Name: ニューロン開発中のROSライブ細胞イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶ ゼブラフィッシュ神経細胞と幼生における過酸化水素のライブイメージング法。roGFP2-Orp1バイオセンサーを用いて活性酸素種の動態をリアルタイムで検出し、神経発生と胚発生におけるROSシグナリングを解明する。

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この研究は、国立衛生研究所(グラントR01NS117701)、国立科学財団(グラント1146944-IOS)、インディアナ外傷性脊髄および脳損傷研究基金(グラント20000289)、パーデュー研究財団(グラント209911)、パーデュー大学研究協力副学長事務所(グラント210362)によって支援されました。ゼブラフィッシュRGC培養プロトコルを確立してくれたコーリー・J・ウィーバー博士とヘイリー・ローダー博士に感謝します。図 4 のデータを提供してくれたヘイリー・ローダーに感謝します。リア・ビアシとケニー・グエンのRGC文化の支援に感謝します。テキストを編集してくれたジェントリーに感謝します。私たちは、roGFP2-Orp1を含むpCS2+ベクターにroGFP2-Orp1と清トウ博士を提供してくれたトビアス・ディック博士に感謝します。図 2 は、Biorender.com を使用して作成されます。

<ol><li>Bórquez, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+redox+signaling+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of redox signaling in neuronal development.</a> Journal of Neurochemistry. 137 (4), 506-517 (2016).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+Physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Weaver, C. J., Leung, Y. F., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+dynamics+of+NADPH+oxidases+during+early+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Expression dynamics of NADPH oxidases during early zebrafish development.</a> Journal of Comparative Neurology. 524 (10), 2130-2141 (2016).</li>
<li>Terzi, A., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+NADPH+oxidases+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of NADPH oxidases in neuronal development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 154, 33-47 (2020).</li>
<li>Infanger, D. W., Sharma, R. V., Davisson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases+of+the+brain%3A+Distribution%2C+regulation%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases of the brain: Distribution, regulation, and function.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 8 (9-10), 1583-1596 (2006).</li>
<li>Coyoy, A., Olguin-Albuerne, M., Martinez-Briseno, P., Moran, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+reactive+oxygen+species+and+NADPH-oxidase+in+the+development+of+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Role of reactive oxygen species and NADPH-oxidase in the development of rat cerebellum.</a> Neurochemistry International. 62 (7), 998-1011 (2013).</li>
<li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+neural+stem+cells+have+high+endogenous+ROS+levels+that+regulate+self-renewal+and+neurogenesis+in+a+PI3K%2FAkt-dependant+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li>
<li>Nayernia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+neural+precursor+cell+pool+in+NADPH+oxidase+2-deficiency%3A+from+mouse+brain+to+neural+differentiation+of+patient+derived+iPSC%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Decreased neural precursor cell pool in NADPH oxidase 2-deficiency: from mouse brain to neural differentiation of patient derived iPSC.</a> Redox Biology. 13, 82-93 (2017).</li>
<li>Wilson, C., Nunez, M. T., González-Billault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+NADPH+oxidase+to+the+establishment+of+hippocampal+neuronal+polarity+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Contribution of NADPH oxidase to the establishment of hippocampal neuronal polarity in culture.</a> Journal of Cell Science. 128 (16), 2989-2995 (2015).</li>
<li>Munnamalai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+interactions+between+Nox2-type+NADPH+oxidase+and+the+F-actin+cytoskeleton+in+neuronal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Bidirectional interactions between Nox2-type NADPH oxidase and the F-actin cytoskeleton in neuronal growth cones.</a> Journal of Neurochemistry. 130 (4), 526-540 (2014).</li>
<li>Kishida, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+deficits+and+mild+memory+impairments+in+mouse+models+of+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity deficits and mild memory impairments in mouse models of chronic granulomatous disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (15), 5908-5920 (2006).</li>
<li>Ravelli, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2-dependent+neuroinflammation+in+an+EAE+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nox2-dependent neuroinflammation in an EAE model of multiple sclerosis.</a> Translational Neuroscience. 10 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Park, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2-derived+radicals+contribute+to+neurovascular+and+behavioral+dysfunction+in+mice+overexpressing+the+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nox2-derived radicals contribute to neurovascular and behavioral dysfunction in mice overexpressing the amyloid precursor protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (4), 1347-1352 (2008).</li>
<li>Schiavone, S., Neri, M., Trabace, L., Turillazzi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NADPH+oxidase+NOX2+mediates+loss+of+parvalbumin+interneurons+in+traumatic+brain+injury%3A+Human+autoptic+immunohistochemical+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The NADPH oxidase NOX2 mediates loss of parvalbumin interneurons in traumatic brain injury: Human autoptic immunohistochemical evidence.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8752(2017).</li>
<li>Gutscher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity-based+protein+thiol+oxidation+by+H2O2-scavenging+peroxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proximity-based protein thiol oxidation by H2O2-scavenging peroxidases.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (46), 31532-31540 (2009).</li>
<li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+redox+biology%3A+from+imaging+to+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">New tools for redox biology: from imaging to manipulation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 167-188 (2016).</li>
<li>Abu-Siniyeh, A., Al-Zyoud, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highlights+on+selected+microscopy+techniques+to+study+zebrafish+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Highlights on selected microscopy techniques to study zebrafish developmental biology.</a> Laboratory Animal Research. 36 (1), 12(2020).</li>
<li>Sassen, W. A., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+toolbox+for+genetic+manipulation+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genomics+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish.</a> Advances in Genomics and Genetics. 5, 151-163 (2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+An+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in Zebrafish (Danio rerio).</a> PLoS One. 8 (3), 57539(2013).</li>
<li>Zhang, L., Leung, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+of+zebrafish+embryonic+eye+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (40), e2028(2010).</li>
<li>Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+neuronal+growth+cone+motility+and+duidance+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Migration%3A+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of neuronal growth cone motility and duidance in vitro.</a> Cell Migration: Methods in Molecular Biology. , 65-86 (2011).</li>
<li>Weaver, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nox2%2Fcybb+deficiency+affects+zebrafish+retinotectal+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">nox2/cybb deficiency affects zebrafish retinotectal connectivity.</a> Journal of Neuroscience. 38 (26), 5854-5871 (2018).</li>
<li>Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+EGSH+and+H2O2+with+roGFP2-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring EGSH and H2O2 with roGFP2-based redox probes.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51, 1943-1951 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+specifically+reduces+zebrafish+eye+size%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size.</a> PLoS One. 7 (6), 40132(2012).</li>
<li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222(2014).</li>
<li>Oparka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+ROS+levels+using+CM-H2DCFDA+and+HyPer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying ROS levels using CM-H2DCFDA and HyPer.</a> Methods. 109, 3-11 (2016).</li>
<li>Dickinson, B. C., Peltier, J., Stone, D., Schaffer, D. V., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+redox+signaling+maintains+essential+cell+populations+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Nox2 redox signaling maintains essential cell populations in the brain.</a> Nature Chemical Biology. 7 (2), 106-112 (2011).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+green+fluorescent+protein%3A+Probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive green fluorescent protein: Probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2009).</li>
<li>Meyer, A. J., Dick, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein-based+redox+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein-based redox probes.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 13 (5), 621-650 (2010).</li>
<li>Panieri, E., Millia, C., Santoro, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+subcellular+H2O2+and+glutathione+redox+potential+in+living+cardiovascular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of subcellular H2O2 and glutathione redox potential in living cardiovascular tissues.</a> Free Radical Biology and Medicine. 109, 189-200 (2017).</li>
<li>Breus, O., Dickmeis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+thiol+redox-sensors+in+the+zebrafish+model%3A+Lessons+for+embryonic+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded thiol redox-sensors in the zebrafish model: Lessons for embryonic development and regeneration.</a> Biological Chemistry. , (2020).</li>
<li>Morgan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+basal+H2O2+levels+with+peroxiredoxin-based+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of basal H2O2 levels with peroxiredoxin-based probes.</a> Nature Chemical Biology. 12 (6), 437-443 (2016).</li>
<li>Terzi, A., Roeder, H., Weaver, C. J., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+NADPH+oxidase+2+regulates+growth+cone+guidance+downstream+of+slit2%2Frobo2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neuronal NADPH oxidase 2 regulates growth cone guidance downstream of slit2/robo2.</a> Developmental Neurobiology. , (2020).</li>
<li>Bilan, D. S., Belousov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HyPer+family+probes%3A+State+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">HyPer family probes: State of the art.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 731-751 (2016).</li>
<li>Ermankova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SypHer3s%3A+a+genetically+encoded+fluorescent+ratiometric+probe+with+enhanced+brightness+and+an+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Communications%22%5BJournal%5D)">SypHer3s: a genetically encoded fluorescent ratiometric probe with enhanced brightness and an improved dynamic range.</a> Chemistry Communications. 54 (23), 2898-2901 (2018).</li>
<li>Pak, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+genetically+encoded+indicator+for+hydrogen+peroxide+identifies+roles+for+the+oxidant+in+cell+migration+and+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function.</a> Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+Kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction Kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
</ol>

著者は、利益相反はないと宣言しています。

このプロトコル全体で注意が必要な重要な手順がいくつかあります。これらの点を考えると、実験の流れが改善されると考えています。一次RGC培養では、この培養培地には抗生物質が含まれておらず、画像処理の前または中に汚染が起こり得るため、ZFCM(-)の無菌性は非常に重要である。これを避けるために、バイオセーフティキャビネット内でのみZFCM(-)を準備して使用し、新鮮なZFCM(-)メディアを定期的に作ることをお勧めします(ステップ1.5)。また、ラミニン在庫は-80 °Cに保つ必要があります。 解凍したラミニンは、常に4°Cで保管する必要があります。ラミニン溶液は、タンパク質の神経突起成長促進活性を低下させるため、室温または再凍結に保たないでください。
適切なタイミングでゼブラフィッシュのレチナを解剖することは、軸索を拡張するのに十分なRGCを得るために重要です。ゼブラフィッシュRGCは28 hpfで生まれ、32-36 hpfから始まるレティナから軸索を伸ばす。したがって、28 hpf後にRGCをプレートすることが重要であり、好ましくは32〜36hpfの間で、RGCの完全な分化を可能にす...

活性酸素種(ROS)シグナル伝達は神経系1の発達および機能を調節する。重要な細胞ROS源は、過酸化水素と過酸化水素を生成する膜貫通タンパク質であるNADPHオキシダーゼ(NOX)である(H2O2)2。NOX酵素は中枢神経系(CNS)全体に見られ、NOX由来のROSは神経細胞の発達に寄与する3、4、5、6。神経幹細胞の維持と分化、神経極性の確立、神経突起伸長、およびシナプス可塑性は、ROS7、8、9、10、11の十分なレベルを必要とすることが示されている。一方、NOXesによるROSの制御不能な産生は、アルツハイマー病、多発性硬化症、および外傷性脳損傷12、13、14を含む神経変性疾患に寄与する。したがって、生理学的に関連するROSの産生は、健康な状態を維持するために重要である。
遺伝子組み換えバイオセンサーの開発は、細胞ROSの検出を大いに促進した。遺伝子組み換えバイオセンサーの重要な利点の1つは、ROS信号の時間的および空間分解能の増加であり、これらのセンサーは特異的に異なる場所を標的とすることができる。レドックス感受性GFP(roGFP)は、ROSバイオセンサーのような一種である。roGFP2-Orp1変異体は、特にそのOrp1ドメインを介してH2O2を検出し、これは酵母15、16由来のグルタチオンペルオキシレドキシンファミリータンパク質である。Orp1タンパク質の酸化は、その立体構造を変化させるためにroGFP2に移される(図1A)。このプローブは、405 nmおよび480 nm付近の2つの励起ピークと、515 nmの単一の放出ピークを示す。酸化すると、励起ピーク周辺の蛍光強度が変化する:405nm励起が増加する一方で、480nmの励起は減少する。従って、roGFP2-Orp1は、レシオメトリックバイオセンサであり、H2O2-レベルは、2つの異なる波長で励起された蛍光強度の比によって検出される(図1B)。全体的に見て、roGFP2-Orp1は、インビボで効率的に利用することができるROSイメージング用の汎用性の高いツールです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig01.jpg"> 図1: roGFP2-Orp1の模式的表現と励起スペクトル(A)は、H2O2に応答してOrp1とroGFP2の間で酸化伝達が起こり、roGFP2の立体構造変化をもたらす。(B)roGFP2-Orp1の励起スペクトルは、405 nmおよび480 nmの2つの励起ピークと515 nmの単一放出ピークを示す。H2O2による酸化の際、405nm励起は増加し、480nm励起は減少する。この結果、H2 O2の比率の読み出しが得られます。この数字は、ビランとベロウソフ(2017)16とモルガンら(2011)25から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
Danio rerio(ゼブラフィッシュ)モデルシステムは、遺伝的にコード化されたバイオセンサーを適用するためのいくつかの利点を有する。胚および幼虫の光学的透明性は、生体内での非侵襲的なイメージングを可能にする。新しいイメージングツールは、より高い解像度と深い浸透を達成するために開発されています17.さらに、遺伝子操作(異所性mRNA発現、Tol2トランスジェネシス等)やゲノム編集(タレンス、CRISPR/Cas9等)の樹立されたツールがあり、トランスジェニック動物18の生成を促進する。ゼブラフィッシュの胚が母親の外で発達するにつれて、このシステムはさらに胚の容易なアクセスおよび操作を可能にする。例えば、1細胞段階の注射や薬物治療は簡単に行うことができます。
ここでは、ゼブラフィッシュを用いて、生体転写mRNAを注入してH2O2特異的バイオセンサーroGFP2-Orp1を一時的に発現させた。これらの胚は、培養ニューロンのインビトロイメージングとインビボイメージングの両方に使用することができる(図2)。ゼブラフィッシュ胚からの解剖およびメッキのレチナル神経節細胞(RGC)のプロトコルを説明し、続いて培養ニューロンにおけるH2O2-レベルを評価する。次に、共焦点顕微鏡を用いてroGFP2-Orp1発現胚および幼虫のインビボイメージング法を提示する。このアプローチは、生理学的なH2O2-レベルを決定するだけでなく、異なる発達段階または条件で起こる潜在的な変化を決定することを可能にする。全体として、このシステムは、生きた細胞および動物におけるH2O2を検出するための信頼できる方法を提供し、H2O2の発達、健康および疾患における役割を研究する。 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig03.jpg"> 図 2.実験アプローチの概要簡単に言えば、胚採取後、roGFP2-Orp1 mRNAを、ゼブラフィッシュ胚の1細胞期の黄身に注入する。現像胚は、インビトロ(A)および(B)インビボイメージングの両方に使用することができる。(A) GFP陽性胚は、34 hpfでのRGC採取のためのレティナを解剖するために使用される。解約されたRGCは、ZFCM(+)メディアのPDL/ラミニンコーティングカバーリップにメッキされています。成長コーンイメージングは、GMCが6〜24時間のめっき後に軸索を延長するにつれて行うことができる。細胞は、H2O2-レベルにおける潜在的変化を測定するために異なる治療を施すことができる。ここでは、RGCの成長コーンにおけるH2O2-レベル(赤色)を測定した。(B)GFP陽性胚は生体内イメージングに使用される。望ましい年齢で、胚は共焦点のイメージ投射のための35のmmガラスの底の皿に麻酔され、取付けることができる。ここでは、胚は、画像の再生のために腹孔に取り付けられている。概略図はゼブラフィッシュのレチナルの発達を示す。GGCは、残膜の最も内側の層であるガングリオン細胞層(GCL)を形成する。RGC軸索は、正中線を横切るために視神経に発達し、視神経を形成する。その後、RGC軸索は、中脳の視状体でシナプスを作るためにドーサリーに成長する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62165/62165fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>35 mm培養ディッシュ</td><td>Sarstedt</td><td>83-3900</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ガラス底ディッシュ</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス 毛細管</td><td>サッター/フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NC9029378</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>コーニング</td><td>2850-22</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てペトリ皿(100 x 15 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-094</td><td></td></tr>胎児ウ<tr><td>シ血清</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>26140087</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマアルディッチ</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマアルディッチ</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>射出成形適応</td><td>科学ツール</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>ライボビッツのL-15メディウムとフェノールレッド</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>11-415-064</td><td></td></tr><tr><td>ライボビッツのL-15メディウム フェノールレッドなし</td><td>Gibco/FisherScientific</td><td>21-083-027</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 転写キット</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone/Fisher Scientific</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>シグマアルディッチ</td><td>P0290</td><td></td></tr>フェ<tr><td>ニルチオ尿素(PTU)</td><td>シグマアルディッチ</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>空気圧ピコポンプ</td><td>ワールド精密機器</td><td>PV820</td><td></td></tr>ポリ<tr><td>-D-リジン(PDL)</td><td>シグマアルディッチ</td><td>P7280QiaQUICKPCR</td><td></td></tr><tr><td>精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr>組<tr><td>換えマウススリット2</td><td>R&Dシステム</td><td>5444-SL-050</td><td></td></tr>ピル<tr><td>ビン酸ナトリウム</td><td>シグマアルディッチ</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>ステリトップ0.22&マイクロ;m フィルター</td><td>ミリポア</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>TE バッファー</td><td>アンビオン</td><td>AM9860</td><td></td></tr><tr><td>トリカイン メタンスルホン酸</td><td>シグマ アルディッチ</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>縦型ピペットプーラー</td><td>デビッド・コップフ インスツルメンツ</td><td>700C</td><td></td></tr></tbody></table>

ニューロン開発中のrosライブ細胞イメージング

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

活性酸素種(ROS)は、正常な発達、恒常性、生理学において重要なシグナル伝達分子として確立されています。異なるROSの中で、過酸化水素(H2O2)は、細胞シグナル伝達における役割に関して最もよく特徴づけられる。H2O2は、いくつかの種の発達中に関与している。例えば、H2O2の一過性の増加は、受精後の最初の日の間にゼブラフィッシュ胚で検出された。さらに、重要な細胞H2O2源を枯渇させることは、NADPHオキシダーゼ(NOX)、生体内およびインビトロの両方で分化、軸索成長、およびレチナルガングリオン細胞(RGC)の誘導などの神経系の発達を損なう。ここでは、遺伝的にコードされたH2O2特異的バイオセンサーroGFP2-Orp1を用いて、開発中に培養されたゼブラフィッシュニューロンおよび全幼虫における細胞内H2O2レベルをイメージングする方法について説明する。このプローブは、ゼブラフィッシュの幼虫で一過性または安定して発現することができる。さらに、レシオメトリック読み出しは、遺伝子発現の差異や体積効果によるアーチファクトの検出の確率を低下させます。まず、roGFP2-Orp1を一過性発現するゼブラフィッシュ胚由来のRGCを単離し、培養する方法を示す。次に、幼虫全体を使用して、組織レベルでH2O2レベルを監視します。センサーは、H2O2の追加によって検証されています。さらに、この方法論は、組織特異的バイオセンサー発現を有するトランスジェニック動物を生成することによって、特定の細胞タイプおよび組織におけるH2O2レベルを測定するために使用することができる。ゼブラフィッシュが遺伝的および発達的操作を促進するにつれて、ここで実証されたアプローチは、脊椎動物における神経および一般的な胚発生中のH2O2の役割をテストするパイプラインとして役立つ可能性がある。

培養ゼブラフィッシュRGCは1d以内に軸索を伸ばす。H2O2-バイオセンサの代表的な405/480比画像を図4Aに示す。細胞体、軸索、および成長コーンは、個々のニューロンではっきりと見えます。これらのニューロンは、H2O2変化を監視するために時間の経過とともに異なる治療を受けることができる。以前は、培養メディアに100μMH2O2を加えると比率値が増加し、このシステム(図4)24でリアルタイムの変化を検出できることを示すことがわかりました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62165/62165fig04.jpg"> <strong...

このプロトコルは、神経系の発達中にH2O2の生理的シグナル伝達役割を評価するための培養ゼブラフィッシュニューロンおよび幼虫における遺伝的にコードされた過酸化水素(H2O2)バイオセンサーの使用を記述する。それは、異なる細胞タイプに適用し、一般的な開発で活性酸素種(ROS)を研究するために実験的な治療で変更することができます。

ニューロン開発中のROSライブ細胞イメージング

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

我々のプロトコルは、培養ゼブラフィッシュニューロンおよび幼虫における過酸化水素バイオセンサーの使用を記述する。このプロトコルは、研究者が正常な生理学および病態生理学における活性酸素種の役割を解剖するのに役立つ。この技術の主な利点は、生きている動物および培養細胞における過酸化水素のリアルタイム検出である。この方法は、げっ歯類モデルシステムのような他の動物に適用することができます。カバーリップを調製するには、100%エタノールに保存された酸洗浄カバーリップを使用してください。鉗子を使用して貯蔵容器からカバースリップを1つ取り除き、それを炎にして残留エタノールを取り除きます。35ミリメートルの培養皿の中に角度を付けてカバースリップを完全に乾燥させます。ポリ-D-リジンまたはPDL、または作業ソリューションを準備します。PDLを各カバースリップの中央に適用し、溶液が端に広がらないようにし、室温で20〜30分間PDLをインキュベートします。PDLが乾燥していないことを確認します。PDLを0.5ミリリットルの無菌水で洗い、プレートを完全に乾燥させます。ラミニン作業溶液を準備します。そして、各カバースリップの中心にそれを適用し、エッジへの溶液の拡散を避けるようにしてください。加湿インキュベーターで37°Cでプレートを2〜6時間インキュベートし、ラミニン溶液の乾燥を避けます。プレートのレチナル神経節細胞またはRGCで胚解剖を行うために、35ミリメートルの組織培養皿を4個用意してラベル付けし、70%エタノールの4ミリリットルで満たします。E2 メディア 1.E2 メディア 2.そしてE2メディア3は、解剖の日に。食器を冷蔵庫に入れておきなさい。ゼブラフィッシュ胚が受精後34時間である場合、ラミニンでコーティングされた培養皿を培養器から取り出す。そして、カバースリップを0.5ミリリットルの1X PBSで3回洗います。最後の洗浄後、各培養皿に4ミリリットルのZFCM+培地を加えます。プレートの乾燥は避けてください。調理した冷蔵培養料理を取り出し、室温に平衡させます。15マイクロリットルのZFCM+培地で4~6個のPCRチューブを充填します。インキュベーターからゼブラフィッシュ胚を取り出し、70%エタノールを含む35ミリメートルの組織培養皿に胚を5〜10秒間浸漬して殺菌する。ピペットの移入を用いて、胚をE2培地1皿に移し、無菌E2培地を含有して過剰なエタノールを洗い流す。その後、胚をE2培地2皿に移し、鋭利な鉗子でそれらの色素を取り除く。最後に、胚をE2培地3皿に移し、切り出しを行う。一対の細かい鉗子を使用して、鉗子の1つで卵黄に前から胚を配置し、保持する。そして、他の鉗子と黄身嚢に尾後部を取り外します。鉗子で首をつかみ、脳と目をE2メディアに露出させるために頭を外します。細かい鉗子の先端で、頭蓋組織を第2鉗子で下に押さえながら、頭から目をそっと転がします。ZFCM+穏やかにp20ピペットで上下にトリチュレートして細胞の解体を解除するために、ZFCM+を含む以前に調製されたチューブの1つに4つの目を移します。解約セルを使用して ZFCM+をカバーリップの中心に移動します。振動を吸収するためにポリスチレンフォームラックの22°Cでベンチトップの培養を維持します。イメージングの日に、RGC軸索の成長を検証するために顕微鏡下の細胞をチェックしてください。生細胞イメージングの場合、培養皿から生細胞イメージングチャンバにカバーリップを移します。DICの目的OG-590ロングパスレッドフィルターとEMCCDカメラを搭載した反転顕微鏡を使用してください。イメージングの前に、ZFCM+培地をZFCM-10X目的で細胞を配置した後に置き換え、油浸し目的を使用して60倍の倍率で画像を取得します。追加の 1.5 倍の倍率を使用します。まずDIC画像を取得します。そして、画像roGFP2-Orp1は、適当なフィルタセットを用いた。最初の画像セットを撮った後、異なる治療溶液を含むメディアとメディアを交換します。pHおよび浸透性の変化を避けるために、イメージングの30分ごとにメディアを交換する必要があります。インビボイメージングの場合、メチレンブルーなしで0.003%フェニルチオ尿を含むE3培地で22〜24時間受精後胚を保持する。メディアを交換し、毎日死んだ胚を取り除きます。所望の年齢で、35ミリメートルガラス底培養皿に1%アガロースで胚を麻酔し、取り付ける。胚は、画像化の対象領域に応じて、後方、腹側、または横方向に向けることができる。アガロースが固まった後、メチレンブルーなしでE3培地で皿を満たすが、0.016%トリカインで。イメージング用の顕微鏡を設置します。逆レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して、アガロースドロップの底に取り付けられた胚を画像化します。roGFP2-Orp1を励起し、所望のエミッションフィルターで対応する画像を取得する。胚の所望の部分を通して5マイクロメートルのセクション厚さのzスタックを獲得する。イメージング後、微細な鉗子でアガロースから胚を取り除き、必要な年齢になるまでフェニルチオ尿素を用いてインキュベーターおよびメチレンブルーフリー培地に保管します。過酸化水素バイオセンサーおよび培養ゼブラフィッシュRGC拡張軸索の代表的な画像をここに示す。細胞体、軸索、および成長コーンは、個々のニューロンではっきりと見えます。培養媒体に過酸化水素を添加すると比値が増加し、この系でリアルタイム変化を検出できることを示す。過酸化水素レベルの定量は、ゼブラフィッシュ胚全体の過酸化水素レベルを決定 B.To パネルに示され、mRNAを1つの細胞段階で注入し、すべての組織がroGFP2-Orp1バイオセンサーを発現させる。ゼブラフィッシュ幼虫の頭部領域は、2つの異なる時点で示され、レチナの過酸化水素レベルに焦点を当てています。受精後2日および受精後5日間のゼブラフィッシュ胚中の過酸化水素の基底レベルを測定した。受精後2日で、受精後5日に比値が有意に低かった。さらに、各動物は、その過酸化水素含有量の異なるレベルの増加を示した。目を取り除く細かい鉗子を使用し、ピペットと目の穏やかな解離は、この手順で最も重要なステップです。このプロトコルは、ROSシグナル伝達に関与する因子を調査するために薬物治療を続けることができる。

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神経科学

オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およびペルオキシソームに適合させることができます。...

初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の生体内で個々の神経細胞や神経堤細胞のイメージングを説明します。このメソッドは、蛍光共焦点タイムラプス顕微鏡を使用して細胞の行動とアクチンの局在を調べるために使用されます。...

細胞運動やゼブラフィッシュ胚における個々の神経細胞と神経堤細胞のアクチン細胞骨格のライブイメージング

リアルタイムでイメージング胚組織では、長期間にわたって挑戦されています。ここでは、高い空間分解能と時間分解能で長時間ニワトリ脊髄の細胞とサブ細胞の変化を監視するためのアッセイを示す。この手法は、神経系や胚の他の地域に適応することができます。...

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

ここでは、のために必要なツールを開発...

ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

このビデオでは、roGFP2-Orp1バイオセンサーとライブセルイメージング技術を使用して、網膜神経節細胞の過酸化水素レベルをリアルタイムで検出する技術を示しています。本稿では、細胞調製、蛍光イメージング、過酸化水素レベルの定量化に関与するステップを概説しています。...

生細胞蛍光イメージングによる培養ニューロンの過酸化水素濃度の検出

出典:Gómez-Villafuertes, R., et.., ライブイメージングとそれに続くシングルセルトラッキングにより、細胞生物学と複数の神経集団の系統進行をモニタリングします。J. Vis. Exp. (2017)...

成体神経幹細胞の神経系統をモニタリングするためのライブイメージングとシングルセルトラッキング

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

ライブ画像は、リアルタイムで携帯電話の行動を研究するための強力なツールです。ここでは、タイムラプス...

2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

ソフトウェア ベースの後処理に続いてタイムラプス ビデオ顕微鏡による神経の人口を監視するための堅牢なプロトコルを説明します。このメソッドは、ライブ...

ライブ イメージング モニター細胞生物学および複数の神経集団の血統で、進行を追跡 1 つのセルに続いて

神経幹/前駆細胞は、細胞イベントの異なる結果につながるノッチシグナル伝達成分の様々な発現ダイナミクスを示す。このような動的発現は、遺伝子発現の急速な変化の可視化を可能にする高感度生物発光イメージングシステムを用いて、静的解析ではなくリアルタイムモニタリングによって明らかにすることができる。...

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

ここでは、出生後のマウス網膜外植体における神経突起形態形成をタイムラプス共焦点顕微鏡により調べる方法を提示する。我々は、膜標的蛍光タンパク質を Cre依存的に発現する組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた網膜細胞型の疎標識および取得およびそれらの微細プロセスのためのアプローチを説明する。...

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

学ぶ ゼブラフィッシュ神経細胞と幼生における過酸化水素のライブイメージング法。roGFP2-Orp1バイオセンサーを用いて活性酸素種の動態をリアルタイムで検出し、神経発生と胚発生におけるROSシグナリングを解明する。

ニューロン開発中のROSライブ細胞イメージング

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