Name: 12.5日目および8週齢マウスの舌上皮・間分性/結合組織からの細胞解離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学ぼう、マウスの舌上皮と間葉組織から高品質な単一細胞を解離する方法を。E12.5胚および8週齢成体に適用でき、単一細胞RNAシーケンスやオルガノイド培養などの下流実験に活用可能です。

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この研究は、国立衛生研究所、助成番号R01DC012308、R21DC018089によってHXLに支援されました。ブレット・マーシャル(ジョージア大学、アテネ、GA)とエゴン・ランヒニ(10X GENOMICS、プレザントン、CA)に感謝し、細胞解離に関する技術支援と相談を行いました。フランシスカ・ギブソン・バーンリー(ジョージア大学、アテネ、ジョージア州)に英語編集。

動物の使用(研究を通じてC57BL / 6マウス)は、ジョージア大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認され、研究のための動物のケアと使用のための国立健康ガイドライン研究所に従っていました。
1. 動物の使用
注:マウスは、ジョージア大学動物酪農科学科の動物施設で、12時間/夜間サイクルの下で22°Cで飼育および維持しました。
<ol><li>マウスにおける膣プラグ検出の日の正午を胚(E)日0.5として指定する。E12.5で胚を使用し、生後マウスを生後8週で以下の実験に使用する。</li>
</ol>2. 実験前の準備
注: このプロトコルに必要なインストゥルメントは、 資料一覧に記載されています。
<ol><li>実験前のオートクレーブ楽器。実験中にビーズ滅菌器を使用して器具を殺菌します。</li>
	<li>70%エタノールワイプを使用して、外科領域、解剖顕微鏡、およびバイオセーフティキャビネットを洗浄します。バイオセーフティキャビネットのUVライトをオンにし、実験手順の前に20分間オンにします。</li>
	<li>1:1ディスパーゼ(5.0 mg/mL)とコラゲナーゼ(2.0 mg/mL)の酵素混合物を最終濃度2.5と1.0mg/mLにそれぞれ調製し、0.22 μmシリンジフィルター7を使用して溶液をフィルター処理します。<ol>
<li>成人の舌に対して1 mL、または特定の舌の領域(例えば、後部、または前舌)に対して0.5mLの酵素混合物を調製する。</li>
		<li>胚性舌用酵素混合物2 mLを調製する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.1 M PBS で 2.5% BSA の 10 mL を作り、1 mL シリンジと 0.22 μm シリンジフィルターを使用して溶液をフィルターします。</li>
	<li><li></ol><ol><li><ol><li> </li><li><li><li></li><li></li><li><li><li> </li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li><li></li><li><ol><li><li> </li></ol></li><li><li><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li><li> </li></ol><ol><li> </li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62163/62163eq01v2.jpg"><ol><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62163/62163eq02.jpg"></li></ol></li></ol>

<ol><li>Grada, A., Weinbrecht, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing%3A+methodology+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing: methodology and application.</a> The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).</li>
<li>Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+methodology+and+clinical+applications+of+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).</li>
<li>Schaum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%3A+The+Tabula+Muris+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium.</a> Nature. 562 (7727), 367(2018).</li>
<li>Sukumaran, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+profiling+of+taste+bud+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome profiling of taste bud cells.</a> Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+labeling+in+whole+tongue+epithelial+sheet+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen-Ngoc%2C+K-V+%22Tissue+Morphogenesis%22">Tissue Morphogenesis</a>. , Springer. 135-162 (2015).</li>
<li>Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+mapping+of+taste+bud+cells+and+keratinocytes+in+the+mouse+tongue+and+soft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate.</a> Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

現在までに、舌上皮および基礎となる間質/結合組織からの細胞解離に関する詳細なプロトコルは利用できていない。この現在の細胞解離プロトコルは、高い細胞生存率(>90%)を有する単一細胞懸濁液を生成する再現可能な手順を提供するE12.5と成体マウスからの単離された細胞が異なるにもかかわらず、胚および出生後の両方の段階で上皮シートおよび間葉/結合組織を含むマウスの舌組織から。例えば、E12.5マウス舌の上皮および間質から単離された細胞は、8週齢のマウス舌からの細胞の大きな変動(小さいから大きいものまで)とは対照的に、一貫しており、小さい。高い生存率(>90%)の利点を有する単離された細胞の、得られた単一細胞懸濁液は、生存細胞の高品質を必要とする下流実験を容易にすることができる(例えば、単一細胞RNAシーケンシングおよび一次細胞培養)。
細胞の高い生存率を保証するためには、いくつかの重要な要因に注意が払われなければなりません。ディスパーゼとコラゲナーゼ混合物を用いた適切な消化時間は、生存細胞を維持しながら、効果的に間葉/下層の結合組織から上皮を分離することができます。胚舌の20分インキュベー...

哺乳類の舌は、味、話す、および食品処理に不可欠な複雑な器官である。それは間葉/結合組織によって区分され、味乳頭および味覚芽を含む階層化された上皮シートによって覆われる高度に組織化された組織の複数のタイプで構成される。舌上皮と間質/結合組織の両方の細胞集団は不均一である。舌の特定のタイプの細胞の機能と分布をよりよく理解するためには、解き分け細胞を用いた研究が必要である。例えば、単一細胞RNAシーケンシングは、個々の細胞における転写プロファイリングのための強力かつハイスループットな方法であり、単一細胞分解能1、2、3、4における複雑な組織の転写物を理解するように設計されている。一次細胞培養は、味覚芽5,6の幹細胞/前駆細胞の機能と分化を研究するのに有用なツールであることが証明されている。これらの研究は、大量の高品質の単離された細胞集団(例えば、適切な濃度および高い生存率を有する十分な総細胞数)を必要とする。
したがって、言語組織の異なる領域から、異なる発達段階で細胞を分離する必要があります。現在、舌上皮および基礎となる間質/結合組織からの細胞解離に利用できる詳細なプロトコルはない。ここでは、単一細胞RNAシーケンシングや一次幹細胞培養など、高い品質の生細胞を必要とする実験のために細胞を調製するための最適化された細胞解離方法を報告する。我々は、酵素消化バッファー、穏やかなピペット、再懸濁培地の選択、および最適な遠心分離時間と速度の選択は、これらの大量の高品質の細胞を生成するために重要であることを発見しました。

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 mouse (C57BL/6J)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>collagenase (Collagenase A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>培養ディッシュ(直径35 mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103G</td><td></td></tr><tr><td>カルチャーディッシュ(直径100 mm)</td><td>GeneseeScientific</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>dispase (Dispase II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04942078001</td><td></td></tr><tr><td>dissecting はさみ (Student Fine Scissors)</td><td>科学ツールを探す</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>C838U82</td><td></td></tr><tr><td>fine sersps (Dumount #3 Forceps)</td><td>科学ツールを探す</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>ハウサーサイエンティフィック</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 イメージングシステム (EVOS XL Core Cell Imaging System)</td><td>Life Technologies</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>低保持ピペットチップ</td><td>メトラー・トレド</td><td>17014342</td><td></td></tr><tr><td>ミニハサミ (Evo Spring Scissors)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15800-01</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックワープ</td><td>VWR</td><td>46610-056</td><td></td></tr><tr><td>スパチュラ (モリア・スプーン)</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>外科用鉗子 (デュマウント #2 椎弓切除用鉗子)</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー</td><td>ギブコ</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>タイロード</td><td>Σ-Aldrich</td><td>T2145-10L</td> は <td>Tyrode 塩</td></tr><tr><td>0.25% typsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Hoefer</td><td>33946</td> 1 <td>M PBS</td></tr><tr><td>0.22-&mu;mシリンジフィルター</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>Koptec</td><td>233919</td><td>100%エタノール</td></tr>製 <tr><td>1mLシリンジ</td><td>BD</td><td>8194938</td><td></td></tr><tr><td>5mL低結合マイクロ遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30122348</td><td></td></tr><tr><td>30-G ニードル</td><td>BD</td><td>9193532</td><td></td></tr><tr><td>35-&mu;m細胞ストレーナー</td><td>Falcon</td><td>64750</td><td></td></tr><tr><td>70-&mu;Mセルストレーナー</td><td>Falcon</td><td>64752</td><td></td></tr></tbody></table>

12.5日目および8週齢マウスの舌上皮・間分性/結合組織からの細胞解離

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

細胞解離は、個々の細胞レベルおよび/または細胞集団レベル(例えば、単一細胞RNAシーケンシングおよび一次細胞培養)での研究に不可欠な手順であった。大量に生存可能で健康な細胞を産出することは重要であり、そのために最適な条件は組織依存である。舌上皮および基礎となる間質/結合組織における細胞集団は異種であり、組織構造は異なる領域および異なる発達段階で異なる。我々は、初期発達[胚性12.5日目(E12.5)]および若年成人(8週間)段階でマウス舌上皮および間葉/結合組織から細胞を単離するためのプロトコルを試験した。上皮と下層の間質/結合組織との間のきれいな分離は容易に達成した。しかし、さらに細胞を処理して単離するには、生存可能な健康細胞を大量に生成し、酵素消化バッファー、インキュベーション時間、遠心分離の速度と時間を慎重に選択することが重要です。分離した上皮または基になる間葉系/結合組織を37°Cで30分間0.25%トリプシン-EDTAでインキュベーションし、続いて200xgで8分間遠心し、高い生存率(>90%)で細胞の高収率をもたらしたマウスのステージと舌の領域に関係なく。さらに、胚性および成体の舌からの解離された上皮および間葉/結合組織細胞の両方が、細胞生存率の有意な減少なしに少なくとも3時間細胞培養ベースの培地で生存できることを発見した。このプロトコルは、初期発達(E12.5)および若年成人(8週間)段階で異なる組織コンパートメントからの細胞解離を必要とするマウス舌からの単離細胞の調製を必要とする研究に有用である。

基礎間質/結合組織からの舌上皮の分離 胚性マウス舌では、適切な酵素消化後に上皮下腔の隙間が見える。一部の舌の上皮シートは、インキュベーション中に機械的な力なしで分離されます。
成人マウス舌では、注入された領域の腫脹(図1B2)によって酵素注射が成功したことを示しており、これは、酵素が舌によって保持され得ことを示唆している。間葉系および/または舌上皮の針による浸透への酵素および/または深部注射が不十分な場合、注射領域の部分的な腫脹を誘発するか、全く腫脹を起こさない。酵素消化後、適切な酵素消化を有する根底にある結合組織が緩んで粘着性になる。上皮シートの端を穏やかに持ち上げると、上皮下空間の隙間が見える。
細胞の解離が細胞総数と生存率に及ぼす影響 ステップ4では、E12.5舌、上皮シート、および舌の上皮のすぐ下に間質の薄い層がそれぞれプール...

我々は、胚および成体マウス舌の上皮および間線質/結合組織から大量の高品質単一細胞を解離するための一般化されたプロトコルを開発した。

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

複雑な組織からの細胞の高収率と品質は、単一細胞RNAシーケンシングや一次幹細胞培養など、一般的に使用される実験分析に不可欠です。このプロトコルは、舌上皮および結合組織を含む哺乳類舌の異なる領域および組織区画から高収率および品質で健康な細胞を生成する。上皮をE 12.5マウス舌の間質から分離するには、安楽死させた妊娠した雌マウスを手術領域に移し、70%エタノールでマウス腹部を濡らして毛皮が手術部位に入るのを防ぐ。胚を運ぶ子宮の角を露出させるために解剖ハサミを使用して腹部を開き、子宮の角を解剖し、100ミリメートル培養皿で新鮮なタイロードの溶液の15ミリメートルにそれらを転送します。解剖顕微鏡の下で、子宮の角から胚を解剖するためにミニはさみと細かい鉗子を使用してください。細かい鉗子で口腔を開き、ミニハサミを使用して下顎から舌を解剖します。100ミリメートルの培養皿で新鮮な滅菌タイロードの溶液の15ミリリットルで舌を洗います。その後、35ミリメートルの培養皿でジスパーゼとコラーゲンの酵素混合物の2ミリリットルに組織を移し、摂氏37度で20分間インキュベートします。舌を新鮮な滅菌タイローデの溶液の15ミリリットルに移し、細かい鉗子を使用して腹側から間質と上皮を穏やかに分離する。分離した上皮と間質を15ミリリットルの新鮮な滅菌タイローデの溶液で2回洗います。舌上皮を成体マウスの下にある結合組織から分離するには、安楽死させたマウスを手術領域に移し、70%エタノールを使用してマウスヘッドを濡らして毛皮が口腔内に入るのを防ぐ。切除はさみを使用して頬に沿って口の角を切り取り、口腔を開きます。下顎で舌を解剖し、それを洗い、ラップの層とプラスチック皿に入れます。手術用鉗子を使用して舌を保持し、後舌の最先端を通して舌の上皮下腔にディスパーゼとコラゲナーゼの酵素混合物を注入する。組織採取のために舌全体に酵素混合物を1ミリリットル均等に注入し、舌先端から組織採取のために前舌または後舌に0.5ミリリットルの酵素混合物を局所的に注入して、乳頭回りの組織コレクションを回る。ラップで舌を包み、30分間摂氏37度でインキュベートします。乳頭と舌の先端の周りを解剖するためにミニはさみを使用してください。その後、新鮮な滅菌タイロードの溶液の15ミリリットルに組織を移す。下流の実験の要件に従って、酵素消化下上皮空間の下層結合組織から上皮を分離し、適切なサイズに組織をトリミングします。分離した上皮と根底にある結合組織を100ミリメートル培養皿で15ミリリットルの新鮮な滅菌タイローデの溶液で2回洗浄します。新しい35ミリメートル培養皿で0.25%トリプシンEDTAの3ミリリットルに組織を移す。30分間摂氏37度で30分間インキュベートし、1ミリリットルのピペットチップで5分ごとに組織を穏やかに攪拌します。DMEM F12に5%FBSの500マイクロリットルを加えて反応を停止し、培地を5ミリリットルの低結合遠心分離管に移します。細胞懸濁液を室温で8分間Gの200倍に遠心し、上清を取り除く。10%FBSと1%BSAを含むDMEM F12の3ミリリットルの細胞を穏やかに再懸濁し、70マイクロメートルの細胞ストレーナーで細胞をフィルタリングし、続いて35マイクロメートルの細胞ストレーナーを続ける。細胞懸濁液を室温で8分間Gの200倍にして、培地の大部分を取り除き、最終的な体積として50〜300マイクロリットルを残して細胞を再懸濁させる。胚性マウス舌では、適切な酵素消化後に上皮下腔の隙間が見える。成人マウス舌では、酵素注射が成功し、注入された領域の腫脹によって示され、これは酵素が舌によって保持され得ことを示唆している。E12.5舌の上皮シートと間葉系の薄い層をプールした後、手動細胞数は、プロトコルが上皮シートから95.2%の生存率を持つ合計で63、917細胞を生み出し、294、333細胞がメセンチムから96.3%の生存率を有することを実証した。8週齢で10個の成人舌を使用した場合、このプロトコルは、舌先端の上皮シートから95.4%の生存率を有する187、333個の細胞、乳頭周回の上皮シートから96.3%の生存率を有する544,000個の細胞、および93%の生存率を有する150,500細胞を生み出した。このプロトコルに従って、解ciaciaされた細胞は、単一細胞RNAシーケンシングおよび3Dテストオルガノイド培養物に使用して、舌上皮下で認識されていない試験前駆細胞を定義することができる。

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