる条件で増殖した分化上皮細胞のサブタイプの出現は、免疫蛍光によって示された。
このプロトコルを試みるとき、準備中のどの時点でも結腸が破裂せず、非常にきれいな準備で納骨堂を解放するために膨張したままであることを確認することが重要です。2d腸上皮細胞単層が形成されると、免疫蛍光、傷創傷および透過性アッセイおよび他の下流のアプリケーションを行うことができます。これは創傷治癒、異なる細胞タイプの移動、および上皮修復および損傷研究の知識を提供する。
概要
このプロトコルは、腸の暗号からマウスの原発性腸上皮モノレイヤーを生成するための信頼性の高い方法を概説し、創傷修復と透過性バリア機能に関する研究を可能にします。主要な利点には、メディア消費量の少なさと迅速な実験適用が含まれます。
主要な研究構成要素
研究分野
- 細胞生物学
- 創傷修復メカニズム
- 上皮間移行研究
背景
- 腸上皮細胞は、バリア機能と栄養吸収において重要な役割を果たします。
- これらの細胞の研究は、宿主-病原体相互作用の理解に役立ちます。
- 生理学的関連性のために、原発性細胞培養モデルが必要です。
使用された方法
- マウス結腸からの腸暗号の分離。
- メンブレン挿入および48ウェルプレートでの培養。
- 機能評価のための免疫蛍光およびスクラッチ創傷アッセイ。
主な結果
- 様々なアッセイのための密集したモノレイヤーを成功裏に生成しました。
- モノレイヤーは健康な細胞特性と分化を示しました。
- 効果的な創傷治癒と電気抵抗測定を観察しました。
結論
- この研究は、原発性マウス腸上皮細胞を研究に使用するためのフレームワークを確立します。
- このモデルは、創薬と上皮修復プロセスの理解における進歩を促進できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid generation of primary murine intestinal epithelial monolayers directly from crypts, reducing reliance on immortalized cell lines and improving physiological relevance in preclinical models. The model supports functional assays critical for evaluating barrier integrity, wound healing, and host-pathogen interactions in early discovery. Its low cost, reproducibility, and compatibility with downstream applications enhance translational confidence in gastrointestinal target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epithelial barrier function and repair mechanisms using physiologically relevant primary cells.
- Operational Value: Provides a rapid, low-cost system for testing compound effects on monolayer integrity and permeability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates confluent monolayers suitable for quantitative permeability and transepithelial electrical resistance (TEER) measurements.
- Operational Value: Supports scratch wound and immunofluorescence assays to assess wound repair and cellular differentiation in high-content formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Differentiation marker shifts confirm model maturity, enabling study of epithelial subtypes and lineage commitment.
- Operational Value: Facilitates preclinical evaluation of drug candidates in a system that mimics in vivo epithelial responses to injury and repair.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a primary cell-based platform for hypothesis testing in gastrointestinal biology, bridging crypt isolation to functional phenotypic readouts.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of targets involved in epithelial homeostasis, repair, and barrier function.
- Screening: Enables standardized, reproducible assays for compound screening using TEER and wound healing as quantitative endpoints.
- Analytics: Delivers measurable outputs including TEER values, wound closure rates, and immunofluorescence signal intensity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through differentiation-competent monolayers that model human epithelial responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable primary cell platform applicable across multiple projects in gastroenterology, immunology, and infectious disease.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing artifacts from transformed cell lines and enhancing target validation in native epithelial contexts.
- Operational Value: Minimizes reagent consumption and culture maintenance burden, supporting scalable use across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early functional readouts on epithelial integrity and repair capacity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on effects in a physiologically relevant epithelial barrier model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine tissue dissection and crypt isolation techniques.
- Depends on sterile cell culture infrastructure and equipment for TEER measurement and immunofluorescence imaging.
- Necessitates standardization of crypt concentration and plating density across users and laboratories.
- Adaptation to human or other species tissues may require optimization of enzymatic and mechanical dissociation steps.
- Long-term culture stability and full differentiation maturity may be limited compared to organoid-derived models.
