ライブイメージングを用いたショウジョウバエ卵チャンバに対する酸化損傷の効果の可視化
April 10th, 2021
このプロトコルの目的は、ショ ウジョウバエ 卵巣の細胞下構造の局在およびダイナミクスに対する酸化損傷の影響を可視化するために、ライブ画像を使用することです。
私たちの研究室では、ショウジョウバエメラノガスターを使用して、開発中および生理学的恒常性の間にミトコンドリア機能を調節する遺伝子や経路を同定し、特徴付けます。ここで提示されるプロトコルは、過酸化水素を添加したライブイメージングを使用して、成人ショウジョウバエ卵巣における細胞下構造の局在およびダイナミクスに対する酸化損傷の影響を可視化する。私たちは、多くの場合、突然変異が女性の生殖細胞の正常なミトコンドリアの局在および動きを変える方法を研究するためにイメージングプロトコルを使用しています。
我々の研究の過程で、解剖または他の細胞ストレッサーによって導入されたストレスがミトコンドリアの局在に大きな影響を与えることがわかった。一般的なストレスが、実験的治療とは対照的に、細胞内構造の局在または行動に何らかの変化の原因であるかどうかを特定するコントロールとしてである。過酸化水素を用いた制御ストレスを導入するこのプロトコルを開発しました。
このビデオでは、過酸化水素が酸化的損傷を誘導してミトコンドリアとリボヌクレオプロテインCluの分布をどのように変化させるかを示します。このライブイメージング技術に最も適したメディアには、15%の熱不活化ウシウシ血清、0.6 Xペンストレップ、およびマイクロリットル牛インスリンあたり200マイクログラムを含むシュナイダーのショウジョウバエ培地が含まれていました。滅菌条件下で媒体調製を行うことは、それが汚染されないことを保証する。
内容をよく混ぜて、一晩4度で保存します。インスリンは完全なシュナイダーのメディアに完全に溶解しないし、沈殿物がチューブの底に落ち着くのに気づくでしょう。それはイメージングを妨げるので、この沈殿物を残すことを確認して、アリコートを作ります。
この溶液は、4度でアリコートに格納されている場合、1ヶ月間使用することができる。最適な雌の生殖細胞のイメージのために、まずピーナッツバターの一貫性である湿った酵母ペーストのダブを含むバイアルを準備する。これにより、メスが十分に供給され、イメージング用のすべての卵胞発生段階が生成されます。
最適に健康なハエのために、ゼロから1日の古いメスを収集し、濡れた酵母ペーストを含むフライフードバイアルに男性と一緒に転送します。彼らはそれに固執することができるように眠っているハエが酵母ペーストに接触しないことを確認してください。ハエに3〜7日餌を与え、毎日酵母ペーストを交換します。
酵母ペーストがフライフードに接触することを確認してください。酸化的損傷を誘発するために、過酸化水素30%のストック溶液を使用し、ミトコンドリアを可視化し、100ミリモルTMREのストック溶液を使用します。過酸化水素は酸化の影響を受けやすく、TMREは時間の経過とともに分解されるため、培地溶液を新鮮に調製することが重要です。
解剖の直前に、完全なシュナイダーのメディアで、2つのマイクロモルモル過酸化水素、46ナノモルTMREの新鮮なアリコート、および46ナノモルTMREと2つのマイクロモル水素過酸化水素の新鮮なアリコートを準備します。卵巣解剖のためには、2組の細かい鉗子と電解的に研がれたタングステン針が必要です。卵巣を解剖するには、室温まで温められた完全なシュナイダーのメディアで時計ガラスを満たし、鉗子を使用してメディアに単一のフライを置きます。
細かい鉗子を1組使って胸郭でハエをそっとつかみます。他の鉗子で、後部をつかみ、穏やかに引っ張って卵巣を取り除きます。余分なキューティクルや組織を取り除き、新鮮な培地を含む新しい井戸に卵巣を移します。
卵巣はまだ周囲の筋肉鞘から移動する必要があります。鋭利なタングステン針を使用して、周囲の筋肉鞘を取り除くように注意して、卵胞を優しくいじめます。ここで示すように、筋鞘が取り除かれない場合、卵巣はぴくぴくし、画像取得に問題を引き起こす。
卵巣をきれいに解剖したら、内因的に標識された構造を視覚化する場合は、100マイクロリットルのメディアでMatTek皿に移します。TMREで標識されたミトコンドリアを視覚化する場合は、TMRE培地の100マイクロリットルの低下物で卵巣をMatTek皿に移します。卵巣は液滴の底に沈みます。
できるだけ早く組織のイメージングを開始するためには、切り分けの練習が重要です。卵胞を取り付けたら、逆顕微鏡に皿を置き、前処理条件の記録として静止画または短いビデオを取得します。これが完了したら、ライブイメージングを一時停止し、蓋を取り外し、2つのマイクロモル酸化水素調製溶液の100マイクロモルリットルを慎重に追加します。
既存のメディアの液滴の表面を壊したり、溶液をあまりにも早く添加したりして、底部に置き換える卵巣を置き換えないようにしてください。皿カバーを交換し、目的の卵巣を再配置して再焦点を合わせ、イメージングを再開します。実験処理は時間に敏感であるため、できるだけ早くイメージングを再開するように注意してください。
ここに示されているのは、過酸化水素後の処理で撮影された映画の静止画です。ミトコンドリアおよび雌の生殖細胞は、ハエが十分に供給され、健康であるときに細胞質全体に分散される。過酸化水素添加後、酸化損傷によりミトコンドリアが凝集し、処理後10分程度で迅速に見ることができます。
20分後、ミトコンドリア膜電位が消散する原因となる。したがって、ミトコンドリアの大部分は消えていく。このプロセスのライブムービーでは、ミトコンドリアはすぐに束々と見ることができ、ミトコンドリアの大部分は最終的に消えていきます。
細胞質、特に周囲の卵胞細胞における脈動の点滅は、TMRE付加の特徴として現れる。前述のように、過酸化水素添加後迅速にイメージングを行う必要があります。ここに示すように、あまりにも多くの時間が経過すると、ミトコンドリア膜電位はすでに失われ、TMRE標識が消失し、データが解釈不能になる。
これらのビデオ静止画では、GFP内因に標識されたClu粒子は、十分に供給された女性の胚芽に強く豊富である。過酸化水素添加後、Clu粒子は10分以内に分散する。これは、付属のビデオで示されています。
過酸化水素添加後、Clu至福の粒子は素早く分散する。このプロトコルは、ショウジョウバエ雌胚芽細胞におけるミトコンドリアおよびClu至福粒子の野生型の局在化を正確にイメージングするための有用なツールであることを発見した。このプロトコルは、ライブイメージング研究の広い範囲に適用されるべきであり、同様に固定前に組織を治療するために使用することができる。
最も重要なステップは、筋肉鞘の無い卵巣体を単離し、過酸化水素を穏やかに添加し、卵巣を外さないように、そして過酸化水素添加後すぐに画像化することです。さまざまな細胞下構造を生画像化するための便利なコントロールを見つけることを願っています。あなたの実験を見て、幸運をありがとう。
概要
このプロトコルは、ショウジョウバエの卵巣における細胞小器官の酸化ストレス影響を調査するために生きたイメージングを利用しています。この研究は、過酸化水素処理に対するミトコンドリアの動態と局在に焦点を当てています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- ショウジョウバエは、ミトコンドリア機能を研究するためのモデル生物です。
- 酸化ストレスは細胞構造に大きな影響を与える可能性があります。
- 生きたイメージング技術は、動的な細胞プロセスを観察するために不可欠です。
- この研究では、過酸化水素を使用して酸化ストレスを誘導します。
研究の目的
- ミトコンドリアおよび他の細胞小器官に対する酸化ストレスの影響を視覚化する。
- ストレスがミトコンドリアの局在化と動きにどのような影響を与えるかを評価する。
- 過酸化水素を使用して制御された酸化ストレスのプロトコルを確立する。
使用された方法
- イメージング用の完全なSchneider培地の調製。
- 無菌条件下でのショウジョウバエ卵巣の解剖。
- 酸化ストレスを誘導するための過酸化水素の適用。
- 処理後のミトコンドリアの挙動を監視するための生きたイメージング。
主要な結果
- 酸化ストレスはミトコンドリアの凝集と膜電位の喪失につながります。
- ミトコンドリアの動態の変化は、処理後10分以内に観察できます。
- 信頼性の高いイメージング結果を得るには、実験条件の制御が重要です。
- TMREラベリングはミトコンドリアの健康と動態に関する洞察を提供します。
結論
- 生きたイメージングは、ミトコンドリアに対する酸化ストレスの影響を効果的に示します。
- このプロトコルは、ショウジョウバエのミトコンドリア機能に関するさらなる研究に利用できます。
- 酸化ストレスのメカニズムを理解することで、より広範な生物学的研究に貢献する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Controlled induction of oxidative damage in Drosophila egg chambers via live imaging enables precise assessment of subcellular structure dynamics under stress, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides a robust control for distinguishing experimental effects from general cellular stress, enhancing predictive confidence in target validation studies. The protocol's adaptability to various subcellular structures increases its value for portfolio-wide assay development and screening readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of stress-induced changes in organelle localization and dynamics.
- Supports functional validation of mitochondrial and ribonucleoprotein particle behavior under controlled oxidative conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific treatment effects from general cellular stress responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream live imaging workflows.
- Standardizes oxidative stress induction for reproducible quantitative imaging outputs.
- Enables rapid assessment of compound or genetic perturbation effects on subcellular structures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms involving oxidative stress and mitochondrial dysfunction.
- Provides continuity from discovery-stage imaging to preclinical model validation of cellular stress responses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying stress-induced phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This live imaging protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through assay development and preclinical validation, particularly for studies involving cellular stress and organelle dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the impact of oxidative damage on subcellular localization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides measurable readouts of mitochondrial clumping and ribonucleoprotein particle dispersion.
- Translational Research: Connects oxidative stress responses in Drosophila to broader disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol for diverse subcellular structure studies across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes oxidative stress induction and imaging workflows for scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying stress-related phenotypes early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on robust stress response data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila dissection and live imaging techniques.
- Needs access to inverted fluorescence microscopy and appropriate imaging reagents.
- Demands cross-team standardization of oxidative stress induction protocols.
- Adaptable to various subcellular structures but limited to aqueous media (not compatible with halocarbon oil).
- Imaging must be performed rapidly post-treatment to capture dynamic changes before signal loss.
